Reprogrammierungsmodell von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen für In-vitro-Assays

Unsere Forschung untersuchte die Abstammung von Monozyten und Makrophagen und betonte ihre bemerkenswerte Plastizität und Fähigkeit, mehrere Signale aus der Umgebung zu integrieren, um die Effektorreaktion bei Entzündungen, Gewebereparaturen und Infektionen zu beeinflussen. Makrophagen sind im ganzen Körper zu finden und koordinieren die Initiierung und Auflösung der angeborenen und angepassten Immunität, die sich auf die geschützte und immunvermittelte Pathologie auswirkt. Die Reprogrammierung von Makrophagen ist das vielversprechendste Merkmal auf diesem Gebiet.

Die aufkommende Omics-Technologie hat unser Verständnis der Makrophagenbiologie revolutioniert und Einblicke in ihre phänotypische Vielfalt, die funktionellen Merkmale, ihr Programmierpotenzial und den Entwicklungsursprung dieser Zellen gegeben. Das Haupthindernis und die Falle bei der Entdeckung der Differenzierung und Polarisierung von Makrophagen sind die heterogenen experimentellen Bedingungen und Protokolle in der Literatur und der fehlende Konsens bei der Definition des Makrophagenbegriffs. Wir demonstrieren den Reprogrammierungseffekt von Wirkstoff- und Lipidmediatoren auf die Makrophagenpolarisation und entwickeln ein 3D-in-vitro-Modell der Interaktion zwischen Makrophagen- und Glioblastomzellen.

Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Blutplättchen die Differenzierung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen an den N1-Phänotyp lizenzieren. Geben Sie zunächst antikoagulierte periphere Blutproben in eine Zentrifuge. Schleudere es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf 200 g.

Beobachten Sie die Trennung von plättchenreichem Plasma oben und der zellulären Fraktion, einschließlich roter und weißer Blutkörperchen, unten. Die aus der ersten Zentrifugation gewonnene Zellfraktion wird mit sterilem, auf Raumtemperatur vorgewärmtem PBS verdünnt. Homogenisieren Sie die Lösung vorsichtig, bevor Sie mit der Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation fortfahren.

15 Milliliter Ficoll-Hypaque in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Geben Sie vorsichtig und langsam 30 Milliliter verdünntes Blut auf das Ficoll, um eine minimale Durchmischung zwischen den Phasen zu gewährleisten. Das Röhrchen mit dem Ficoll und dem verdünnten Blut bei 600 g wird 25 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Entfernen Sie mit einer sterilen Drei-Milliliter-Pasteurpipette einen Teil der gelben Deckschicht. Die Grenzfläche zwischen der gelben Schicht und der Ficoll-Schicht vorsichtig mit einer sterilen Pasteur-Pipette erfassen. Übertragen Sie die gesammelten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen, das mindestens drei Milliliter steriles PBS enthält.

Füllen Sie das Röhrchen mit sterilem PBS auf, um ein Gesamtvolumen von 12 bis 15 Millilitern zu erreichen. Zentrifugieren Sie die Probe dann 10 Minuten lang bei 600 g. Als nächstes drehen Sie die PBMC-Federung fünf Minuten lang bei 300 G bei 8 bis 10 Grad Celsius herunter.

Suspendieren Sie die Zellen in der gewünschten Menge an sterilem kaltem PBS mit 2%FBS. Halten Sie die Zellen bis zum nächsten Schritt bei 4 Grad Celsius. Übertragen Sie das gewünschte Volumen der PBMC-Suspension in ein Fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenröhrchen.

Fügen Sie dann 10 Mikroliter Positiv-Selektionscocktail pro 100 Mikroliter Zellsuspension hinzu. Mischen Sie die Suspension gründlich, bevor Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Pipettieren Sie anschließend 10 Mikroliter magnetische Nanopartikel pro 100 Mikroliter Zellsuspension.

Pipettieren Sie mehr als fünfmal kräftig auf und ab, um eine gleichmäßige Suspension der magnetischen Nanopartikel zu gewährleisten. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur fügen Sie der Suspension PBS mit FBS und EDTA hinzu, um das Gesamtvolumen auf 2,5 Milliliter zu erhöhen. Pipettieren Sie die Zellen zwei- bis dreimal vorsichtig auf und ab.

Setzen Sie das Rohr in den Magnetsortierer ein und lassen Sie es fünf Minuten lang ungestört stehen. Drehen Sie den Magneten zusammen mit dem Rohr in einer kontinuierlichen Bewegung um. Halten Sie den Magneten und das Rohr zwei bis drei Sekunden lang invertiert, bevor Sie sie wieder in eine aufrechte Position bringen.

Nehmen Sie das Röhrchen vom Magneten und geben Sie dann wieder 2,5 Milliliter PBS-FBS-EDTA-Puffer in das Röhrchen. Pipettieren Sie die Zellsuspension zwei- bis dreimal vorsichtig auf und ab, um sie zu mischen. Setzen Sie das Rohr wieder in den Magneten ein und stellen Sie es fünf Minuten lang auseinander.

Drehen Sie den Magneten und das Rohr in einer kontinuierlichen Bewegung wieder um und verwerfen Sie die überstehende Fraktion. Entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten und suspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen PBS-FBS ohne EDTA. Die positiv selektierten Zellen sind nun einsatzbereit.

Geben Sie nun PBS-FBS-Puffer zu den sortierten CD14-Zellen, so dass das Gesamtvolumen 12 bis 14 Milliliter beträgt, um das verbleibende EDTA zu verdünnen. 10 Minuten bei 600 g zentrifugieren. Nach dem Verwerfen des Überstands werden die positiv ausgewählten CD14-Monozyten in zwei Millilitern PBS-FBS-Puffer erneut suspendiert.

Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler. Bewahren Sie die Zellen bis zur Kulturvorbereitung auf Eis auf. Für die Kultivierung resuspendieren Sie das Pellet in einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter in zugesetztem RPMI 1640-Medium.

Pipettieren Sie 250 Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte. Geben Sie 250 Mikroliter mit Antibiotika ergänztes RPMI-Medium mit 50 Nanogramm pro Milliliter Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellkulturplatte in einem befeuchteten Inkubator, um die Makrophagendifferenzierung zu initiieren.

Ersetzen Sie am vierten Tag der Makrophagendifferenzierung die Hälfte des Kulturmediums aus jeder Vertiefung. Fügen Sie Zytokine oder Reagenzien für die gewünschten Polarisationsbedingungen hinzu und setzen Sie die Kultivierung für weitere drei Tage fort. Entnahme der aus Makrophagen gewonnenen Monozyten am siebten Tag zur phänotypischen Charakterisierung.

M1-Makrophagen, die durch Interferon-gamma-plus-Lipopolysaccharid induziert wurden, zeigten die höchste Expression von CD64, das Fehlen von CD206 und niedrige Spiegel von CD163 und MERTK. M2a-Makrophagen, die durch Interleukin 4 induziert wurden, zeichneten sich durch eine erhöhte CD206-Expression und reduzierte CD64-, CD163- und MERTK-Spiegel aus. M2c-Makrophagen, die durch Interleukin 10 oder Dexamethason induziert wurden, zeigten eine erhöhte CD163- und CD14-Expression, intermediäre CD64-Spiegel und eine Erhöhung der MERTK-Expression.