Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, humane Makrophagen in hoher Menge und Qualität mit Standard-Laborgeräten zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst Blut aus Buffy-Mänteln auf einem FI-Call-Gradienten zentrifugiert wird, um die P-BMCs cs zu sammeln. Als nächstes werden auf einem Gradienten pro Aufruf die Monozyten von den Lymphozyten getrennt.

Anschließend werden die Monozyten in teflonbeschichtete Zellkulturbeutel ausgesät und differenziert. Nach sechs oder sieben Tagen werden Makrophagen geerntet und für nachfolgende Studien ausgesät. Die erhaltenen Zellen sollten die typischen Marker reifer Makrophagen exprimieren und auf verschiedene Stimuli wie z.B. Co-Kultivierung mit Tumorzellen oder Stimulation mit LPS reagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Gegenstrom, Zentrifugation oder magnetisch aktivierter Zellsortierung besteht darin, dass humane Makrophagen mit Standard-Lippengeräten erzeugt werden können, ohne dass teure Reagenzien oder Instrumente benötigt werden.

Obwohl diese Methode einfach durchzuführen ist, könnten Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, die verschiedenen Zellpopulationen in den Dichtegradienten zu visualisieren und zu trennen. Daher hilft die visuelle Demonstration dieser Schritte, diese Schwierigkeiten zu überwinden. Dieses Protokoll wird doppelt ausgeführt, um das Auswuchten der Rotoren zu erleichtern.

Beginnen Sie mit der Desinfektion von zwei Beuteln der Buffy-Coat-Fraktion aus geschichtetem Blut. Übertragen Sie dann die Buffy Coats auf zwei 50 Milliliter Röhrchen für jeden Buffy Coat. Bereiten Sie drei 50-Milliliter-Röhrchen mit 15 Millilitern FI-Call-Lösung bei Raumtemperatur bei 1,077 Gramm pro Milliliter vor.

Tragen Sie nun langsam und vorsichtig 30 bis 35 Milliliter geschwollenes Fell auf jede Tube FI Call auf. Die Schichten sollten sich nicht vermischen, zentrifugieren Sie diese Röhrchen, ohne eine halbe Stunde lang bei 400 G zu zerbrechen. Bei Raumtemperatur zwischen den beiden Phasen bildet sich ein weißer Ring aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes.

Entfernen Sie diese Schichten mit einer Plastikpipette. Kombinieren Sie die Schichten der drei Röhrchen von jedem Spender zu zwei 50-Milliliter-Röhrchen pro Spender. Waschen Sie die gesammelten Zellen, indem Sie ein Millimolar P-B-S-E-D-T-A bis zur 40-Milliliter-Linie hinzufügen, und zentrifugieren Sie sie dann bei 300 g für 10 Minuten, ohne bei Raumtemperatur zu zerbrechen.

Aspiriere nun die Überstände und verwerfe sie. Wiederholen Sie dann den Waschvorgang und P-B-S-C-D-T-A, resuspendieren und bündeln Sie die Pellets von jedem Donor und 20 Milliliter RPMI plus FCS ohne Phenolrot. Pro Spender sollte nun ein Röhrchen Zellen vorhanden sein.

Bereiten Sie nun den zweiten Dichtegradienten vor: Mischen Sie 23,13 Milliliter Raumtemperatur pro Anruflösung mit 1,87 Millilitern 10 XPBS in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Bereiten Sie ein Röhrchen der Mischung für jeweils zwei Proben vor. Füllen Sie anschließend 23 Milliliter der Mischung in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen um.

Fügen Sie dann 27 Milliliter RPMI plus FCS mit Phenolrot hinzu. Das Ergebnis ist eine osmotische Lösung mit einem ISO-Wert von 46 %. Nun für jeden Spendertransfer 25 Milliliter der 46%igen Lösung in ein 50 Milliliter Röhrchen geben und vorsichtig auf die Zellmischung schichten.

Die beiden Phasen sollten durch ihre Farben ohne Unterbrechung unterscheidbar sein. Zentrifugieren Sie die Zellen eine halbe Stunde lang bei Raumtemperatur und 550 G. Ein weißer Ring aus Monozyten sammelt sich zwischen den beiden Gesichtern. Sammeln Sie diese Zellen mit einer Kunststoffpipette in einem 50-Milliliter-Röhrchen.

Waschen Sie die Monozyten mit einem millimolaren P-B-S-E-D-T-A, das bis zur 50-Milliliter-Marke gefüllt ist. Dann werden sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400 g ohne Bruch zentrifugiert, der Überstand verworfen und die pelletierten Monozyten in 20 Millilitern Medium wieder suspendiert. Fahren Sie dann mit dem nächsten Abschnitt fort.

Bei diesem Protokoll werden FEP-Teflon-beschichtete Kulturbeutel als Kultivierungskammer verwendet. Beginnen Sie mit der Schätzung der Anzahl der gesammelten Monozyten. Monozyten sind groß und oft unregelmäßig geformt.

Zählen Sie nicht die kleineren Lymphozyten. Wenn 100 bis 150 Millionen Zellen eines Spenders verfügbar sind, bereiten Sie 180 Milliliter supplementiertes RPMI vor. Wenn weniger Zellen vorhanden sind, bereiten Sie 30 Milliliter Medium pro 30 bis 50 Millionen Zellen vor.

In einem 20-Milliliter-Aliquot mischen Sie die Zellen vorsichtig in die 180 Milliliter des vorbereiteten Mediums. Beladen Sie dann den Kulturbeutel mit den Zellen mit einer 50 Milliliter Perfu-Spritze, die am Stopfen des Kulturbeutels befestigt ist. Entfernen Sie die Spritze, drücken Sie die restliche Luft heraus und verschließen Sie den Stopfen mit einem Kegel.

Inkubieren Sie die Beutel nun sechs bis sieben Tage lang mit 5 % Kohlendioxid. Nach sechs bis sieben Tagen Inkubation legen Sie die Kulturbeutel auf Eis, um die Zellen zu ernten, tauchen Sie die Beutel vollständig in Eis und lassen Sie sie eine Stunde bis drei Stunden abkühlen, um die Zellen zu lösen. Ziehen Sie die Beutel anschließend ca. 10 Mal vorsichtig über eine Kante.

Desinfizieren Sie dann die Außenseite der Beutel gründlich. Ersetzen Sie den Stopfenkonus durch eine 50-Milliliter-Spritze. Ziehen Sie dann die Zellsuspension heraus und geben Sie sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen.

Wenn alle Röhrchen eingesammelt sind, schleudern Sie sie 10 Minuten lang bei 400 g herunter. Bei Raumtemperatur aspirieren Sie nun den Überstand und bündeln alle Zellen in 10 Milliliter RPMI plus FCS. Zählen Sie dann die Zellen wie zuvor. Zählen Sie nur die Makrophagen, da möglicherweise Restlymphozyten vorhanden sind.

Verwenden Sie dann die Zellen für die gewünschte Anwendung, um die Kulturbeutel wiederzuverwenden. Waschen Sie sie zweimal mit 70% Ethanol. Füllen Sie sie dann mit 50 Millilitern 70%igem Ethanol und inkubieren Sie sie am nächsten Tag über Nacht bei Raumtemperatur, spülen Sie die Beutel dreimal mit sterilem PBS aus.

Wickeln Sie sie dann in Sterilisationspapier ein und autoklavieren Sie sie. Ein Beutel kann problemlos mit dem 10-fachen Dichtegradienten wiederverwendet werden. Zentrifugationen ergeben eine weiße Grenzfläche, die Lymphozyten und Monozyten enthält.

Hier untersuchen wir den ersten Dichtegradienten. May Grunwald. Die Färbung dieser Zellen zeigt sowohl ein hohes Zellkern-Zytoplasma-Verhältnis, das für Lymphozyten typisch ist, als auch bohnen- oder ringförmige Zellkerne, die für Monozyten typisch sind.

Diese Färbungen zeigen die Ergebnisse des zweiten Gradienten. Jede Buffy-Hülle liefert etwa 150 Millionen Monozyten, die in etwa 70 Millionen Makrophagen differenziert werden können. In 20 Präparaten wurden 47% der Monozyten zu Makrophagen.

Die gereinigten Makrophagen können durch das Anhaften an Kunststoffoberflächen weiter angereichert werden, eine Eigenschaft, die von den kontaminierenden Zellen nicht geteilt wird. Einmal plattiert, zeigen die meisten Makrophagen eine Spiegelei-Morphologie, während andere einen gestreckten spindelartigen Phänotyp haben. Die Zellen zeichnen sich durch die Expression mehrerer Marker aus.

Typisch für reife Makrophagen. Die Expression von CD 11 B spricht gegen eine dendritische Differenzierung, ebenso wie das Fehlen der CD 2 0 9-Expression. Nach der Differenzierung bleiben die Zellen für fünf bis sieben Tage funktionell und metabolisch aktiv.

Die Kalziumfärbung lebensfähiger Zellen zeigt ihre Fähigkeit, rot markierte extrazelluläre Vesikel aufzunehmen, die von Tumorzellen abgestoßen werden. Zusätzlich können die Makrophagen aktiviert werden, z.B. führt die Stimulation mit Lipopolysaccharid zur Expression mehrerer entzündungsfördernder Gene. Nach diesem Verfahren können die isolierten Makrophagen einem riesigen Spektrum an funktionellen Assays unterzogen werden, um grundlegende Fragen zur Makrophagenbiologie in Gesundheit und Krankheit zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine hohe Anzahl menschlicher Makrophagen erzeugt. Es ist jedoch wichtig, daran zu denken, dass Sie mit menschlichen Blutproben arbeiten, die potenziell infektiös sein können.