Visualisierung der Caspase-Aktivierung in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

In Immunzellen ist Caspase-1, eine entzündliche Caspase, eine wichtige immunresponsive Komponente, die in inaktiver Form vorliegt. Diese inaktiven Formen bestehen aus einer Pro-Domäne, die mit einer katalytischen Domäne fusioniert ist, und werden durch Proximity-induzierte Dimerisierung aktiv.

Um die Caspase-Aktivierung in vivo sichtbar zu machen, beginnen Sie mit einer Kultur von transfizierten humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen, die rot fluoreszierende Proteine exprimieren, und einem Paar fluoreszierender Komplementationsreporterproteine. Die Reporterproteine enthalten eine Pro-Domäne von Caspase-1, die mit nicht-fluoreszierenden Fragmenten des Venusproteins fusioniert ist, entweder Venus-N oder Venus-C.

Behandeln Sie die Zellen mit einem bildgebenden Medium, das Lipopolysaccharide – ein aus Bakterien gewonnenes Entzündungsstimulans – und Kaliumionophore – Nigericin – enthält.

Lipopolysaccharide interagieren mit Mustererkennungsrezeptoren auf dem Makrophagen und initiieren so den Aufbau eines Inflammasom-Komplexes.

Nigericin-Moleküle dringen in die Zelle ein und binden an Kaliumionen, wodurch deren Ausfluss in das extrazelluläre Medium bewirkt und die intrazelluläre Kaliumionenkonzentration verringert wird. Dies führt zum Priming von Inflammasom-Sensorproteinen mit Adapterproteinen – einem Brückenprotein zwischen Sensorprotein und Procaspase-1, das den Komplex bildet.

Die Pro-Domänen, die Venusfragmente enthalten, interagieren mit den Adapterproteinen des Komplexes. Dadurch kommen die beiden Fragmente in die Nähe und zwingen sie, sich wieder zu falten und zu fluoreszieren.

Visualisieren Sie die Zellen unter einem Epifluoreszenzmikroskop.

Die transfizierten Zellen erscheinen rot mit grünen Fluoreszenzflecken, was die Caspase-Aktivierung bestätigt.

Nehmen Sie ein steriles 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen pro Transfektion und geben Sie das entsprechende Reporterplasmid und Caspase-BiFC-Plasmide in die Haube. Platzieren Sie die Pipettenstation, das Gerät, die Spitzen, die Elektroporationsschläuche und die Pipette in einer sterilen Laminar-Flow-Haube. Schließen Sie das Nukleofektionsgerät an und schalten Sie es ein.

Geben Sie die Transfektionsparameter im angezeigten Startbildschirm ein. Drücken Sie auf Voltage, geben Sie 1.000 ein und drücken Sie Done, um den Wert auf 1000 Volt einzustellen. Drücken Sie auf Width, geben Sie 40 ein, und drücken Sie Done, um den Impuls auf 40 Millisekunden einzustellen. Drücken Sie abschließend auf # Impulse, geben Sie zwei ein und drücken Sie Fertig, um die Anzahl der elektrischen Impulse auf 2 einzustellen.

Nehmen Sie eines der Elektroporationsröhrchen und füllen Sie es bei Raumtemperatur mit drei Millilitern Elektrolytpuffer E. Führen Sie den Elektroporationsschlauch in den Pipettenhalter an der Pipettenstation ein und stellen Sie sicher, dass die Elektrode an der Seite des Schlauchs nach innen zeigt und beim Einführen des Schlauchs ein Klickgeräusch zu hören ist.

Nehmen Sie das Zellpellet und geben Sie 10 Mikroliter vorgewärmten Resuspensions-R-Puffer für jeweils 1 bis 2 mal 10 in die fünften Zellen und mischen Sie vorsichtig mit einer P20-Mikropipette. Geben Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension in jedes Transfektionsröhrchen und mischen Sie es vorsichtig mit einer P20-Mikropipette. Führen Sie eine Spitze in die Pipette ein, indem Sie den Druckknopf bis zum zweiten Anschlag drücken, und stellen Sie sicher, dass die Klemme den Befestigungsschaft des Kolbens in der Spitze vollständig aufnimmt.

Drücken Sie anschließend den Druckknopf an der Pipette bis zum ersten Anschlag und tauchen Sie in das erste Röhrchen mit der Zell- oder Plasmid-DNA-Mischung, um die Probe zu aspirieren. Führen Sie die Pipette mit der Probe sehr vorsichtig in den Pipettenhalter ein und achten Sie darauf, dass die Pipette einrastet und richtig platziert ist. Drücken Sie auf dem Touchscreen auf Start und warten Sie, bis die elektrischen Impulse abgegeben werden.

Nehmen Sie die Pipette langsam aus der Station und geben Sie die transfizierte Zellsuspension sofort in die entsprechende Vertiefung mit dem vorgewärmten, antibiotikafreien Medium, indem Sie den Druckknopf langsam bis zum ersten Anschlag drücken. Schütteln Sie die Platte vorsichtig mit transfizierten Zellen und inkubieren Sie sie ein bis drei Stunden lang in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator. Geben Sie dann 200 Mikroliter vorgewärmtes Nährmedium in jede Vertiefung

Stellen Sie die Schale in den Inkubator und warten Sie mindestens 24 Stunden für die Genexpression. Am nächsten Tag untersuchen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen und die Transfektionseffizienz mit einem Epifluoreszenzmikroskop.

Entfernen Sie das Medium vorsichtig mit einer P1000-Mikropipette aus den Zellen und fügen Sie 500 Mikroliter der Stimuluslösung an der Seite der Vertiefung hinzu. Um unbehandelte Kontrollwells zu betreiben, fügen Sie ein Bildgebungsmedium ohne den Stimulus hinzu.

Um die Zellen mit einem Epifluoreszenz- oder einem Konfokalmikroskop sichtbar zu machen, schalten Sie das Mikroskop und die Fluoreszenzlichtquelle gemäß den Anweisungen des Herstellers ein. Wählen Sie das 10-fach- oder 20-fach-Objektiv und stellen Sie die Kulturschale auf den Mikroskoptisch.

Finden Sie mit dem Okular Zellen unter dem 568-Nanometer-Filter und konzentrieren Sie sich auf die Zellen, die die roten Reporterzellen exprimieren. Zählen Sie alle roten Blutkörperchen im Gesichtsfeld. Wechseln Sie im selben Sichtfeld zu den Filtern 488 oder 512. Zählen Sie die Anzahl der roten Zellen, die ebenfalls grün sind. Zählen Sie mindestens 100 rote Felder in mindestens drei Feldern.