Optimierung der extrazellulären Vesikelabgabe mit einem 3D-biogedruckten Gerüst für die Behandlung chronischer Wunden

Das Forschungsziel ist die Entwicklung eines fortschrittlichen bioaktiven Wundverbandsdesigns für ein effektives chronisches Wundmanagement. Das Gerüst wird die Kontrolle, den Abbau und die effiziente lokale Abgabe von extrazellulären Vesikeln gewährleisten.

Das derzeitige Protokoll zielt darauf ab, die Einschränkungen des herkömmlichen Wundverbands bei der Behandlung chronischer Entzündungen zu überwinden. Insbesondere der Mangel an Kontrolle, Abbau und rechtzeitiger Freisetzung extrazellulärer Vesikel.

Dieses Protokoll bietet einen abstimmbaren Ansatz, um Therapeutika, einschließlich Gene, rechtzeitig für verschiedene Anwendungen bereitzustellen.

Alle Ergebnisse liefern neue Einblicke in die Anpassung eines Gerüsts an verschiedene Wundtypen und die Verbesserung regenerativer Therapien durch Beladung extrazellulärer Vesikel mit einem bestimmten bioaktiven Molekül.

Unser Labor wird eine translationale Forschungsplattform aufbauen, um sich mit der Heilung diabetischer Wunden zu befassen.

[Erzähler] Tauen Sie zunächst ein Fläschchen mit mesenchymalen Stammzellen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad schnell auf. Entfernen Sie das Fläschchen, wenn ein kleines Eisfragment übrig bleibt. Übertragen Sie den gesamten Inhalt des Fläschchens mit mesenchymalen Stammzellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit vollständigem Medium. Die Zellen werden bei 200 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter vorgewärmtem Komplettmedium. Anschließend werden die Zellen in einen T25-Kolben mit vier Millilitern vollständigem Medium überführt. Kippen Sie den T25-Kolben vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind. Der Kolben wird bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubiert. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht haben, aspirieren Sie das verbrauchte Medium aus dem T25-Kolben. Geben Sie drei Milliliter frisches PBS in den Kolben, um alle Restzellen zu entfernen. Geben Sie anschließend einen Milliliter 0,25%ige Trypsinlösung in den Kolben und inkubieren Sie. Überwachen Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop bei 4-facher Vergrößerung. Geben Sie nun vier Milliliter vorwarmes, vollständiges Medium in den Kolben und pipettieren Sie über die Oberfläche auf und ab, bis eine Ablösung. Dann überführen Sie die Zellsuspension in eine 15-Milliliter-Zentrifuge zwei. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie das Zellpellet in frischem, vollständigem Medium und zählen Sie die Zellen. Anschließend werden die Zellen in einen T75-Kolben mit einer Aussaatdichte von 5.000 Zellen pro Quadratzentimeter überführt. Der T75-Kolben wird bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubiert. Nach 72 Stunden wird das konditionierte Medium aus den Zellen entnommen, um die extrazelluläre Vesikel zu isolieren. Um die extrazellulären Vesikel oder EVs zu isolieren, zentrifugieren Sie die 13 Milliliter des gesammelten konditionierten Mediums 15 Minuten lang bei 800 G, um Zelltrümmer zu entfernen. Verwenden Sie einen 0,22-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter, um den Überstand zu filtern und große Partikel zu entfernen. Geben Sie nun fünf Milliliter Fällungspuffer in das gefilterte konditionierte Medium. Wirbeln Sie die Mischung gründlich ein, um sicherzustellen, dass sie homogen ist. Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius, damit extrazelluläre Vesikel ausfallen können. Anschließend zentrifugieren Sie die Mischung bei 3.220 g für 30 Minuten bei 20 Grad Celsius. Sicherstellen, dass die Rohre ausbalanciert sind. Den Überstand vorsichtig entsorgen, ohne das Pellet zu stören, und erneut fünf Sekunden lang zentrifugieren. Nun wird das EV-Pellet vorsichtig wieder in 200 Mikrolitern PBS suspendiert, um eine Beschädigung der Vesikel zu vermeiden. Führen Sie Western Blotting durch, um extrazelluläre Vesikel-spezifische Marker, einschließlich CD63, CD81 und CD9, nachzuweisen. Bereiten Sie eine frische 4,5%ige Natriumalginatlösung in sterilem Reinstwasser vor. Rühren Sie die Lösung über Nacht bei 60 Grad Celsius um, um eine vollständige Auflösung zu gewährleisten. Als nächstes lösen Sie Carboxymethylcellulose in sterilem Reinstwasser auf, um eine 3,8%ige Lösung zu erhalten. Zentrifugieren Sie die vorbereiteten Biotinten 10 Minuten lang bei 3.220 g bei 25 Grad Celsius, um Blasen zu entfernen, die den Druckprozess beeinträchtigen könnten. Verwenden Sie nun einen Spritzenmischer und mischen Sie drei Milliliter der vorbereiteten Natriumalginatlösung mit markierten EVs oder der Dialymmi-Kontrolle. Vorsichtig gut mischen, um eine gleichmäßige Suspension zu gewährleisten. Verwenden Sie einen anderen Spritzenmischer, um einen Milliliter Carboxymethylcellulose mit frisch zubereiteter Alginat-Lyase-Lösung in sterilem Reinstwasser zu kombinieren, um eine Endkonzentration von 0,5 Millieinheiten pro Milliliter zu erreichen. Laden Sie gleichzeitig die Natriumalginat EV Bio-Tinte in den Kernteil und die Carboxymethylcellulose-Alginat-Lyase-Biotinte in den Mantelteil des Spritzenaufbaus. Starten Sie die 3D-Biodrucker-Software. Wählen Sie eine zylindrische Form mit einem diagonalen Füllmuster aus, um die Gerüststruktur zu erstellen. Stellen Sie den Zylinderdurchmesser auf 20 Millimeter und die Höhe auf 1,1 Millimeter ein. Konfigurieren Sie die Porengröße auf einen Millimeter. Stellen Sie das Saugvermögen von Kern und Manteldüse auf einen Millimeter pro Sekunde bei einer Dicke von 0,25 Millimetern pro Schicht ein. Konfigurieren Sie die Bewegungsgeschwindigkeit auf sechs Millimeter pro Sekunde und drucken Sie vier Schichten bei Raumtemperatur. Verwenden Sie einen Luftbefeuchter mit Aerosol-Calciumchlorid, um das Gerüst während des Extrusionsprozesses zu vernetzen. Beginnen Sie mit dem Drucken des Gerüsts auf Polyesterfolie. Positionieren Sie die Befeuchterdüse etwa 20 Zentimeter vom Extrusionskopf entfernt, um eine effektive Vernetzung zu gewährleisten. Tauchen Sie das Gerüst 10 Minuten lang in 2,2%ige Calciumchloridlösung, um die Vernetzung abzuschließen. Spülen Sie das Gerüst dreimal mit sterilem Reinstwasser ab, um überschüssiges Calciumchlorid und ungebundene Bio-Tinte zu entfernen. Rasieren Sie die Rückenhaut einer anästhesierten OCTA-Diabemaus mit einer elektrischen Haarschneidemaschine, um Hautreizungen oder Verletzungen zu vermeiden. Erstellen Sie nun eine sechs Millimeter große, kreisförmige Hautwunde in voller Dicke auf der dorsalen Oberfläche jeder Maus. Platzieren Sie das 3D Bioprinted Gerüst mit PKH-markierten extrazellulären Vesikeln vorsichtig auf dem Wundbett. Stellen Sie sicher, dass das Gerüst die Wundoberfläche vollständig bedeckt, und drücken Sie leicht mit einer sterilen Pinzette, um Lufteinschlüsse zu minimieren. Übertragen Sie anästhesierte Mäuse zwei Stunden, vier Stunden, acht Stunden und 24 Stunden nach der Implantation in das IVIS-Bildgebungssystem. Wählen Sie im Bildgebungsassistenten die Option Fluoreszenzbildgebung und aktivieren Sie die Anregungs- und Emissionsfilter für den PKH-Farbstoff. Passen Sie die Kameraeinstellungen an, einschließlich des Sichtfelds und der Motivhöhe, um die Signalerkennung zu optimieren. Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern und speichern Sie die resultierenden Daten. Geben Sie dann die Fluoreszenzsignale von den markierten EVs frei. Die Alginat-EVs in Carboxymethylcellulose-Alginat-Lyase-Gerüsten zeigten ein schnelleres Freisetzungsprofil im Vergleich zu Alginat-EVs in Carboxymethylcellulose, insbesondere zu den Zeitpunkten zwei und vier Stunden.