Name: Reprogrammierungsmodell von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen für In-vitro-Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Reprogrammierung humaner Monozyten-abgeleiteter Makrophagen für In-vitro-Assays. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Makrophagen-Plastizität und Polarisierung unter standardisierten Bedingungen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der Nationalen Agentur für die Förderung von Wissenschaft und Technologie (ANPCyT-FONCYT) durch die Zuschüsse PICT 2018-3070 und 2021-I-A-00807 an E.A.C.S. und PICT 2021-I-A-00716 an A.E.E., und vom Nationalen Rat für wissenschaftliche und technische Forschung (CONICET) durch das Stipendium PIP 2022-0763 und von der Universität Buenos Aires durch Proyectos de Investigación y Desarrollo en Áreas Estratégicas con Impacto Social (PIDAE) 2022 an A.E.E., E.A.C.S. und A.E.E. sind Karriereforscher bei CONICET.

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<li>Gattas, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterotypic+tridimensional+model+to+study+the+interaction+of+macrophages+and+glioblastoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro.</a> Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).</li>
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<li>Rigamonti, E., Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+macrophage+functions+by+PPAR-alpha%2C+PPAR-gamma%2C+and+LXRS+in+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of macrophage functions by PPAR-alpha, PPAR-gamma, and LXRS in mice and men.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (6), 1050-1059 (2008).</li>
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<li>Sudan, B., Wacker, M. A., Wilson, M. E., Graff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+identify+markers+of+distinctly+activated+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to identify markers of distinctly activated human macrophages.</a> Front Immunol. 6, 253(2015).</li>
<li>Martinez, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+programs+expressed+in+resting+and+IL-4+alternatively+activated+mouse+and+human+macrophages%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences.</a> Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).</li>
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<li>Covarrubias, A. J., Aksoylar, H. I., Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+macrophage+metabolism+and+activation+by+mTOR+and+Akt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Control of macrophage metabolism and activation by mTOR and Akt signaling.</a> Semin Immunol. 27 (4), 286-296 (2015).</li>
<li>Shahbazian, D., Parsyan, A., Petroulakis, E., Hershey, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eif4b+controls+survival+and+proliferation+and+is+regulated+by+proto-oncogenic+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Eif4b controls survival and proliferation and is regulated by proto-oncogenic signaling pathways.</a> Cell Cycle. 9 (20), 4106-4109 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Differenzierung, Aktivierung und Polarisation von Makrophagen sind zu einem zentralen Schwerpunkt in der Immunologie, der Gewebehomöostase, der Krankheitspathogenese und der Entzündungsauflösung geworden. Darüber hinaus unterstreicht das sich abzeichnende Bild, dass Gewebemakrophagen aus zirkulierenden Monozyten unter Bedingungen einer gestörten Homöostase abgeleitet werden können, die Notwendigkeit präziser M-DM-Modelle, die durch definierte Phänotypen, Transkriptionsprogramme und Aktivierungswege gekennzeichnet sin...

Makrophagen, die zuerst von Metchnikoff für ihre phagozytäre Fähigkeit identifiziert wurden, sind uralte Zellen, die für das Leben der Metazoen von grundlegender Bedeutung sind. Sie kommen allgegenwärtig bei erwachsenen Säugetieren vor und weisen eine bemerkenswerte anatomische und funktionelle Vielfalt auf. Als Teil des mononukleären phagozytischen Systems spielen Makrophagen neben dendritischen Zellen und Monozyten eine entscheidende Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen, von der Entwicklung und Homöostase bis hin zur Immunantwort gegen Krankheitserreger1,2. Residente Makrophagen, die auf ihre Gewebemikroumgebungen spezialisiert sind, fungieren als Wächter, überwachen die Gesundheit des Gewebes und reagieren auf physiologische Veränderungen und äußere Bedrohungen. Es wird angenommen, dass ihre begrenzte Plastizität eine evolutionäre Anpassung ist, um die Homöostase des Gewebes aufrechtzuerhalten. Im Gegensatz dazu sind rekrutierte Monozyten flexibler und können sich während einer Entzündung in verschiedene Makrophagen-Phänotypen differenzieren. Dieser doppelte Einfluss von Entzündung und Gewebenische prägt die funktionelle Diversität von Makrophagen3. So können sich Monozyten-abgeleitete Makrophagen (M-DM) je nach lokalem Gewebemilieu in viele Subtypen differenzieren. Die lokalen Metaboliten, Wachstumsfaktoren, Zytokine und Zell-Zell-Interaktion4,5,6 beschreiben ihre Phänotypen und Funktionen. Darüber hinaus sind Makrophagen wichtige Produzenten von Faktoren, die Entzündungen dämpfen und die Revaskularisation und Gewebereparatur vorantreiben7,8.
Angesichts der Tatsache, dass mindestens drei Hauptwaffen die Polarisation kontrollieren (extrinsische, intrinsische und Gewebeumgebungsbedingungen), sollte die Makrophagenpolarisation als multidimensional betrachtet werden2. Die Haupthindernisse und Fallstricke bei der Beschreibung der Differenzierung und Polarisierung von Makrophagen sind die heterogenen experimentellen Bedingungen in der Literatur und der fehlende Konsens über die Definition von Makrophagenbegriffen in in vitro und in vivo Experimenten9. Nichtsdestotrotz hat eine gewisse Vereinheitlichung der experimentellen Standards für verschiedene experimentelle Szenarien begonnen.
Um das Feld der menschlichen Makrophagen besser zu verstehen, benötigen wir standardisierte und gut definierte In-vitro-Modelle von M-DM, um Differenzierung, Polarisation, Phänotyp und Reprogrammierung sowie spezifische Funktionen zu verknüpfen. Unser Ziel war es, ein standardisiertes in-vitro-Modell von humanen nichtpolarisierten M-DM M0 und zytokinpolarisierten Makrophagen zu erstellen, um die verzerrte Reprogrammierung von M-DM mittels Durchflusszytometrie und real-time PCR zu untersuchen. Obwohl die Polarisation von Makrophagen aufgrund ihrer hohen Plastizität und der Fähigkeit, mehrere Signale aus ihrer Umgebung zu integrieren, ein dynamischer Prozess ist, charakterisierten wir hier die unpolarisierte M-DM (M0) und einige in-vitro Polarisationszustände, als die klassischen pro-inflammatorischen, allgemein auch als M1 bekannten und mit IFNγ und LPS induzierten Zustände. In ähnlicher Weise können die Gewebereparatur- und regulatorischen M2-Makrophagen als M2a definiert werden, wenn sie mit IL-4 induziert werden, und M2c, wenn sie mit Dexamethason oder IL-10 stimuliert werden. Diese polarisierenden Zustände erfassen eine Momentaufnahme des breiten Spektrums des M-DM-Milieus in Zeit und Raum, geben uns aber einige Himmelsrichtungen, um die analytische Karte festzulegen, wo die Testbedingungen zu verorten sind.
Trotz der komplexen und dynamischen Kombination von Oberflächenmarkern und Transkriptionsprogrammen haben wir bei der Analyse von in vitro M-DM festgestellt, dass CD64, CD206, CD163, CD14 und MERTK unpolarisierte M0-Bedingungen von IFNγ/LPS-induziertem M1, IL-4-induziertem M2a und IL-10 oder Dexamethason-induziertem durch Durchflusszytometrie unterscheiden können. Darüber hinaus wurde die IRF1- und CXCL10-Genexpression als spezifisch für IFNγ/LPS-induziertes M1 definiert; IRF4-, CCL22- und TGM2-spezifische Transkripte für IL-4-abgeleitetes M2a; und MERTK-Gen für Dexamethason-abgeleitetes M2c, das zusätzliche Kardinalpunkte setzt, um die verzerrte Reprogrammierung von M-DM zu vergleichen, die mit verschiedenen Stimuli herausgefordert oder sogar mit anderen Zelltypen kokultiviert wurde.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 Maus Anti-Mensch&nbsp; CD206 Antikörper-Klon 15-2</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Kat# 321113; RRID:AB_571874</td><td></td></tr><tr><td>APC Maus Anti-Mensch CD64 Antikörper Klon 10.1</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Kat# 305013; RRID:AB_1595539</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 Ratte Anti-Maus/humaner CD11b Antikörper-Klon M1/70</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Kat# 101226; RRID:AB_830642</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>Cat# 554714</td><td>Fixiermittel/Permeabilisierungskit</td></tr><tr><td>Biotin Anti-Human-MERTK Antikörperklon 590H11G1E3</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Kat# 367616; RRID:AB_2721500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CFX-Connect Ausrüstung&nbsp;</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep CD14 Positives Auswahlkit für den Menschen; EasySep Positiver Auswahl-Cocktail; EasySep magnetische Nanopartikel; Easy Sep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada</td><td>Cat# 18058</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto Zytometer&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, Vereinigte Staaten von Amerika.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, qualifiziert, Neuseeland&nbsp;</td><td>Gibco&Handel; &nbsp; Thermo Fisher Scientific Waltham, MA USA&nbsp;</td><td>Kat# 10091148</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS Cytiva</td><td>GE Healthcare - Life Sciences, USA</td><td>Kat# 17144003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC.</td><td>RRID:SCR_008520</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma&nbsp; &nbsp;</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td>RRID:SCR_002798</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA-Synthesekit, enthält 5x Reverse-Transkriptionsreaktionsmix, iScript Reverse Transkriptase, nukleasefreies Wasser</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td><td>Cat# 1708891</td><td></td></tr><tr><td>Partec CyFlow Raumzytometer&nbsp;</td><td>Sysmex Partec, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Streptavidin</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Cat# 405203</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 Maus Anti-Mensch CD14 Antikörper Klon HCD14</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Kat# 325618; RRID:AB_830691</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 Maus Anti-Human-CD163 Antikörper-Klon GHI/61</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Katze# 333607; RRID:AB_1134006</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco&trade; &nbsp; Thermo Fisher Scientific Waltham, MA USA&nbsp;</td><td>Cat# 11875119</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, enthält Antikörper-vermitteltes Hotstart-Sso7d fusi&oakute; n Polymerase, dNTPs, MgCl2, SYBR Green I Farbstoff, Verstärker, Stabilisatoren und eine Mischung aus passiven Referenzfarbstoffen (einschließlich ROX und Fluorescein).</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td><td>Cat# 1725271</td><td></td></tr><tr><td>TriZol Reagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific Life Sciences Solutions Carlsbad, CA, USA&nbsp;</td><td>Katze#&nbsp; 15596026</td><td>RNA-Extraktionsreagenz</td></tr><tr><td>Zombie Violet Fixable Viability Kit</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Katze# 423113</td><td></td></tr></tbody></table>

reprogrammierungsmodell von humanen monozyten-abgeleiteten makrophagen für in-vitro-assays

Reprograming Model of Human Monocyte-derived Macrophages for In-vitro Assays

Zellen der Monozyten-Makrophagen-Linie sind multifunktional und kommen in fast allen Körpergeweben vor. Sie koordinieren die Initiierungs- und Auflösungsphasen der angeborenen und adaptiven Immunität und beeinflussen die schützende Immunität und die immunvermittelte pathologische Schädigung erheblich. Während geweberesidente Makrophagen eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase in einem stationären Zustand spielen, werden große Mengen an Monozyten aus dem peripheren Blut in das Gewebe rekrutiert, nachdem sie geschädigt oder entzündlich beleidigt wurden. Monozyten-abgeleitete Makrophagen (M-DM) können sich in viele dynamische Subtypen differenzieren, und ihre Phänotypen und Funktionen hängen von der lokalen Gewebeumgebung ab. 
Um verschiedene Stimuli oder Umweltbedingungen während der M-DM-Differenzierung und Polarisation zu vergleichen, haben wir ein in-vitro-Modell von humanem nichtpolarisiertem M-DM M0 und einigen kardinalen Zytokin-polarisierten Makrophagen, IFNγ/LPS-abgeleitetem M1, IL-4-abgeleitetem M2a und IL-10 oder Dexamethason-abgeleitetem M2c standardisiert, um die verzerrte Reprogrammierung von M-DM durch Durchflusszytometrie und real-time PCR zu analysieren. Wir fanden heraus, dass CD64, CD206, CD163, CD14 und MERTK mittels Durchflusszytometrie unpolarisiertes M0 und polarisiertes M1, M2a und M2c eindeutig unterscheiden können. Darüber hinaus definierten wir IRF1 und CXCL10 als spezifische Gene für klassische IFNγ/LPS-abgeleitete M1-, IRF4-, CCL22- und TGM2-spezifische Transkripte für IL-4-abgeleitetes M2a und das MERTK-Gen für Dexamethason-abgeleitetes M2c. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser standardisiertes M-DM-Protokoll die kardinale in-vitro-Karte liefern könnte, um die Differenzierung und Polarisation von humanem M-DM unter verschiedenen Stimuli zu analysieren.

Basierend auf unserer mehrjährigen Arbeit zur Charakterisierung von Makrophagen haben wir eine genaue Kombination von Markern festgelegt, die die verschiedenen Subpopulationen von in-vitro M-DM eindeutig unterscheidet. Die Phänotyp-Marker wurden anhand der Literatur und einer umfassenden früheren Untersuchung ausgewählt, die wir zuvor durchgeführt hatten9,14,15,16,<sup class...

Monozyten und Makrophagen sind sehr plastische und reprogrammierbare Immunzellen, die für Gesundheit und Krankheit entscheidend sind. Sie spüren und reagieren auf ein breites Spektrum von Reizen, indem sie spezifische Differenzierungsprogramme und Phänotypen übernehmen. Wir haben ein In-vitro-Modell standardisiert, um die Polarisation und Reprogrammierung von Makrophagen zu untersuchen, was ein wertvolles Werkzeug für die Forschung darstellt.

Reprogrammierungsmodell von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen für In-vitro-Assays

Cells of the monocyte-macrophage lineage are multifunctional and found in almost all body tissues. They coordinate innate and adaptive immunity&#180;s ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video demonstrieren wir den Efferozytose-Assay, um die Clearance apoptotischer Zellen mittels konfokaler Mikroskopie zu untersuchen. Die Efferozytose ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem apoptotische Zellen von Fresszellen verschlungen und in Vesikel, den sogenannten Efferosomen, abgebaut werden. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Visualisierung internalisierter und nicht-internalisierter Teile einzelner apoptotischer Zellen und zur Quantifizierung der Efferozytose.

Fixierter Zell-Efferozytose-Assay: Eine Methode zur Untersuchung der efferozytären Aufnahme apoptotischer Zellen durch Makrophagen mittels Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Video zeigt das Priming von primären Monozyten in Makrophagen. Primäre humane Monozyten können isoliert und unter Verwendung des Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-CSF) zu einem M1-ähnlichen proinflammatorischen Phänotyp oder unter Verwendung des Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (M-CSF) zu einem M2-ähnlichen entzündungshemmenden Phänotyp differenziert werden.

In vitro Kultur und Differenzierung von primären Monozyten zu Makrophagen

Dieses Video zeigt die Aktivierung von Caspase-Proteinen in menschlichen Makrophagen unter Verwendung von bimolekularen Fluoreszenz-Komplementations-Reporterproteinen. Die Pro-Domänen von Caspase-1 sind mit nicht-fluoreszierenden Fragmenten von Venusproteinen fusioniert, die zu Inflammasom-Komplexen rekrutiert werden. Die Nähe von Inflammasomen induziert die Rückfaltung und Fluoreszenz von Venusfragmenten, was die Caspase-Aktivierung in den Makrophagen bestätigt.

Visualisierung der Caspase-Aktivierung in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Monozyten abgeleiteten Makrophagen sind wichtige Zellen des angeborenen Immunsystems. Hier beschreiben wir eine einfach zu...

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Wir stellen ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung von menschlichen Makrophagen. Buffy Coats werden durch Doppel Dichtegradientenzentrifugation isoliert verarbeitet und Monozyten werden dann an Makrophagen in Teflon-beschichtete Zellkulturbeutel differenziert. Dies maximiert Makrophagen-Renditen und erleichtert die Zellernte für nachfolgende Experimente.

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Es wird ein Protokoll für die Zellkultur von Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen vorgestellt. Das Protokoll nutzt die Kryokonservierung von Monozyten in Verbindung mit ihrer Massendifferenzierung in Makrophagen. Dann können geerntete Makrophagen in Kulturvertiefungen mit den erforderlichen Zelldichten für die Durchführung von Experimenten ausgesät werden.

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

Hier wird ein Protokoll zum Nachweis der Produktion extrazellulärer Makrophagen (MET) in der Lebendzellkultur mittels Mikroskopie und Fluoreszenzfärbung vorgestellt. Dieses Protokoll kann weiter erweitert werden, um spezifische MET-Proteinmarker durch Immunfluoreszenzfärbung zu untersuchen.

In Vitro Stimulation und Visualisierung der extrazellulären Trap-Freisetzung in differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Dieses Protokoll beschreibt die robuste Erzeugung von Makrophagen aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und Methoden für deren anschließende Charakterisierung. Zelloberflächenmarkerexpression, Genexpression und funktionelle Assays werden verwendet, um den Phänotyp und die Funktion dieser iPSC-abgeleiteten Makrophagen zu bewerten.

Produktion und Charakterisierung menschlicher Makrophagen aus pluripotenten Stammzellen

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Bewertung des immunmodulatorischen Potenzials von Implantatoberflächen in vitro vor, um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit aktueller Protokolle zu verbessern und die weitere Forschung zu fördern. Sekretorische Zytokinprofile, mRNA-Expression und Zelloberflächenmarker wurden mit Hilfe von Blutmonozyten-abgeleiteten Makrophagen überwacht, um die Makrophagenpolarisation auf Titan zu untersuchen.

Polarisation und Charakterisierung von M1- und M2-humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen auf Implantatoberflächen 

Angesichts der begrenzten Xenotransplantat-Modelle, die zur Untersuchung von Interaktionen zwischen humanen CART- und myeloischen Zellen zur Verfügung stehen, haben wir in vitro und in vivo Modelle etabliert, um die Auswirkungen menschlicher Makrophagen auf CART-Zellen zu verstehen. Die Ergebnisse können möglicherweise verallgemeinert werden, um die Rolle von Makrophagen in der Tumormikroumgebung zu bewerten und Makrophagen-gezielte Immuntherapien zu testen.

Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen myeloischen Zellen und CAR-T-Zellen in vitro und in vivo

Erfahren Sie die Reprogrammierung humaner Monozyten-abgeleiteter Makrophagen für In-vitro-Assays. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Makrophagen-Plastizität und Polarisierung unter standardisierten Bedingungen.

Reprogrammierungsmodell von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen für In-vitro-Assays

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