Name: Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Lernen Sie die Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und deren Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen. Diese kostengünstige Methode liefert etwa 70 Millionen Makrophagen pro Buffy Coat.

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Die Autoren bedanken sich bei Frau Meike Schaffrinski für sie immer hervorragende technische Unterstützung während der letzten Jahre bedanken. Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Verbundforschungsgruppe 942 (FOR942) und dem Forschungsprogramm der Medizinischen Fakultät der Georg-August-Universität Göttingen finanziert.

1. Herstellung von sterilen humanem AB-Serum <ol><li> Sammeln Sie 4-5 Beutel gefrorenes Frischplasma (FFP). Shop-Taschen bei -20 ° C bis genügend Taschen gesammelt wurden. </li><li> Auftauen Taschen und Inkubation für 30 min bei 56 ° C in einem Wasserbad auf das Komplement zu inaktivieren und entfernen Fibrin. </li><li> Die Außenseite der Taschen gründlich zu desinfizieren und übertragen das Plasma auf 50-ml-Röhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 3000 × g für 15 min bei Raumtemperatur loswerden Niederschläge und Rest Blutplättchen. </li><li> Bündeln alle Überstände und entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Aliquoten Serumproben in 15-ml-Röhrchen und bei -20 ° C. HINWEIS: Alternativ können kommerziell erhältliche hitzeinaktiviertes normales menschliches AB-Serum verwendet werden. </li></ol> 2. Isolierung von Monozyten Zum Ausgleich der Zentrifuge zu erleichtern, empfiehlt es sich, zwei buffy coats parallel verarbeiten. Allerdings nehmen cawieder getrennte Materialien für jeden Spender zu verwenden und nicht, um die Zellen zu mischen. Im Fall buffy coats nicht leicht erhalten werden kann, kann mit 400 ml heparinisiertem peripheren Blut stattdessen verwendet werden. <ol><li> Sorgfältig desinfizieren Sie die Plastikbeutel mit den Buffy Coats und den Inhalt der einzelnen Buffy-Coat-Transfer zu zwei 50-ml-Röhrchen. </li><li> Für jede Leukozytenmanschette füllen drei 50-ml-Röhrchen mit 15 ml Ficoll-Lösung (1,077 g / ml). Die Ficoll sollte bei Raumtemperatur für die Herstellung sein. </li><li> Schicht 30-35 ml Buffy Coat Blut auf der Ficoll-Lösung für die erste Dichte-Gradienten. Seien Sie vorsichtig, dies langsam und vorsichtig, um Vermischen der beiden Schichten zu verhindern. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g ohne Bremse für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Für jeden Gradienten sammeln die weißen Ring von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), die zwischen den beiden Phasen mit einer Kunststoff-Pasteur-Pipette und in ein 50 ml Röhrchen befindet. </li><li> Füllen Sie jedes Rohr mit PBS-EDTA (1 mM) auf 40 ml insgesamt. </li><li> Zentrifuge bei 300 g für 10 min ohne Bremse bei Raumtemperatur. </li><li> Überstand wird abgesaugt und waschen Pellet erneut mit 40 ml PBS-EDTA (1 mM). </li><li> Für jeden Spender-Pool die Pellets in 20 ml RPMI-1640 ohne Phenolrot + 10% FCS. </li><li> Bereiten Sie das iso-osmotischen Percoll Lösung für die zweite Dichtegradienten: Für zwei Spender mischen 23.13 ml Percoll-Lösung (Dichte: 1,131 g / ml) in einem 50-ml-Tube mit 1,87 ml 10-fach PBS. Dann Transfer 23 ml dieser Lösung in ein neues 50-ml-Tube und füge 27 ml RPMI-1640 mit Phenol rot + 10% FCS, um eine 46% iso-osmotischen Percoll-Lösung zu erhalten. Die Percoll sollte bei Raumtemperatur für die Herstellung sein. </li><li> Für jeden Spender 25 ml der vorbereiteten Percoll-Lösung in ein 50 ml-Röhrchen und die Schicht des in 2.9 hergestellten Lösung PBMC) auf der Oberseite der Percoll-Lösung. Seien Sie vorsichtig, dies zu tun, sehr langsam eind sorgfältig, beide Schichten neigen dazu, leicht zu mischen. Wenn es richtig gemacht die beiden Phasen können aufgrund ihrer Unterschiede in Farbe unterschieden werden. </li><li> Zentrifuge bei 550 × g ohne Bremse für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Für jeden Gradienten sammeln die weißen Ring von Monozyten, die zwischen den beiden Phasen mit einer Kunststoff-Pasteur-Pipette und in ein 50 ml Röhrchen befindet. </li><li> Füllen Sie jedes Rohr mit PBS-EDTA (1 mM) bis zu 50 ml insgesamt. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 10 min ohne Bremse bei Raumtemperatur. </li><li> Aspiration des Überstands und Resuspendieren des Pellets in 20 ml RPMI-1640 mit Phenolrot + 10% FCS. </li></ol> 3. Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen <ol><li> Bestimmen Sie die Anzahl von isolierten Monozyten in einer Verdünnung von 1:10 in Trypanblau. Zählen nur die großen, oft unregelmäßig geformte Zellen, die Monozyten sind. Zählen Sie nicht die kleineren, runden Zellen, die Lymphozyten. NOTE: Monozyten-Zahlen nicht haben, um zu genau bestimmt, da sie einen Hinweis darüber, wie viele und welche FEP Teflon beschichteten Beutel (klein oder groß), die für die Differenzierung der Zellen verwendet werden müssen, nur werden. </li><li> Für 1,0-1,5 x 10 8 Monozyten von einem Spender, Samen der Zellen in einem großen FEP Teflon-beschichteten Zellkulturbeutel. Für jeden Beutel bereiten den Nährboden, bestehend aus 174 ml RPMI-1640, 2% humanem AB-Serum (wie in Abschnitt 1 hergestellt), 1% Penicillin / Streptomycin und 2,5 ng / ml M-CSF (Gesamtvolumen: 180 ml). <ol><li> Für 3,0-5,0 × 10 7 Monozyten von einem Spender, Samen die Zellen in einer kleinen Teflon-beschichteten Zellkulturbeutel. Für jeden Beutel bereiten das Kulturmedium, bestehend aus 28,5 ml RPMI-1640, 2% humanem AB-Serum (wie in Abschnitt 1 hergestellt), 1% Penicillin / Streptomycin und 2,5 ng / ml M-CSF (Gesamtvolumen: 30 ml). HINWEIS: Wenn zB 8,0 x 10 7 Monozyten erhalten werden, empfehlen wir, sie in tw Saatguto kleineren Volumen Taschen mit jeweils 4,0 x 10 7 Zellen. Anstelle von M-CSF, Monocyten kann alternativ mit Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) bei der gleichen Konzentration (2,5 ng / ml) unterschieden werden. </li></ol></li><li> Fügen der Zellsuspension (20 ml) zu dem Medium bereit und sorgfältig mischen. Wenn zwei Taschen sind aus einem Spender bereit, 20 ml RPMI-1640 zu der Zellsuspension und fügen Sie dann die Hälfte der Suspension auf jedem Medium Vorbereitung. </li><li> Optional: Um festzustellen, ob die Monozyten Zubereitung steril geblieben ist, reißen einen Tropfen der Zellsuspension auf einer Blut-Agar-Platte und Inkubation über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Ziehen Sie die Hülle aus einem 50 ml Perfusor-Spritze auf den Stecker des FEP Teflon-beschichtete Zellkulturbeutel und füllen Sie es mit der vorbereiteten Zellsuspension. </li><li> Ziehen Sie die Spritze und drücken Sie die restliche Luft aus dem Sack. Schließen Sie die Tasche mit einem Schließkegel. </li><li> Bebrüten die Taschen für 6-7 Tage bei 3776, C mit 5% CO 2. </li></ol> 4. Makrophagen Ernte <ol><li> Platzieren Sie die FEP Teflon-beschichtete Zellkulturbeutel mit den differenzierten Makrophagen auf Eis für mindestens 1 Stunde, um ein Ablösen der Zellen (eine Inkubation von bis zu 3 Stunden ist möglich) zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche des Beutels mit Eis bedeckt ist. </li><li> Ziehen Sie den Beutel mit minimalem Druck 10x über den Rand eines Tisches / Board. </li><li> Sorgfältig desinfizieren Sie die Außenseite der Tasche und entfernen Sie den Schließkegel. </li><li> Ziehen Sie eine 50-ml-Spritze auf dem Stecker der Tasche, entfernen Sie die Zellsuspension, und überträgt es auf 50-ml-Röhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu drehen nach unten. </li><li> Saugt den Überstand und den Pool des Pellets aus einem Beutel in 10 ml RPMI-1640 + 10% FCS insgesamt. </li><li> Bestimmen Sie die Zellzahl in einer Zählkammer (1: 4-1: 10-Verdünnung in Trypanblau). Zählen nur die großen Rundzellen. HINWEIS: Nach Differenzierung der Makrophagen in der FEP-Teflon-beschichteten Beutel, kann es sein, Restzellen zB Lymphozyten, abhängig von dem Donor und der Qualität der Isolierung von Monozyten. </li><li> Um die FEP Teflon beschichteten Beutel wiederverwenden, waschen Sie sie zweimal mit 70% Ethanol, um Restzellen zu entfernen. Füllen sie mit 50 ml 70% Ethanol und Inkubation über Nacht. Waschen Sie die Taschen 3x mit sterilem PBS, wickeln Sie sie in Sterilisationspapier und in einem Autoklaven sterilisieren Verwendung von Standardverfahren. HINWEIS: Die Zellkultur-Beutel können mehrmals ohne Verlust in Makrophagen Erträge wiederverwendet werden. Allerdings haben wir uns entschieden, die Taschen zu verwerfen nach 10 verwendet, bevor sie anfangen zu lecken. </li><li> Für nachfolgende Experimente Kultur Makrophagen in RPMI-1640 + 10% FCS. Niedrigeren Serumkonzentrationen erforderlich sind, ist auch auf den Anbau in RPMI-1640 mit 1% FCS möglich. Samenzellen und Inkubation für 3-4 Stunden. Nach dieser Zeit ist zu beachten, dass Makrophagen heften sich an die Oberfläche der Zellkulturschale, währendalle verunreinigenden Zellen (dh Erythrozyten, Lymphozyten und dendritische Zellen) bleiben in der Schwebe. Waschen Zellen mindestens zweimal mit PBS auf nicht-adhärenten Zellen zu entfernen. </li><li> Kultivierten Makrophagen aus der Zellkulturschale für weitere Experimente lösen, sorgfältig abkratzen der Oberfläche. Alternativ inkubieren Geschirr für 20 Minuten auf Eis, saugen Sie den Kulturmedium und 1 ml enzymfreie Zelldissoziationspuffer. Nach 5 min Inkubation bei 37 ° C, 4 ml PBS, und nehmen die Zellen durch Auf-und Abpipettieren für mindestens 3 min. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren, da kein Interessenkonflikt besteht.

Makrophagen sind wichtige Effektorzellen des angeborenen Immunsystems und zeigen wichtige Funktionen in der Immunmodulation, die Antigen-Präsentation und Gewebshomöostase. Aufgrund ihrer bemerkenswerten Plastizität, können sie auf verschiedene Reize mit Veränderungen ihres Phänotyps reagieren. Allerdings sind bisher viele Daten zu Makrophagen Polarisation im murinen System erhalten wird, obwohl es Berichte, die zeigen, dass nur etwa 50% der Makrophagen Polarisations Marker können direkt von der Maus verschoben werden, um menschliche 16. Daher stellen wir hier eine Methode zur primären humanen Makrophagen in ausreichender Anzahl und Reinheit zu erhalten, ohne die Notwendigkeit für teure Materialien, beispielsweise MACS magnetischen Kügelchen oder einem Gegen Zentrifugalausschlämmung Vorrichtung. Unser Verfahren zur Isolierung von Monozyten aus PBMCs und ihre nachfolgende Differenzierung zu Makrophagen in FEP basierend Teflon beschichteten Zellkulturbeuteln in Gegenwart von geringen concentrations von M-CSF 11-13. Während Monozyten machen weniger als 5 bis 10% der Leukozyten des peripheren Blutes bei Menschen, bei Stimulation sie an peripheren Stellen, wo sie ansässig Gewebe Makrophagen oder dendritischen Zellen differenzieren 17 rekrutiert. Das Zytokin M-CSF ist wichtig für das Überleben von Monozyten und treibt ihre Differenzierung zu Makrophagen 18,19. Bisher waren die M-CSF-Konzentrationen, die für die Differenzierung von Monozyten ausgewählt wurden reichten bis zu 100 ng / ml, aber in unserem Protokoll sind wir in der Lage, eine ausreichende Anzahl von reifen Makrophagen mit einem M-CSF-Konzentration von nur 2,5 ng / ml 12 erhalten , 20. Darüber hinaus werden die Zellen in FEP Teflon-beschichtete Zellkulturbeutel, die die Ablösung der Makrophagen und deren anschließende Aussaat in definierten Zellzahlen erleichtern kultiviert. Da die Beutel kann mehrere Male wiederverwendet werden, dies verringert weiter die Kosten für die Isolationsprozesses. Die durch dieses Verfahren erhaltenen Makrophagensind sehr positiv für CD45, CD14, CD11b, CD11c und zeigen die Expression des Mannose-Rezeptor CD206, die für eine Bevölkerung von reinen, reifen Makrophagen 21,22 argumentiert. Besonders hohe Expression von CD14 ist typisch für die Makrophagen in Gegenwart von M-CSF 23 differenziert. Nach dem Aussäen der Zellen, zeigen sie ein schnelles Anhaften an Kunststoffoberflächen mit einigen Zellen, die eine typische spindelförmige Morphologie, andere weisen eine Spiegelei Phänotyp. Dies ist in Übereinstimmung mit den Beobachtungen anderer Autoren 18,22,24. Es wurde berichtet, dass Monozyten-Differenzierung in Gegenwart von M-CSF führt zu M2-polarisierten Makrophagen 16,25. Jedoch sind die Makrophagen durch unser Protokoll isoliert noch in der Lage, ein breites Spektrum von Stimuli einschließlich Exposition von Tumorzellen stamm Mikrovesikel und Co-Kultur mit Tumorzellen 26,27 oder durch Einwirkung von LPS reagiert, auf die sie mit der Induktion von pro- reagieren Entzündungsgenen, wie IL-1,# 946 ;, TNF, Wnt5a oder verschiedene Matrixmetalloproteinasen, die für M1-Makrophagen polarisiert 3,5,28 typisch angesehen werden. Im Ergebnis ist die Isolierung von Monozyten durch doppelte Dichte-Gradienten-Zentrifugation und anschließende Differenzierung zu Makrophagen FEP Teflon-beschichteten Zellkulturbeuteln zu einer hohen Anzahl von Makrophagen, ohne die Notwendigkeit für technisch schwierig oder teure Verfahren. Die erhaltenen Makrophagen für eine nachfolgende Analyse von der klassischen Aktivierung durch LPS zu der Co-Kultur mit Tumorzellen verwendet werden.

Zellen aus der Monozyten-Linie und ihre terminal differenzierten Derivat - Makrophagen - zeigen eine markante Plastizität im Hinblick auf ihre biologische Funktion, was zu ihrer Beteiligung in so unterschiedlichen Prozessen wie Entwicklung, Gewebereparatur und Immunität 1. Letzteres ist aufgrund ihrer phagocytic und Antigen-präsentierenden Fähigkeit, die Makrophagen an der Kreuzung zwischen der angeborenen und adaptiven Immunantwort 2 Plätze. Allerdings ist ihre Fähigkeit, Cytokine, Chemokine, Wachstumsfaktoren und andere Signalmoleküle sezer 1 nicht nur verstärkt ihre immunmodulatorische Funktion, sondern dient auch als Grundlage für die weiteren Funktionen. Versucht, diese verschiedenen Aktivierungsschritte im Zusammenhang mit der nicht-mikrobiellen vermittelten Zuständen in der M1 und M2 die Kategorien 3 führte zu spiegeln. Während dieser Klassifizierung ist nicht vollständig, kann es für ein grundlegendes Verständnis der Biologie Makrophagen. Aufgrund dieser vielfältigen Funktionen ist es nicht überraschend, dass Makrophagen sind mit vielen Bedingungen, die in irgendeiner Weise beteiligt Gewebeumbau oder Entzündung. Neben ihrer Grund Rolle bei der Erkennung und Beseitigung von 4-6 eindringende Krankheitserreger haben Makrophagen zunehmend in den Fokus bei der Atherosklerose, Fibrose, Fettleibigkeit und Krebs 7-10 kommen. Ein reproduzierbares Verfahren zur Erzeugung von humanen Makrophagen ist daher entscheidend für ein Verständnis dieser Erkrankungen. Hier stellen wir ein Verfahren, das auf die Isolierung von humanen Monozyten aus dem peripheren Blut gesunder Spender durch einen Doppel Dichtegradientenzentrifugation Technik, wie zuvor beschrieben 11. Zur Differenzierung zu Makrophagen zu erleichtern, werden die isolierten Monozyten in Gegenwart von niedrigen Konzentrationen von M-CSF und normalem menschlichem Serum 12 inkubiert. Zur weiteren Handhabung und Zellernte zu erleichtern, ist die Differenzierung in gasdurchlässige FEP durchgeführtTeflon-beschichtete Zellkulturbeutel mit einer hydrophoben Oberfläche 12-15. Die resultierenden ruht Makrophagen kann auf eine Vielzahl von Tests unterzogen werden, da sie in der Lage ist zu reagieren entweder in einer M1 oder M2 artig noch. Alternative Methoden der Monozyten Isolierung und nachfolgende Differenzierung wie magnetische Zellsortierung (MACS) oder Gegenstrom Zentrifugalausschlämmung (CCE) einige Einschränkungen hinsichtlich der Ausbeute, Kosten und Zeit benötigt. Das hierin beschriebene Protokoll hat den Vorteil, dass sie mit Standard-Laborausrüstung, ohne die Notwendigkeit für spezielle Reagenzien (beispielsweise MACS Magnetkügelchen) oder Geräten (zB CCE Vorrichtung) durchgeführt werden und erlaubt die Verarbeitung von großen Mengen an Zellen.

<table><tbody><tr><td>Antikörper für die Immunphänotypisierung</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>z.B.: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE-Isotypkontrolle (A07796), IgG1-FITC-Isotypkontrolle (A07795)</td></tr><tr><td></td><td>BioLegends</td><td></td><td>z.B.: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td></tr><tr><td>Axiovert 200M Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>AnaSpec</td><td>89201</td><td></td></tr><tr><td>Kombi-Verschlusskegel</td><td>Braun</td><td>4495101</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, ohne Ca und Mg</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td>für PBS-EDTA (1 mM) 1 ml 0,5 M EDTA pro 500 ml PBS</td></tr><tr><td>10x PBS, ohne Ca und Mg</td><td>Invitrogen</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Titriplex III)</td><td>Merck</td><td>1084211000</td><td>Herstellung einer 0,5 M Lösung in H2O, Verwendung eines sterilen</td></tr><tr><td>Filters Zelldissoziationspuffer (enzymfrei, PBS-basiert)</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td><td>hitzeinaktiviertes</td></tr><tr><td>Ficoll (Dichte 1.077 g/ml)</td><td>Biochrom AG</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus FITC</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2010</td><td></td></tr><tr><td>LPS aus E.coli</td><td>Sigma</td><td>L8274</td><td>final conc: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Multifuge 3 L-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Biochrom AG</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (Dichte 1.131 g/ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>Perfusor Spritze 50 ml</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>resuspendiert in Methanol (c = 0,1 mg/ml)</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Einweg-Pasteurpipetten aus Kunststoff</td><td>LVL-Technologien</td><td>2655181</td><td></td></tr><tr><td>rh M-CSF</td><td>ImmunoTools</td><td>11343117</td><td>Resuspendierung in 500 & Mikro; l steril H2O (c = 100 ng/&micro; l), aliquot</td></tr><tr><td>RPMI-1640 mit Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 ohne Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>11835-063</td><td></td></tr><tr><td>Sterilisationspapier</td><td>VP Gruppe</td><td>3KFKFS230116</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau Beize (0,4% w/v)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>FEP Teflonbeschichteter Zellkulturbeutel, klein</td><td>CellGenix</td><td>72-C</td><td></td></tr><tr><td>FEP Teflon-beschichteter Zellkulturbeutel, groß</td><td>CellGenix</td><td>197-C</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung humaner monozyten durch doppel-zentrifugation und ihre differenzierung zu makrophagen in teflon-beschichteten zellkultur-taschen

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Menschliches Makrophagen werden in einer Vielzahl von pathologischen Prozessen, die von Infektionskrankheiten Krebs beteiligt. So stellen sie ein wertvolles Werkzeug, um die zugrundeliegenden Mechanismen dieser Krankheiten zu verstehen. Wir haben daher für die Isolierung von humanen Monozyten aus buffy coats, gefolgt von einem Verfahren, das die Differenzierung in hohen Ausbeuten ergibt Makrophagen stellen eine einfache Protokoll. Die Technik beruht hauptsächlich auf allgemein erhältlichen Laborgeräte und stellt eine kostengünstige und zeiteffektive Art und Weise, große Mengen menschlicher Makrophagen erhalten somit. Kurz gesagt, werden buffy coats gesunder Blutspender zu einem Doppel Dichtegradientenzentrifugation unterworfen Monozyten aus dem peripheren Blut geerntet. Diese Monozyten werden dann in Fluorethylenpropylen (FEP), Teflon-beschichteten Zellkulturbeuteln in Gegenwart von Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) kultiviert. Die differenzierten Makrophagen können leicht geerntet und für nachfolgende Studien und funktional eingesetzt werdensagt. Wichtigsten Methoden für die Qualitätskontrolle und Validierung der Isolierung und Differenzierung Schritte werden im Protokoll markiert. Zusammenfassend ist die hier beschriebene Protokoll ermöglicht Wissenschaftlern, humanen Makrophagen routinemäßig und reproduzierbar zu isolieren, ohne die Notwendigkeit für kostenintensive Werkzeuge. Weiterhin können Krankheitsmodellen in einem syngenen menschlichen System Umgehung der Verwendung von Maus-Makrophagen zu untersuchen.

Die erste Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Ficoll ergibt eine weiße Interphase enthält die PBMCs (1A), also Lymphozyten und Monozyten. Dies kann durch eine May-Grünwald-Färbung (1B und C) der gesammelten Zellen, die sowohl eine hohe Kern / Zytoplasma-Verhältnis zeigt (typisch für Lymphozyten) bestätigt und Bohnen- oder ringförmige Kerne (typisch für Monozyten). Wenn diese Zellen werden dann auf eine zweite Dichte-Gradienten unter Verwendung von Percoll geladen ist, kann die Monozyten weiter getrennt von den Lymphozyten und wieder als weiße Inter (1D-F) angezeigt. Für jede Leukozytenmanschette die beschriebene Doppel Dichtegradientenzentrifugation routine ergibt 150 ± 40 x 10 6 Monozyten, die auf 70 ± 30 x 10 6 Macrophagen (Figur 2) pro Leukozytenmanschette unterschieden werden können. Die mittlere Ausbeute von Makrophagen20 unabhängige Vorbereitungen war 47 ± 14% der Gesamt isoliert Monozyten. Nach dem Percoll-Gradienten-Zentrifugation kann es noch einige restliche nicht monozytären in der Zubereitung, die von der Blutspende sowie auf die Genauigkeit des Isolationsprozesses vorliegt Zellen sein. Nachdem jedoch die Differenzierungsphase von 6-7 Tagen wurde die Zubereitung im Wesentlichen aus reifen Makrophagen (Abbildung 3), die weiterhin aufgrund ihrer Adhärenz an Kunststoffoberflächen, einer Funktion, die nicht durch die Zufalls kontaminierenden Zellen geteilt wird (4A angereichert werden können, und B). Einmal überzogen, die Mehrheit der Makrophagen eine klassische &quot;Spiegelei&quot;-Morphologie zeigen, während es gibt auch Zellen mit einer gestreckten spindelförmigen Phänotyp (4C und D). Dies wird durch eine F-Actin-Verteilung im Cytoplasma und Haftung Cluster gespiegelt. Die differenzierten Zellenwerden durch die Expression von CD45, CD14, CD16, CD206 (Mannose-Rezeptor), CD11b und CD11c typische Marker für reife Makrophagen (Abbildung 5) sind gekennzeichnet. Die Anwesenheit von CD11b spricht gegen eine vorwiegend dendritischen Differenzierung, die durch die Tatsache, dass die Zellen negativ für die dendritischen Zellmarker CD209 (DC-SIGN) unterstützt wird. Nach der Differenzierung der Zellen weiterhin funktions und etwa 5-7 Tage (Figur 6), wie es von Calcein AM-Färbung und ihre Fähigkeit, die extrazelluläre Vesikel aus Tumorzellen vergossen visualisiert werden metabolisch aktiver. Zusätzlich können die Zellen noch, wie dargestellt beispielsweise zur Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS), die in der Expression von verschiedenen proinflammatorischen Genen (Figur 7) ergibt aktiviert werden. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in"src = &quot;/ files / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Abbildung 1. Aussehen und Zusammensetzung des PBMC- und Monozyten-Schicht nach der Doppel Dichtegradientenzentrifugation. Photographie (A) die PBMC-Band nach der Ficoll-Gradienten und (D) der Monozyten-Phase nach dem iso-osmotischen Percoll Zentrifugation. Mai-Grünwald-Färbungen von Zytospinpräparate der (B, C) ​​PBMC-Fraktion und die restlichen (E, F) Monozyten. Maßstab = 200 um B und E, = 50 um in C und F. <img alt="Figur 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> Abbildung 2. Ausbeute von Monozyten und Makrophagen. Repräsentative Zellzählungen von isolierten Monozyten und Makrophagen von 20 Buffy-Coat-preparations. <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Figur 3 Schliffbilder und Zellgrößenmessungen von Monozyten und Makrophagen. Phasenkontrastmikroskopie monozytären Zellsuspension vor (A) und nach (B) Makrophagen-Differenzierung. Entsprechende Zellengröße Histogramme von Monozyten (C) und Makrophagen (D). Maßstab = 100 um. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> Abbildung 4. Morphologie und Organisation des Zytoskeletts von adhärenten Makrophagen. Phasenkontrastmikroskopie von adhärenten Makrophagen vor (A) und nach (B) Entfernung von nicht-adherenT-Zellen. (C, D) Phalloidin-TRITC-Färbung von polymerem Aktin in adhärenten, nicht stimulierte Makrophagen. Maßstab = 100 um AC, 20 um D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. Immunophänotyp von differenzierten Makrophagen. Durchflusszytometrie-Analyse von Makrophagen nach 6 Tagen der Differenzierung in FEP Teflon-beschichtete Zellkulturbeutel (rot markiert). Die entsprechenden Isotypkontrollen sind grau dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 6. Die Aufnahme von Tumorzellen durch Makrophagen Mikrovesikeln. Mikroskopische Aufnahmen von adhärenten Makrophagen nach Exposition zu PKH26-markierten (rot fluoreszierend) Tumorzelle Mikrovesikeln. Bilder werden an den entsprechenden (A) Hell oder (B) cytosolischen Färbung mit dem Farbstoff Calcein AM Lebensfähigkeit überlagert. Maßstabsbalken = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7. Eine Hochregulierung von IL-1 β, Wnt5a, TNF, IL-6, MMP-2, MMP-7 und MMP-MT1 nach Stimunung von Makrophagen mit LPS (100 ng / ml) für 24 Stunden. Genexpression wurde durch quantitative RT-PCR aus Gesamt-RNA-Proben (A) und auf HPRT1 und GNB2L1 Expression normalisiert gemessen. Die gezeigten Werte sind fachen Änderungen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (Mittelwert ± SD, n = 5, * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). TNF und IL-6-Induktion nach LPS-Stimulation wurden durch ELISA (B) bestätigt (Mittel ± SD, * p &lt;0,05).

Wir stellen ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung von menschlichen Makrophagen. Buffy Coats werden durch Doppel Dichtegradientenzentrifugation isoliert verarbeitet und Monozyten werden dann an Makrophagen in Teflon-beschichtete Zellkulturbeutel differenziert. Dies maximiert Makrophagen-Renditen und erleichtert die Zellernte für nachfolgende Experimente.

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, menschliche Makrophagen in hoher Menge und Qualität unter Verwendung standardmäßiger Laborgeräte herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst Blut aus Buffy Coats über einen FI-Rohr-Gradienten zentrifugiert wird, um die PBMCs zu sammeln. Anschließend werden über einen Rohr-Gradienten die Monozyten von den Lymphozyten getrennt.Anschließend werden die Monozyten in Teflon-beschichteten Zellkultursäcken ausgesät und differenziert. Nach sechs oder sieben Tagen werden die Makrophagen geerntet und für nachfolgende Untersuchungen ausgesät. Die erhaltenen Zellen sollten die typischen Marker reifer Makrophagen exprimieren und auf verschiedene Stimuli reagieren, wie beispielsweise eine Ko-Kultivierung mit Tumorzellen oder eine Stimulation mit LPS. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie Gegenstromzentrifugation, Zentrifugation oder magnetisch aktivierter Zellsortierung besteht darin, dass humane Makrophagen mit Standard-Lip-Ausrüstung erzeugt werden können, ohne aufwändige Reagenzien oder Instrumente zu benötigen.Obwohl diese Methode einfach durchzuführen ist, könnten Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, die verschiedenen Zellpopulationen in den Dichtegradienten zu visualisieren und zu trennen. Daher wird eine visuelle Demonstration dieser Schritte helfen, diese Schwierigkeiten zu überwinden. Dieses Protokoll wird im Duplikat durchgeführt, um das Ausbalancieren der Rotoren zu erleichtern.Beginnen Sie mit der Desinfektion von zwei Beuteln der Buffy-Coat-Fraktion aus geschichtetem Blut. Anschließend überführen Sie die Buffy Coats in jeweils zwei 50-Milliliter-Röhrchen pro Buffy Coat. Bereiten Sie drei 50-Milliliter-Röhrchen mit jeweils 15 Milliliter FI-Zell-Lösung bei Raumtemperatur mit einer Dichte von 1,077 Gramm pro Milliliter vor.Nun vorsichtig und langsam 30 bis 35 Milliliter der Trübungsschicht auf jede Tube mit FI-Aufruf schichten. Die Schichten sollten sich nicht vermischen; zentrifugieren Sie diese Tubes 30 Minuten lang bei 400 G, bei Raumtemperatur. Zwischen den beiden Phasen bildet sich ein weißer Ring aus peripheren mononukleären Blutzellen.Entfernen Sie diese Schichten mit einer Plastikpipette. Vereinigen Sie die Schichten der drei Röhrchen jedes Spenders in zwei 50-Milliliter-Röhrchen pro Spender. Waschen Sie die gesammelten Zellen, indem Sie eindringlich P-B-S-E-D-T-A bis zur 40-Milliliter-Marke hinzufügen, und zentrifugieren Sie sie anschließend 10 Minuten bei 300 ×g bei Raumtemperatur, ohne dabei das Beschleunigungsprofil zu unterbrechen.Aspirieren Sie nun und verwerfen Sie die Überstände. Wiederholen Sie dann die Waschung und resuspendieren Sie die Pellets in P-B-S-C-D-T-A. Sammeln Sie die Pellets von jedem Spender und resuspendieren Sie sie in 20 Milliliter RPMI plus FCS ohne Phenolrot. Es sollte nun ein Röhrchen mit Zellen pro Spender vorliegen.Bereiten Sie nun die zweite Dichtegradientenmischung vor, indem Sie 23,13 Milliliter der percall-Lösung bei Raumtemperatur mit 1,87 Milliliter 10× PBS in einem 50-Milliliter-Röhrchen mischen. Bereiten Sie pro zwei Proben ein Röhrchen der Mischung vor. Überführen Sie anschließend 23 Milliliter der Mischung in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen.Fügen Sie dann 27 Milliliter RPMI plus FCS mit Phenolrot hinzu. Das Ergebnis ist eine 46 %ige ISO-osmotische Lösung pro Zelle. Überführen Sie nun für jeden Spender 25 Milliliter der 46 %igen Lösung in ein 50-Milliliter-Gefäß und schichten Sie vorsichtig die Zellmischung darauf.Die beiden Phasen sollten anhand ihrer Farben ohne Unterbrechung unterscheidbar sein. Zentrifugieren Sie die Zellen eine halbe Stunde bei Raumtemperatur und 550 ×g. Ein weißer Ring aus Monozyten sammelt sich zwischen den beiden Phasen an. Sammeln Sie diese Zellen mit einer Plastikpipette in einem 50-Milliliter-Röhrchen.Waschen Sie die Monozyten mit eintausend Millimolar P-B-S-E-D-T-A, bis zur 50-Milliliter-Marke aufgefüllt. Anschließend zentrifugieren Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 400 ×g, ohne Unterbrechung, entfernen das Überstand und resuspendieren die pelletierten Monozyten in 20 Milliliter Medium. Danach fahren Sie mit dem nächsten Abschnitt fort.Dieses Protokoll verwendet Kulturbags mit FEP-Teflon-Beschichtung als Kulturkammer. Beginnen Sie mit der Schätzung der Anzahl der gewonnenen Monozyten. Monozyten sind groß und oft unregelmäßig geformt.Zählen Sie die kleineren Lymphozyten nicht. Wenn 100 bis 150 Millionen Zellen eines Spenders verfügbar sind, bereiten Sie 180 Milliliter supplementiertes RPMI vor. Bei geringerer Zellanzahl bereiten Sie jeweils 30 Milliliter Medium für 30 bis 50 Millionen Zellen vor. In einem 20 Milliliter umfassenden Aliquot werden die Zellen vorsichtig in die 180 Milliliter vorbereitetes Medium eingemischt. Anschließend wird der Kulturbeutel mit den Zellen unter Verwendung einer 50-Milliliter-Perfu-Spritze, die an den Stopfen des Kulturbeutels angeschlossen ist, befüllt. Danach wird die Spritze entfernt, die verbleibende Luft herausgedrückt und der Stopfen mit einem Kegel verschlossen.Jetzt die Beutel sechs bis sieben Tage lang mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach sechs bis sieben Tagen Inkubation die Kulturbeutel auf Eis überführen, um die Zellen zu gewinnen; die Beutel vollständig in Eis eintauchen und eine bis drei Stunden lang abkühlen lassen, damit sich die Zellen ablösen. Danach die Beutel vorsichtig etwa 10 Mal über eine Kante ziehen.Danach die Außenseite der Beutel gründlich desinfizieren. Den Verschlusskegel durch eine 50-Milliliter-Spritze ersetzen. Anschließend die Zellsuspension abziehen und in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführen.Wenn alle Röhrchen gesammelt sind, zentrifugieren Sie sie 10 Minuten bei 400 ×g bei Raumtemperatur. Saugen Sie nun den Überstand ab und sammeln Sie alle Zellen in 10 Milliliter RPMI plus FCS. Anschließend zählen Sie die Zellen wie zuvor. Zählen Sie nur die Makrophagen, da verbleibende Lymphozyten vorhanden sein können.Verwenden Sie anschließend die Zellen für die gewünschte Anwendung, um die Kulturbeutel wiederverwenden zu können. Spülen Sie sie zweimal mit 70 % Ethanol. Füllen Sie sie dann mit 50 Milliliter 70 % Ethanol und inkubieren Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag spülen Sie die Beutel dreimal mit steriler PBS.Dann in Sterilisationspapier einwickeln und autoklavieren. Ein Beutel kann leicht 10-mal die Dichtegradientenzentrifugation wiederverwendet werden. Die Zentrifugation ergibt eine weiße Grenzschicht, die Lymphozyten und Monozyten enthält.Hier untersuchen wir das erste Dichtegradient. May-Grünwald-Färbung dieser Zellen zeigt sowohl ein hohes Kern-Zytoplasma-Verhältnis, typisch für Lymphozyten, als auch bohnen- oder ringförmige Kerne, typisch für Monozyten.Diese Färbungen zeigen die Ergebnisse des zweiten Gradienten. Jede Buffy Coat-Fraktion liefert etwa 150 Millionen Monozyten, die in etwa 70 Millionen Makrophagen differenziert werden können. Bei 20 Präparationen entwickelten sich 47 % der Monozyten zu Makrophagen. Die gereinigten Makrophagen können durch Anheftung an Kunststoffoberflächen weiter angereichert werden, eine Eigenschaft, die von den verunreinigenden Zellen nicht geteilt wird. Nach dem Ansäen zeigen die meisten Makrophagen eine „gebratenes-Ei“-Morphologie, während andere ein gestrecktes, spindelartiges Phänotyp aufweisen. Die Zellen zeichnen sich durch die Expression mehrerer Marker aus.Typisch für reife Makrophagen. Die Expression von CD11b spricht gegen eine dendritische Differenzierung, ebenso wie das Fehlen der CD209-Expression. Nach der Differenzierung verbleiben die Zellen fünf bis sieben Tage lang funktionell und metabolisch aktiv.Die Kalzium-Färbung lebender Zellen zeigt ihre Fähigkeit zum Aufnahme rot markierter extrazellulärer Vesikel, die von Tumorzellen abgegeben wurden. Zusätzlich können die Makrophagen aktiviert werden, beispielsweise durch Stimulierung mit Lipopolysaccharid, was zur Expression mehrerer pro-inflammatorischer Gene führt. Nach dieser Prozedur können die isolierten Makrophagen einer breiten Palette funktioneller Assays unterzogen werden, um grundlegende Fragen zur Makrophagenbiologie in Gesundheit und Krankheit zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hohe Zahlen menschlicher Makrophagen erzeugt. Es ist jedoch wichtig, sich bewusst zu machen, dass Sie mit menschlichen Blutproben arbeiten, die potenziell infektiös sein könnten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von Monozyten aus menschlichem Vollblut durch immunomagnetische negative Trennung. Die isolierten Monozyten können für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden.

Isolierung von Monozyten aus Vollblut durch immunomagnetische Negativselektion

Dieses Video zeigt das Priming von primären Monozyten in Makrophagen. Primäre humane Monozyten können isoliert und unter Verwendung des Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-CSF) zu einem M1-ähnlichen proinflammatorischen Phänotyp oder unter Verwendung des Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (M-CSF) zu einem M2-ähnlichen entzündungshemmenden Phänotyp differenziert werden.

In vitro Kultur und Differenzierung von primären Monozyten zu Makrophagen

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur Induktion der Differenzierung und Polarisation von Monozyten aus peripherem Blut in M1- oder M2-Makrophagen. Die Inkubation mit Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor, Lipopolysaccharid und Interferon-gamma ergibt proinflammatorische M1-Makrophagen, während die Inkubation mit Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor und Interleukin-4 die entzündungshemmende Produktion von M2-Makrophagen induziert.

Differenzierung und Polarisation von Monozyten-abgeleiteten Zellen in Makrophagen-ähnliche Zellen

Monozyten abgeleiteten Makrophagen sind wichtige Zellen des angeborenen Immunsystems. Hier beschreiben wir eine einfach zu...

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Es wird ein Protokoll für die Zellkultur von Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen vorgestellt. Das Protokoll nutzt die Kryokonservierung von Monozyten in Verbindung mit ihrer Massendifferenzierung in Makrophagen. Dann können geerntete Makrophagen in Kulturvertiefungen mit den erforderlichen Zelldichten für die Durchführung von Experimenten ausgesät werden.

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Proteomic Unterschriften von menschlichen Makrophagen und wenden Sie diese zur Bestimmung der Auswirkungen einer sauerstoffarmen Umgebung auf Makrophagen Polarisation.

Proteomic Analysen der menschlichen Makrophagen Polarisierung in einer sauerstoffarmen Umgebung

Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Isolierung, Kultivierung, Transfekung und Unterscheidung menschlicher Primärmonozyten von HIV-infizierten Personen und gesunden Kontrollen vorgestellt.

Isolation, Transfektion und Kultur der primären menschlichen Monozyten

M2-ähnliche tumorassoziierte Makrophagen (TAM) sind mit Tumorprogression und schlechter Prognose bei Krebs assoziiert. Dieses Protokoll dient als detaillierte Anleitung, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen innerhalb von 14 Tagen reproduzierbar in M2-ähnliche Makrophagen zu differenzieren und zu polarisieren. Dieses Modell ist die Grundlage, um die entzündungshemmende Wirkung von TAM in der Tumormikroumgebung zu untersuchen.

Makrophagendifferenzierung und Polarisation in einen M2-ähnlichen Phänotyp unter Verwendung einer humanen Monozyten-ähnlichen THP-1-Leukämie-Zelllinie

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Bewertung des immunmodulatorischen Potenzials von Implantatoberflächen in vitro vor, um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit aktueller Protokolle zu verbessern und die weitere Forschung zu fördern. Sekretorische Zytokinprofile, mRNA-Expression und Zelloberflächenmarker wurden mit Hilfe von Blutmonozyten-abgeleiteten Makrophagen überwacht, um die Makrophagenpolarisation auf Titan zu untersuchen.

Polarisation und Charakterisierung von M1- und M2-humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen auf Implantatoberflächen 

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um die Interaktion von primären humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen mit einem Tumorsphäroid in einer dreidimensionalen (3D) Kollagen-I-Matrix zu untersuchen, mit der Möglichkeit, den Einfluss löslicher und physikalischer Eigenschaften der Mikroumgebung auf die Zellinvasion zu vergleichen.

Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

Monozyten und Makrophagen sind sehr plastische und reprogrammierbare Immunzellen, die für Gesundheit und Krankheit entscheidend sind. Sie spüren und reagieren auf ein breites Spektrum von Reizen, indem sie spezifische Differenzierungsprogramme und Phänotypen übernehmen. Wir haben ein In-vitro-Modell standardisiert, um die Polarisation und Reprogrammierung von Makrophagen zu untersuchen, was ein wertvolles Werkzeug für die Forschung darstellt.

Reprogrammierungsmodell von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen für In-vitro-Assays

Lernen Sie die Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und deren Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen. Diese kostengünstige Methode liefert etwa 70 Millionen Makrophagen pro Buffy Coat.

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen (Video) | JoVE Journal

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

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