Herstellung von technischen Gefäßklappen mit 3D-Drucktechnologien
19. Mai 2022
Konstruierte Klappen erfordern ein integriertes funktionelles Gefäßnetzwerk. In diesem Protokoll stellen wir eine Methode zur Herstellung einer 3D-gedruckten Gewebeklappe vor, die ein hierarchisches Gefäßnetzwerk und seine direkten mikrochirurgischen Anastomosen an der Oberschenkelarterie der Ratte enthält.
Unser Protokoll ermöglicht es Forschern, hierarchische Gefäßnetzwerke innerhalb einer vollständig entwickelten und implantierbaren Klappe zu generieren, was den Weg für neue Studien zum Verhalten von Blutgefäßen unter Integration in vivo ebnete. Diese Technik kombinierte die Vielseitigkeit von zwei 3D-Drucktechnologien, um Gefäße auf Mikro- und Mesoskala herzustellen und zusammenzubauen, die mittels Mikrochirurgie direkt mit Wirtsgefäßen anastomosiert werden können. Vollständig entwickelte vaskularisierte Lappen können zur Behandlung großer Gewebedefekte sowie zur Untersuchung von Gewebeentwicklungen und -integrationen eingesetzt werden.
Die vorgeschlagenen Methoden können erweitert werden, um den Einbau gewebespezifischer Zellen zu untersuchen und die Verwendung verschiedener Bioink- und Trägermaterialien zu bewerten. Beginnen Sie mit dem Füllen der BVOH-Form mit 30 Mikrolitern der Polymerlösung. Zentrifugieren Sie die Form bei 100 mal g für 2 Minuten und füllen Sie die Form mit weiteren 20 Mikrolitern der Polymerlösung, um eine vollständige Abfüllung zu gewährleisten.
Frieren Sie die gefüllten Formen bei minus 80 Grad Celsius für mindestens 30 Minuten ein, um sicherzustellen, dass die gesamte Polymerlösung gefriert. Entfernen Sie das Lösungsmittel aus den Schimmelpilzen, indem Sie sie über Nacht lyophilisieren. Um das Opferformmaterial zu entfernen, geben Sie die Formen nach dem Gefriertrocknungsprozess unter sanftem Rühren in ein 5-Liter-Deionwasserbad.
Ersetzen Sie das Wasser im Bad, wenn es trüb wird. Wenn sich alle BVOH aufgelöst haben, trocknen Sie die Gerüste an der Luft und lagern Sie sie bis zur Verwendung in einer Vakuumkammer. Übertragen Sie etwa 4 Milliliter des vorbereiteten, verdichteten Trägermaterials mit einer Verdrängerpipette in jedes Bohrloch einer 12-Well-Platte.
Klopfen Sie auf die Bohrlochplatte auf eine harte Oberfläche, um das Stützmaterial zu zwingen, sich gleichmäßig im Bohrloch zu verteilen. Bereiten Sie eine Suspension vor, die 2 Millionen HAMEC-ZsGreen und 6 Millionen Stammzellen der Zahnpulpa in 10 Millilitern Endothelzellmedium enthält. Zentrifen Sie die Zellsuspension bei 200 mal g für 4 Minuten, um ein Zellpellet zu erhalten, dann saugen Sie das überstehende Medium ab und suspendieren Sie das Zellpellet in 1 Milliliter rhCollMA-Biotinte, um eine Biotinte mit einer Gesamtzellkonzentration von 8 Millionen Zellen pro 1 Milliliter Biotinte zu erhalten.
Bringen Sie eine Nadel mit einem Innendurchmesser von 0,22 Millimetern an eine 3-Milliliter-Bernsteindruckpatrone und legen Sie die Patrone in ein konisches 50-Milliliter-Rohr. Übertragen Sie 1 Milliliter der Zell-Bioink-Mischung auf die Druckpatrone, indem Sie sie von oben mit einer Verdrängungspipette füllen, um Blasen zu reduzieren. Setzen Sie die Druckpatrone in das entsprechende Werkzeug am Bioprinter ein.
Skizzieren Sie ein 2D-Muster eines 4-Millimeter-Quadrats, das einen kreisförmigen Kanal mit einem Durchmesser von 2 Millimetern in der Mitte enthält. Extrudieren Sie die Skizze um 4 Millimeter, um einen 4-Millimeter-Würfel mit einem zentralen Kanal zu erhalten. Exportieren Sie dieses Objekt als STL-Datei.
Importieren Sie eine 12-Well-Plate-STL-Vorlage in die Registerkarte Solid Modeling in der Bioprinter-Slicing-Software und platzieren Sie sie im dafür vorgesehenen Bereich des virtuellen Druckbetts. Importieren Sie die STL-Datei der Würfelform in die Registerkarte Volumenmodellierung in der Bioprinter-Slicing-Software. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen Externen Datenschnitt verwenden, gefolgt von Datenschnitt konfigurieren im Abschnitt Objekteigenschaft.
Wählen Sie im Popup-Fenster ein geradliniges Muster für das Füllmuster aus und geben Sie 30% in die Fülldichte ein, und klicken Sie auf Akzeptieren. Klicken Sie auf den Würfel und bewegen Sie ihn mit der Maus, um eine Kopie der Würfelform in jeden gewünschten virtuellen Brunnen zu legen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Material hinzufügen auf der Registerkarte Materialien der Bioprinter-Schneidesoftware, um neue Materialeinstellungen für rhCollMA bioink zu erstellen.
Wählen Sie die Materialeinstellungen für den Druck. Für Druck Typ 2 psi und für Geschwindigkeit Typ 20 Millimeter pro Sekunde in den entsprechenden Boxen. Weisen Sie die Werte für Linienbreite und Linienhöhe 0,24 Millimeter und den Beschleunigungswert 400 Millimeter pro Quadratsekunde zu.
Klicken Sie auf der Registerkarte Volumenmodellierung auf das Cubeobjekt und dann auf das rhCollMA-Material aus dem Materialabschnitt, um es der Würfelform zuzuweisen. Klicken Sie auf der Registerkarte Bioassembly auf die Schaltfläche Druckauftrag senden, um den Druckauftrag an den Bioprinter zu senden. Laden Sie die mit der Zellbiotinte beladene Druckpatrone in das 3-Milliliter-Umgebungs-Pneumatik-Dosierwerkzeug des 3D-Extrusions-basierten Bioprinters.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Kühlen unter der Registerkarte Heizung oder Kühlung steuern auf dem Bildschirm der Bioprinter-Schnittstelle, um die Druckbetttemperatur auf 4 Grad Celsius einzustellen. Beladen Sie die Platte mit dem Stützbad auf das Druckerbett. Klicken Sie auf der Registerkarte Drucken auf dem Bildschirm der Bioprinter-Benutzeroberfläche auf den Druckauftrag und dann auf Start, gefolgt von GO, um den Druckauftrag zu starten.
Belichten Sie die Wellplatte nach dem Drucken 305 Sekunden lang einer 405-Nanometer-Lichtquelle mit einer Intensität von 3 Milliwatt pro Quadratzentimeter, um die Vernetzung der rhCollMA-Biotinte einzuleiten. Nach der Vernetzung die Bohrlochplatte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für mindestens 20 Minuten inkubieren, bis das gesamte Stützbad schmilzt. Saugen Sie das verflüssigte Stützbad vorsichtig ab und ersetzen Sie es durch das Endothelzellmedium.
Inkubieren Sie die Konstrukte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Unmittelbar nach der Entfernung des Stützmaterials des biogedruckten mikrovaskulären Netzwerks legen Sie ein mit Fibronektin beschichtetes PLLA:PLGA-Gefäßgerüst neben die biogedruckte Struktur. Setzen Sie das Gefäßgerüst in den Hauptkanal der biogedruckten Struktur ein.
Inkubieren Sie die zusammengebauten Konstrukte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei Tage. Bereiten Sie eine Zellsuspension von tdTomato-exprimierenden menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen mit Fett in einer Konzentration von 10 Millionen Zellen pro Milliliter vor. Legen Sie einen 20-Mikroliter-Tröpfchen dieser Zellsuspension auf eine hydrophobe Oberfläche.
Legen Sie die Gefäßgerüste vorsichtig auf das Tröpfchen, so dass das Lumen des Gerüsts an einem Ende mit dem Zelltröpfchen in Kontakt kommt. Saugen Sie das Tröpfchen vom gegenüberliegenden Ende des Gerüsts ab und füllen Sie sein Lumen mit der Zellsuspension. Legen Sie das sitzende Gerüst in ein Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie es für 60 Minuten in einen Rotator in einem befeuchteten Inkubator.
Übertragen Sie schließlich das Gerüst in eine 12-Well-Platte und fügen Sie 2 Milliliter Endothelzellmedium hinzu. Die Seitenansicht einer repräsentativen technischen Klappe, die vier Tage nach der Endothelauskleidung des Gefäßgerüsts aufgenommen wurde, ist hier zu sehen. Die biobedruckte Mikrovaskulatur ist grün dargestellt, während die Endothelauskleidung rot dargestellt ist.
Das repräsentative Bild zeigt die Anastomosen zwischen dem biogedruckten Gefäßsystem und der Endothelauskleidung. Die Immunfärbung für das Aktin, die Kerne und die Endothelzellen der glatten Muskulatur nach sieben Tagen Inkubation wird hier gezeigt. Das repräsentative Bild zeigt abgeschlossene Anastomosen der technischen Klappe mit der Oberschenkelarterie einer Ratte vor der Klemmentfernung und nach der Klemmentfernung.
Diese Technik kann verwendet werden, um die Reifung und Integration von 3D-gedruckten Gefäßen in vivo zu untersuchen und die Perfusion des Implantats in der Hintergliedmaße zu überwachen, um das Potenzial und die Sicherheit für seine Verwendung zur Behandlung von Gewebedefekten zu ermitteln.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erstellung einer 3D-gedruckten Gewebelappen mit einem hierarchischen vaskulären Netzwerk, das direkte mikrochirurgische Anastomosen zur Femoralarterie der Ratte ermöglicht. Der Ansatz kombiniert fortschrittliche 3D-Drucktechniken, um die Untersuchung des Verhaltens von Blutgefäßen während der in-vivo-Integration zu erleichtern.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Gewebe-Engineering
- Vaskuläre Biologie
- 3D Bioprinting
Hintergrund
- Konstruierte Lappen benötigen funktionale vaskuläre Netzwerke für eine erfolgreiche Integration.
- Aktuelle Methoden fehlen an effizienten Techniken zur Erstellung vaskularisierter Gewebekonstrukte.
- Diese Studie zielt darauf ab, diese Einschränkungen durch innovative 3D-Druckmethoden zu überwinden.
- Das Verständnis des Verhaltens von Blutgefäßen ist entscheidend für die Entwicklung effektiver Gewebe-Engineering-Strategien.
Zweck der Studie
- Herstellung eines 3D-gedruckten Gewebelappens mit einem hierarchischen vaskulären Netzwerk.
- Ermöglichung einer direkten Anastomose mit den Blutgefäßen des Wirts.
- Bereitstellung einer Plattform für die Untersuchung der Gewebeentwicklung und -integration.
Verwendete Methoden
- Kombination von Mikro- und Mesoskalen-3D-Drucktechniken.
- Vorbereitung von Polymerlösungen und Zellsuspensionen für das Bioprinting.
- Verwendung von Lyophilisation und Lösungsmittelentfernung zur Erstellung von Gerüsten.
- Mikrochirurgische Techniken zur Anastomosierung der konstruierten Lappen mit den Wirtsgefäßen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Herstellung vaskularisierter Gewebelappen mit hierarchischen Netzwerken.
- Nachgewiesene Machbarkeit der direkten Anastomose zur Femoralarterie der Ratte.
- Einblicke in das Verhalten von Blutgefäßen während der in-vivo-Integration.
- Eine Grundlage für zukünftige Studien zur gewebespezifischen Zellinkorporation geschaffen.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode erhöht das Potenzial zur Behandlung großer Gewebedefekte.
- Es eröffnet Möglichkeiten für weitere Forschung zu vaskularisierten Gewebekonstrukten.
- Dieser Ansatz kann für verschiedene Biotinken und Unterstützungsmaterialien angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Engineering hierarchical vascular networks using 3D bioprinting addresses a critical bottleneck in creating functional, implantable tissues for regenerative medicine and reconstructive applications. This approach enables the fabrication of complex, perfusable tissue constructs that can be directly integrated with host vasculature, supporting translational research and preclinical model development. The method enhances predictive confidence in tissue integration and vascularization, informing risk-adjusted portfolio decisions in advanced tissue engineering pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of vascular integration and tissue perfusion in engineered constructs.
- Supports biological de-risking by modeling vessel anastomosis and network maturation.
- Facilitates predictive assessment of tissue viability and integration potential.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible vascularized tissue platforms for compound evaluation.
- Enables quantitative assessment of endothelial and support cell behavior in 3D environments.
- Supports scalability and platform reuse for diverse bioink and cell type screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered tissue models with disease-relevant vascularization and integration endpoints.
- Enables continuity from in vitro tissue development to in vivo implantation and perfusion studies.
- Supports risk-adjusted advancement of tissue constructs for reconstructive and regenerative applications.
Pipeline & Workflow Integration
This combined 3D bioprinting and sacrificial mold approach integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling iterative optimization of vascularized tissue constructs for downstream translational studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on vessel formation, anastomosis, and tissue integration.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs on vascular network assembly and cell viability.
- Analytics: Provides imaging and immunostaining readouts for network connectivity and maturation.
- Translational Research: Bridges in vitro tissue engineering with in vivo perfusion and integration models.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various tissue types and vascularization studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tissue integration and vascular function.
- Operational Value: Standardizes fabrication and assessment of vascularized constructs for reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for tissue engineering programs targeting clinical translation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of tissue constructs for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D bioprinting, cell culture, and microsurgical techniques.
- Demands access to extrusion-based bioprinters, imaging, and analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of bioink formulations and scaffold fabrication.
- Adaptable to different cell types and support materials for diverse tissue models.
- Limited by the need for precise control of vascular network architecture and integration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:04
Vascular Scaffold Fabrication
1:54
Granular Support Bath Preparation and Incorporation of Endothelial Cells and Support Cells with the Bioink
3:09
Bioprinting Microvascular Networks Using rhCollMA Bioink
6:00
Assembling the Bioprinted Microvascular Network with the Vascular Scaffold to Obtain the Engineered Vascularized Flap
7:12
Results: Representative Images of the Assembled Vascularized Flap
7:59
Conclusion
