Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, menschliche Makrophagen in hoher Menge und Qualität unter Verwendung standardmäßiger Laborgeräte herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst Blut aus Buffy Coats über einen FI-Rohr-Gradienten zentrifugiert wird, um die PBMCs zu sammeln. Anschließend werden über einen Rohr-Gradienten die Monozyten von den Lymphozyten getrennt.

Anschließend werden die Monozyten in Teflon-beschichteten Zellkultursäcken ausgesät und differenziert. Nach sechs oder sieben Tagen werden die Makrophagen geerntet und für nachfolgende Untersuchungen ausgesät. Die erhaltenen Zellen sollten die typischen Marker reifer Makrophagen exprimieren und auf verschiedene Stimuli reagieren, wie beispielsweise eine Ko-Kultivierung mit Tumorzellen oder eine Stimulation mit LPS. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie Gegenstromzentrifugation, Zentrifugation oder magnetisch aktivierter Zellsortierung besteht darin, dass humane Makrophagen mit Standard-Lip-Ausrüstung erzeugt werden können, ohne aufwändige Reagenzien oder Instrumente zu benötigen.

Obwohl diese Methode einfach durchzuführen ist, könnten Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, die verschiedenen Zellpopulationen in den Dichtegradienten zu visualisieren und zu trennen. Daher wird eine visuelle Demonstration dieser Schritte helfen, diese Schwierigkeiten zu überwinden. Dieses Protokoll wird im Duplikat durchgeführt, um das Ausbalancieren der Rotoren zu erleichtern.

Beginnen Sie mit der Desinfektion von zwei Beuteln der Buffy-Coat-Fraktion aus geschichtetem Blut. Anschließend überführen Sie die Buffy Coats in jeweils zwei 50-Milliliter-Röhrchen pro Buffy Coat. Bereiten Sie drei 50-Milliliter-Röhrchen mit jeweils 15 Milliliter FI-Zell-Lösung bei Raumtemperatur mit einer Dichte von 1,077 Gramm pro Milliliter vor.

Nun vorsichtig und langsam 30 bis 35 Milliliter der Trübungsschicht auf jede Tube mit FI-Aufruf schichten. Die Schichten sollten sich nicht vermischen; zentrifugieren Sie diese Tubes 30 Minuten lang bei 400 G, bei Raumtemperatur. Zwischen den beiden Phasen bildet sich ein weißer Ring aus peripheren mononukleären Blutzellen.

Entfernen Sie diese Schichten mit einer Plastikpipette. Vereinigen Sie die Schichten der drei Röhrchen jedes Spenders in zwei 50-Milliliter-Röhrchen pro Spender. Waschen Sie die gesammelten Zellen, indem Sie eindringlich P-B-S-E-D-T-A bis zur 40-Milliliter-Marke hinzufügen, und zentrifugieren Sie sie anschließend 10 Minuten bei 300 ×g bei Raumtemperatur, ohne dabei das Beschleunigungsprofil zu unterbrechen.

Aspirieren Sie nun und verwerfen Sie die Überstände. Wiederholen Sie dann die Waschung und resuspendieren Sie die Pellets in P-B-S-C-D-T-A. Sammeln Sie die Pellets von jedem Spender und resuspendieren Sie sie in 20 Milliliter RPMI plus FCS ohne Phenolrot. Es sollte nun ein Röhrchen mit Zellen pro Spender vorliegen.

Bereiten Sie nun die zweite Dichtegradientenmischung vor, indem Sie 23,13 Milliliter der percall-Lösung bei Raumtemperatur mit 1,87 Milliliter 10× PBS in einem 50-Milliliter-Röhrchen mischen. Bereiten Sie pro zwei Proben ein Röhrchen der Mischung vor. Überführen Sie anschließend 23 Milliliter der Mischung in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie dann 27 Milliliter RPMI plus FCS mit Phenolrot hinzu. Das Ergebnis ist eine 46 %ige ISO-osmotische Lösung pro Zelle. Überführen Sie nun für jeden Spender 25 Milliliter der 46 %igen Lösung in ein 50-Milliliter-Gefäß und schichten Sie vorsichtig die Zellmischung darauf.

Die beiden Phasen sollten anhand ihrer Farben ohne Unterbrechung unterscheidbar sein. Zentrifugieren Sie die Zellen eine halbe Stunde bei Raumtemperatur und 550 ×g. Ein weißer Ring aus Monozyten sammelt sich zwischen den beiden Phasen an. Sammeln Sie diese Zellen mit einer Plastikpipette in einem 50-Milliliter-Röhrchen.

Waschen Sie die Monozyten mit eintausend Millimolar P-B-S-E-D-T-A, bis zur 50-Milliliter-Marke aufgefüllt. Anschließend zentrifugieren Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 400 ×g, ohne Unterbrechung, entfernen das Überstand und resuspendieren die pelletierten Monozyten in 20 Milliliter Medium. Danach fahren Sie mit dem nächsten Abschnitt fort.

Dieses Protokoll verwendet Kulturbags mit FEP-Teflon-Beschichtung als Kulturkammer. Beginnen Sie mit der Schätzung der Anzahl der gewonnenen Monozyten. Monozyten sind groß und oft unregelmäßig geformt.

Zählen Sie die kleineren Lymphozyten nicht. Wenn 100 bis 150 Millionen Zellen eines Spenders verfügbar sind, bereiten Sie 180 Milliliter supplementiertes RPMI vor. Bei geringerer Zellanzahl bereiten Sie jeweils 30 Milliliter Medium für 30 bis 50 Millionen Zellen vor.

In einem 20 Milliliter umfassenden Aliquot werden die Zellen vorsichtig in die 180 Milliliter vorbereitetes Medium eingemischt. Anschließend wird der Kulturbeutel mit den Zellen unter Verwendung einer 50-Milliliter-Perfu-Spritze, die an den Stopfen des Kulturbeutels angeschlossen ist, befüllt. Danach wird die Spritze entfernt, die verbleibende Luft herausgedrückt und der Stopfen mit einem Kegel verschlossen.

Jetzt die Beutel sechs bis sieben Tage lang mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach sechs bis sieben Tagen Inkubation die Kulturbeutel auf Eis überführen, um die Zellen zu gewinnen; die Beutel vollständig in Eis eintauchen und eine bis drei Stunden lang abkühlen lassen, damit sich die Zellen ablösen. Danach die Beutel vorsichtig etwa 10 Mal über eine Kante ziehen.

Danach die Außenseite der Beutel gründlich desinfizieren. Den Verschlusskegel durch eine 50-Milliliter-Spritze ersetzen. Anschließend die Zellsuspension abziehen und in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführen.

Wenn alle Röhrchen gesammelt sind, zentrifugieren Sie sie 10 Minuten bei 400 ×g bei Raumtemperatur. Saugen Sie nun den Überstand ab und sammeln Sie alle Zellen in 10 Milliliter RPMI plus FCS. Anschließend zählen Sie die Zellen wie zuvor. Zählen Sie nur die Makrophagen, da verbleibende Lymphozyten vorhanden sein können.

Verwenden Sie anschließend die Zellen für die gewünschte Anwendung, um die Kulturbeutel wiederverwenden zu können. Spülen Sie sie zweimal mit 70 % Ethanol. Füllen Sie sie dann mit 50 Milliliter 70 % Ethanol und inkubieren Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag spülen Sie die Beutel dreimal mit steriler PBS.

Dann in Sterilisationspapier einwickeln und autoklavieren. Ein Beutel kann leicht 10-mal die Dichtegradientenzentrifugation wiederverwendet werden. Die Zentrifugation ergibt eine weiße Grenzschicht, die Lymphozyten und Monozyten enthält.

Hier untersuchen wir das erste Dichtegradient. May-Grünwald-Färbung dieser Zellen zeigt sowohl ein hohes Kern-Zytoplasma-Verhältnis, typisch für Lymphozyten, als auch bohnen- oder ringförmige Kerne, typisch für Monozyten.

Diese Färbungen zeigen die Ergebnisse des zweiten Gradienten. Jede Buffy Coat-Fraktion liefert etwa 150 Millionen Monozyten, die in etwa 70 Millionen Makrophagen differenziert werden können. Bei 20 Präparationen entwickelten sich 47 % der Monozyten zu Makrophagen.

Die gereinigten Makrophagen können durch Anheftung an Kunststoffoberflächen weiter angereichert werden, eine Eigenschaft, die von den verunreinigenden Zellen nicht geteilt wird. Nach dem Ansäen zeigen die meisten Makrophagen eine „gebratenes-Ei“-Morphologie, während andere ein gestrecktes, spindelartiges Phänotyp aufweisen. Die Zellen zeichnen sich durch die Expression mehrerer Marker aus.

Typisch für reife Makrophagen. Die Expression von CD11b spricht gegen eine dendritische Differenzierung, ebenso wie das Fehlen der CD209-Expression. Nach der Differenzierung verbleiben die Zellen fünf bis sieben Tage lang funktionell und metabolisch aktiv.

Die Kalzium-Färbung lebender Zellen zeigt ihre Fähigkeit zum Aufnahme rot markierter extrazellulärer Vesikel, die von Tumorzellen abgegeben wurden. Zusätzlich können die Makrophagen aktiviert werden, beispielsweise durch Stimulierung mit Lipopolysaccharid, was zur Expression mehrerer pro-inflammatorischer Gene führt. Nach dieser Prozedur können die isolierten Makrophagen einer breiten Palette funktioneller Assays unterzogen werden, um grundlegende Fragen zur Makrophagenbiologie in Gesundheit und Krankheit zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hohe Zahlen menschlicher Makrophagen erzeugt. Es ist jedoch wichtig, sich bewusst zu machen, dass Sie mit menschlichen Blutproben arbeiten, die potenziell infektiös sein könnten.