Name: Herstellung von technischen Gefäßklappen mit 3D-Drucktechnologien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von 3D-gedruckten Gewebe-Klappen mit hierarchischem Gefäßnetz für die direkte mikrochirurgische Anastomose an der Rattenfemoralarterie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Blutgefäßverhalten während der in vivo-Integration.

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Dieses Projekt wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (Finanzhilfevereinbarung Nr. 818808) gefördert. rhCollMA wurde großzügig von CollPlant (Rehovot, Israel) zur Verfügung gestellt. Die Autoren danken der Pre-Clinical Research Authority des Technion für die Unterstützung bei der Tierpflege sowie Janette Zavin, Galia Ben David und Idan Redenski.

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Entwicklung vaskularisierter Gewebe ist eine der größten Herausforderungen des Tissue Engineering20. Aktuelle Methoden zur Herstellung von technischem Gefäßgewebe konzentrieren sich auf die Schaffung einer selbstorganisierten Mikrovaskulatur 21,22,23 oder die Herstellung von mesoskaligen Gefäßgerüsten 24,25 und nicht auf die Wiederherstellung eines Systems hierarchischer Gefäße, das sofort und direkt bei der Implantation durchblutet werden kann 26 . In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, das zwei 3D-Druckmodalitäten verwendet, um ein hierarchisches Gefäßnetzwerk herzustellen, das aus mikroskaligen und mesoskaligen Vaskulaturen besteht. Das Protokoll kombiniert ein 3D-biogedrucktes, selbstorganisiertes mikrovaskuläres Netzwerk mit einem mesoskaligen Gefäßgefäßskelett, wodurch eine implantierbare, vaskularisierte Klappe entsteht. Darüber hinaus wird in diesem Artikel ein Protokoll für die direkte Anastomosion dieser Klappe an der Oberschenkelarterie einer Ratte vorgestellt.
3D-Bioprinting hat in den letzten Jahren aufgrund seiner Vielseitigkeit gegenüber traditionellen Tissue-Engineering-Techniken an Interesse gewonnen. Während dieses Protokoll die Erzeugung eines mikrovaskulären Netzwerks in rhCollMA-Bioink beschreibt, können die verwendeten Methoden mit wenigen Modifikationen auf viele andere Biotinten aus der Fülle von untersuchten und neuartigen Biotinten und Stützbädernangewendet werden 27,28. Wir haben uns aufgrund der Fülle von Typ-I-Kollagen im menschlichen EZM für die Verwendung von rhCollMA als Bioink entschieden, was eine geeignete Umgebung für die Zellanbindung bietet. Darüber hinaus wird es rekombinant in Pflanzen hergestellt und mit Methacrylatgruppen weiter modifiziert, was eine Photopolymerisation und die Bildung stabiler 3D-Hydrogele ermöglicht29,30. Die Photovernetzung wurde durch die Zugabe des Photoinitiators LAP erreicht, der sich als ungiftig erwiesen hat und durch Einwirkung von 405 nm blauem Licht aktiviert wird, wodurch die mögliche Phototoxizität von UV-Licht reduziert wird. Die Verwendung von lichtempfindlichen Biotinten erfordert jedoch die Verwendung eines phenolrotfreien Kulturmediums für die Herstellung der Biotinte und des Trägermaterials. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll die Verwendung von Gelatineträgermaterial, das die High-Fidelity-Extrusion von Biotinten wie rhCollMA ermöglicht. Daher ist es wichtig, die Verwendung von kaltem Medium während der Vorbereitung und der Kühlung des Druckerbetts sicherzustellen. Eine übermäßige Erwärmung kann aufgrund der für die Vernetzung verwendeten Lichtquelle oder durch erhöhte Umgebungstemperaturen auftreten.
Ein extrusionsbasierter Bioprinter wurde hier verwendet, um das biogedruckte Mikrovaskulärnetzwerk zu erstellen, und es gibt derzeit viele kommerziell erhältliche Bioprinter, die ähnliche Konstrukte erzeugen können. Darüber hinaus können die vorgeschlagenen Methoden leicht modifiziert und angewendet werden, um verschiedene Geometrien, Größen und Infill-Muster zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde ein geradliniges Infill-Muster gewählt, um miteinander verbundene Poren zu erzeugen, und dieses kann relativ schnell mit hoher Wiedergabetreue gedruckt werden.
Luftblasen stellen eine große Herausforderung im Extrusions-Bioprinting dar, insbesondere in Trägermaterialien. Daher ist es wichtig, das Vorhandensein und die Bildung dieser Blasen zu minimieren, indem positive Verdrängungspipetten für den Transfer des Trägermaterials, die Vorbereitung der Bioink-Zellsuspension und deren Übertragung auf die Druckpatronen verwendet werden.
In dieser Arbeit wurden humane aus Fett gewonnene Endothelzellen und Stammzellen der Zahnpulpa aufgrund ihrer relativ einfachen Isolierung von Patienten als Stützzellen verwendet. Darüber hinaus wurde eine Gesamtzellkonzentration von 8 x 106 Zellen/ml gewählt, da diese Konzentration nachweislich die am weitesten entwickelten Gefäßnetzwerke etabliert16. Während dieses Protokoll verwendet werden kann, um Mikrovaskulatur unter Verwendung verschiedener Zelltypen und -quellen sowie verschiedener Biotinten zu erzeugen, muss eine Kalibrierung der Zellkonzentration durchgeführt werden, um die besten Bedingungen für die Entwicklung des mikrovaskulären Netzwerks zu schaffen. Darüber hinaus können gewebespezifische Zellen (d.h. Myoblasten oder Osteoblasten) in die Biotinte eingebaut werden, um gewebespezifische vaskularisierte Lappen zu erhalten.
Die Form für das poröse Gefäßgerüst wurde aus 3D-gedrucktem wasserlöslichem Material auf einem handelsüblichen Extrusions-3D-Drucker hergestellt. Dies führt zu einer kostengünstigen Technik, die auf Rapid-Prototyping-Plattformen basiert, so dass viele verschiedene Geometrien und Größen von Gefäßgerüsten schnell untersucht und gescreentwerden können 31. Eine Einschränkung dieser Methode ist jedoch die Auflösungsgrenze der meisten 3D-Drucker32. Mit der sich schnell entwickelnden Industrie rund um die additive Fertigung wird jedoch erwartet, dass sich diese Grenzwerte im Laufe der Zeit verbessern werden. Die Verwendung von organischen Lösungsmitteln für den Herstellungsprozess ist eine weitere Einschränkung des Protokolls, da die meisten organischen Lösungsmittel für Zellen toxisch sind und die Möglichkeit verhindern, das Bioprinting-Verfahren mit dem Herstellungsprozess für Gefäßgerüste zu kombinieren.
Die beschriebene Methode der Aussaat des Lumens des Gerüsts mittels Aspiration im Gegensatz zum Drücken der Zellsuspension hat große Auswirkungen auf die Lokalisation der ausgesäten Zellen. Die Verwendung von Unterdruck ermöglicht eine Endothelisierung des inneren Lumens des Gerüsts und minimiert gleichzeitig das Verschütten der Zellsuspension durch die Perforationen an der Wand des Gerüsts16.
Die beschriebene "Manschettenmethode" für mikrochirurgische Anastomosen kann leicht modifiziert und an verschiedene Gefäßgerüstmaterialien oder -größen sowie an verschiedene Arterien und Venen in einem breiten Maßstab von Tiermodellen angepasst werden. Die Anpassungen des Protokolls würden verschiedene Polyimidrohrgrößen und Nahtgrößen umfassen. Diese Methode erfordert keine Perforation der Gerüstwand, was zur Entwicklung von Defekten führen kann. Diese Arbeit stellt ein Protokoll dar, das auf viele Anwendungen erweitert werden kann. Die kritischen Aspekte dieses Protokolls, zu denen die Herstellung von Meso- und Mikrovaskulatur und deren Montage und Implantation gehören, stellen kritische Aspekte von technischen Klappen sowohl für rekonstruktive Anwendungen als auch für vaskuläre und andere Tissue-Engineering-Studien dar.

Schwere Gewebedefekte werden durch traumatische Verletzungen, angeborene Defekte oder Krankheiten verursacht, und der aktuelle Goldstandard für die Behandlung dieser Defekte ist die Verwendung von autologen Transplantaten, vaskularisierten Gewebelappen und mikrovaskulären freien Lappen als Gewebeersatz. Diese Optionen haben jedoch die Nachteile eines begrenzten Gewebes an der Spenderstelle und der Morbidität an der Spenderstelle1. Daher besteht eine wachsende Nachfrage nach alternativen Gewebeersatzstoffen, mit denen diese Defekte behoben werden können2. Die Dicke der konstruierten Gewebekonstrukte ist durch die Diffusion von Nährstoffen und Gasen in Richtung der Zellen begrenzt, und daher ist ein geeignetes Gefäßnetzwerk für die Erzeugung großer, dicker und richtig genährter Gerüste unerlässlich.
Mehrere Ansätze wurden angewendet, um die Vaskularisierung von technisch hergestellten Implantatenzu fördern 3, einschließlich der In-vivo-Rekrutierung von Gefäßunterstützung durch den Wirt, der Abgabe von Wachstumsfaktoren und Zytokinen innerhalb der Gerüste, der Prävaskularisierung von Implantaten, der Erzeugung eines durchlässigen verzweigten Mikrogefäßbetts unter Verwendung von Mikrostrukturierungstechniken4, der Verwendung von Opfermaterialien für die Bildung von Gefäßkanälen / Netzwerken5 sowie die Erstellung von Kanälen innerhalb der 3D-biogedruckten Konstrukte 5,6. Die Vaskularisierung dicker Gewebe erfordert die Einbeziehung eines hierarchischen Gefäßnetzwerks, das aus Gefäßen auf Makro- und Mikrokapillarebene besteht. Die Gefäße auf Makroebene verteilen das Blut effektiv im gesamten Konstrukt und ermöglichen mikrochirurgische Anastomosen mit den Blutgefäßen des Wirts, während die mikrokapillarschuppigen Gefäße eine Nährstoffdiffusion ermöglichen.
Bioprinting hat in den letzten Jahren aufgrund der Vorteile, die es gegenüber herkömmlichen Tissue-Engineering-Methoden bietet, große Aufmerksamkeit erregt. Gewebe und Organe sind komplexe und komplizierte 3D-Objekte mit einer bestimmten Architektur. Das 3D-Bioprinting mit seiner Fähigkeit, Schichten von Biomaterialien in hoher Auflösung abzuscheiden, ermöglicht die Herstellung komplexer Gewebe- und Organersatzstoffe (z. B. Niere, Lunge, Leber)7. Mehrere Drucktechnologien wurden für das Bioprinting angepasst, darunter extrusionsbasiertes,inkjet-8, lasergestütztes Deposition9,10 und stereolithographiebasiertes11,12-Bioprinting. Die extrusionsbasierten Technologien beruhen auf dem Extrudieren des Materials durch eine Düse, indem Druck auf die der Düse gegenüberliegende Materialoberfläche ausgeübt wird.
Freiform-reversible Einbettung von suspendierten Hydrogelen (FRESH) ist eine Bioprinting-Technik13,14, bei der ein körniges Trägermaterial verwendet wird, in dem das extrudierte Material durch das Stützbad abgeschieden und fixiert wird. Das Stützbad unterstützt die extrudierte, vorvernetzte Biotinte mechanisch bis zur Vernetzung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Stützbad das Extrudieren von niedrigviskosen Materialien ermöglicht, die ihre Form nach der Extrusion und vor der Vernetzungnicht beibehalten können 15. Dies erweitert den Pool der verfügbaren Materialien, die als Biotinten verwendet werden können.
Dieses Papier stellt ein Protokoll für die Erzeugung eines vaskularisierten Lappens vor, der mikroskalige und mesoskalige Vaskulaturen kombiniert. Um dies zu erreichen, werden biogedruckte, selbstassemblierende, mikrovaskuläre Netzwerke in rekombinantem humanem Kollagenmethacrylat (rhCollMA) -Hydrogel erzeugt, das sich dann mit dem Inneren eines größeren, implantierbaren Gefäßgerüsts verbindet, was zu einem vollständig entwickelten Gewebelappen16 führt. Um eine schnelle und direkte Durchblutung von künstlich hergestelltem Gewebe herzustellen, ist eine direkte mikrochirurgische Anastomose der Wirtsgefäße erforderlich. Das Gefäßgestell hat keine ausreichende Nahtretentionsfestigkeit, um mit herkömmlicher mikrochirurgischer Gefäßwandnähte anastomosiert zu werden. Daher beschreiben wir eine "Manschette"17,18,19 Methode, um eine Anastomose mit der gemeinsamen Oberschenkelarterie einer Ratte zu erreichen. Bei dieser Methode werden die Gefäßenden mit umlaufenden Nähten gesichert, ohne dass die Gefäßwand perforiert werden muss.
Obwohl das vorgeschlagene Protokoll zur Untersuchung der hierarchischen Vaskulatur in der rhCollMA-Umgebung erstellt wurde, kann dieser Ansatz erweitert und auf eine Vielzahl neuer Anwendungen angewendet werden. Das Protokoll kann auf das Bioprinting verschiedener gewebespezifischer Zellen in verschiedenen Biotinten angewendet werden. Darüber hinaus können die Geometrie und Größe der Konstrukte leicht an spezifische Anforderungen angepasst werden, z. B. große Geweberekonstruktionen oder biologische Studien.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dioxan</td><td>Biosolve Chemical</td><td>42405</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 0,5" Dosiernadeln mit stumpfer Spitze</td><td>CML-Versorgung</td><td>901-27-050</td><td></td></tr><tr><td>3cc bernsteinfarbenes Spritzenzylinder- und Kolbenset</td><td>Nordson EFD</td><td>7012085</td><td>Braune Spritzen zur Blockierung von Licht und zur Verhinderung einer vorzeitigen Vernetzung</td></tr><tr><td>5-0 AssuCryl PGA absorbale Nahtnaht</td><td></td><td></td><td>Resorbierbares Nahtmaterial für den Wundverschluss auf der Haut</td></tr><tr><td>6-0 Polypropylen-Nahtmaterial</td><td>Assut Fatures</td><td>9351</td><td></td></tr><tr><td>Acland Klemmen</td><td>S& T</td><td>B-1V</td><td></td></tr><tr><td>Adventitia Schere</td><td>S& T</td><td>SAS-15</td><td></td></tr><tr><td>Abgewinkelte Nr. 3 Juwelierzange</td><td>S& T</td><td>JFAL-3-18</td><td></td></tr><tr><td>BioAssemblyBot 400 3D-Bioprinter</td><td>Advanced Solutions</td><td></td><td>ein 6-Achsen-3D-Biodrucker</td></tr><tr><td>Rinderalbumin-Serum Probumin</td><td>Millipore</td><td>&nbsp; 82-045-1</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>vetmarket</td><td>B15100</td><td></td></tr><tr><td>BVOH Filament</td><td>Verbatim</td><td>55903</td><td>ein wasserlösliches Filament mit einem Durchmesser von 1,75 mm</td></tr><tr><td>Klemme zum Anlegen</td><td>einer Pinzette S& T</td><td>CAF-4</td><td></td></tr><tr><td>Stammzellen der Zahnpulpa</td><td>Lonza</td><td>PT-5025</td><td></td></tr><tr><td>Dietrich Bulldog-Klemmen</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>18039-45</td><td></td></tr><tr><td>Di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)</td><td>Carlo Erba Reagenzien</td><td>480141</td><td></td></tr><tr><td>Sezierschere</td><td>S& T</td><td>18039-45</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosespiegel, ohne Phenolrot</td><td>Sartorius</td><td>01-053-1A</td><td></td></tr><tr><td>Duratears</td><td>Alcon</td><td>DJ03</td><td></td></tr><tr><td>ECM Medien + Bullet Kit</td><td>Sciencell</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>Gadot-Gruppe</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Glutaminersatz</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus Cy3-Antikörper</td><td>Jackson</td><td>115-166-072</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium & 5.000 I.E./ml</td> <td>Panpharma-humane</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mikrovaskuläre Fettzellen</td><td>Sciencell</td><td>#7200</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Fibronektin</td><td>Sigma</td><td>F0895-5MG</td><td>Eine Stammkonzentration von 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Isofluran, USP Terrell</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-011-25</td><td></td></tr><tr><td>LifeSupport</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5244</td><td>eine Gelatine-Stützsuspension für FRESH 3D-Bioprinting</td></tr><tr><td>Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td><td></td></tr><tr><td>Low-Glucose DMEM</td><td>Biological Industries</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>MICROMAN E M1000E, 100-1.000 &micro; L</td><td>Gilson</td><td>FD10006</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-SMA-Antikörper</td><td>Dako</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140068</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd-Lösung 4% in PBS</td><td>ChemCruz</td><td>&nbsp; SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Nystatin-Lösung</td><td>Biological Industries</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>Phospat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylenoxid), MW 250.000 bis 400.000</td><td>Acros Organische Stoffe</td><td>178602500</td><td></td></tr><tr><td>Poly(L-Milchsäure), IV 5,0 dl/g (PLLA)</td><td>Polysciencse, Inc.</td><td>18582-10</td><td></td></tr><tr><td>Polyimidschlauch, ID: 0.0249", OD: 0.0273"</td><td>Cole-Parmer</td><td>95820-05</td><td>Ein dünnwandiges Rohr zur Herstellung von Manschetten für mikrochirurgische Anastomosen</td></tr><tr><td>Prusa I3 MK2.5 3D-Drucker</td><td>Prusa Research</td><td>http://www.prusa3d.com/</td> <td>ein beliebter kommerzieller 3D-Drucker</td></tr><tr><td>Resomer&nbsp; RG 503 H, Poly(D,L-Lactid-co-glycolide) (PLGA)</td><td>Evonik Industries</td><td>719870</td><td></td></tr><tr><td>rhCollMA</td><td>CollPlant</td><td>https://collplant.com/</td> <td>großzügig zur Verfügung gestellt von CollPlant (Rehovot, Israel)</td></tr><tr><td>Nadelhalter mit rundem Griff</td><td>S& T</td><td>B-15-8</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff - #3</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>kleine feine gerade Schere</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Biosolve Chemisches</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch (NaH2PO4)</td><td>Riedel-de Haen</td><td>4276</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks</td><td>Dassault Systems</td><td></td><td>CAD-Software</td></tr><tr><td>Gerade Nr. 3 Juwelierzange</td><td>S& T</td><td>JF-3-18</td><td></td></tr><tr><td>Gerade Zange mit Wellenschliff</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Skalpellklinge Nr. 15</td><td>Swann-Morton Limited</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>BioLab LTD</td><td>57836</td><td></td></tr><tr><td>TSIM</td><td>Advanced Solutions</td><td></td><td>3D-Schneide- und Designsoftware für den BioAssembly Bot</td></tr><tr><td>Gefäßdilatator</td><td>S& T</td><td>D-5a.1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Tivato 700 Operationsmikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von technischen gefäßklappen mit 3d-drucktechnologien

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Die Entwicklung implantierbarer, funktioneller, dicker Gewebe erfordert die Entwicklung eines hierarchischen Gefäßnetzwerks. 3D-Bioprinting ist eine Technologie, die verwendet wird, um Gewebe zu erzeugen, indem Schicht für Schicht druckbare Biomaterialien, sogenannte Biotinten, und Zellen in geordneter und automatischer Weise hinzugefügt werden, was es ermöglicht, hochkomplizierte Strukturen zu schaffen, die traditionelle Tissue-Engineering-Techniken nicht erreichen können. Daher ist der 3D-Bioprinting ein ansprechender In-vitro-Ansatz , um die Struktur des nativen Gefäßkomplexes nachzuahmen, der von millimetermetrischen Gefäßen bis hin zu mikrovaskulären Netzwerken reicht. 
Fortschritte beim 3D-Bioprinting in granularen Hydrogelen ermöglichten die hochauflösende Extrusion von niedrigviskosen extrazellulären Matrix-basierten Bioinks. Diese Arbeit präsentiert einen kombinierten 3D-Bioprinting- und Schimmelpilz-basierten 3D-Druckansatz zur Herstellung von vaskularisierten Gewebeklappen. Das 3D-Bioprinting von Endothel- und Stützzellen unter Verwendung von rekombinanter Kollagen-Methacrylat-Biotinte in einem Gelatine-Stützbad wird zur Herstellung eines selbstorganisierten Kapillarnetzwerks verwendet. Diese gedruckte Mikrovaskulatur ist um ein mesoskaliges gefäßartiges poröses Gerüst herum aufgebaut, das mit einer 3D-gedruckten Opferform hergestellt und mit Endothelzellen ausgesät ist. 
Diese Anordnung induziert das Endothel des mesoskaligen Gefäßes, mit dem umgebenden Kapillarnetzwerk zu anastomosieren und ein hierarchisches Gefäßnetzwerk innerhalb einer künstlichen Gewebeklappe zu bilden. Der konstruierte Lappen wird dann direkt durch chirurgische Anastomose in eine Ratten-Oberschenkelarterie implantiert, wobei eine Manschettentechnik verwendet wird. Die beschriebenen Methoden können für die Herstellung verschiedener vaskularisierter Gewebeklappen für den Einsatz in der Rekonstruktionschirurgie und in Vaskularisationsstudien erweitert werden.

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer technischen Lappe, die aus einem Gefäßgestell (Abbildung 1Ai) und einer biogedruckten Mikrovaskulatur (Abbildung 1Aii) besteht, die zusammengesetzt wurden, um mesoskalige und mikroskalige Vaskulaturen zu erreichen (Abbildung 1Aiii). Nach dem Protokoll wurden BVOH-Formen des Gefäßgerüsts entworfen und in 3D gedruckt (Abbildung 1B, C). Die erhaltenen gedruckten Strukturen wurden visuell auf kleine BVOH-Stränge untersucht, die sich in den leeren Räumen der Formen befinden könnten (Abbildung 1D). Diese Stränge weisen in der Regel auf falsche Materialeinstellungen hin oder darauf, dass der BVOH Feuchtigkeit aufgenommen hat. Diese Stränge sollten entfernt werden, da sie zu einer unvollständigen Füllung der Form und zu strukturellen Defekten im resultierenden Gefäßgerüst führen können. Als nächstes wurden die Formen mit PLLA: PLGA-Lösung gefüllt, gefolgt von der Gefriertrocknung und den Waschschritten, wie im Protokoll beschrieben. Das erhaltene PLLA:PLGA-Gefäßgerüst wurde visuell inspiziert, um die Integrität der Gefäßwand und die Durchgängigkeit des Lumens zu überprüfen (Abbildung 1E).
Eine neutralisierte rhCollMA-Biotinte in einer Konzentration von 10 mg/ml wurde hergestellt und im Verhältnis 1:1 mit der PEO:LAP-Lösung kombiniert. Menschliche fette mikrovaskuläre Endothelzellen, die mit Zs-Green1 markiert waren, und Stammzellen der Zahnpulpa wurden mit der rhCollMA-Biotinte resuspendiert, und die Lösung wurde in eine Druckpatrone und auf den Drucker geladen. Kastenformen mit einem zentralen Kanal mit einem geradlinigen Muster (Abbildung 1D) wurden im Gelatineträgerbad biobedruckt. Nach dem Druck wurden die Konstrukte vernetzt, das Stützbad aufgelöst und gewaschen. Nach 4 Tagen Kultur wurden die Konstrukte live fotografiert, um die Selbstorganisation des mikrovaskulären Netzwerks zu überprüfen. Abbildung 1D zeigt ein Beispiel für ein hochentwickeltes mikrovaskuläres HAMEC-ZsGreen1-Netzwerk im biogedruckten Konstrukt.
Als nächstes wurde ein mit Fibronektin beschichtetes Gefäßgerüst in den zentralen Kanal des gedruckten Konstrukts eingeführt (Abbildung 2A). Die zusammengesetzten Konstrukte wurden 2 Tage lang kultiviert, wobei die Zellen das Gel zusammenziehen und es fest am Gefäßgerüst befestigen. Dann wurde das Gefäßgerüst mit HAMECs ausgekleidet, die gemäß dem Protokoll tdTomato exprimierten. Nach 7 Tagen Kultur wurden die Konstrukte fixiert und abgebildet. Abbildung 2B zeigt eine Seitenansicht der zusammengesetzten Konstrukte, in der die Endothelzellen in der biogedruckten Mikrovaskulatur grün dargestellt sind, während die Endothelauskleidung des Gefäßgerüsts rot dargestellt ist. Das Bild zeigt eine grüne mikrovaskuläre Selbstorganisation im biogedruckten Gel, während das Gefäßgestell mit roten Endothelzellen ausgekleidet ist. Bei höherer Vergrößerung werden Sprossen aus der roten Endothelauskleidung gesehen, die mit dem biogedruckten mikrovaskulären Netzwerk sprießen und anastomosieren (Abbildung 2C). Als nächstes wurden die Konstrukte für α-glattes Muskelaktin (SMA) als Marker für die Stammzellen der Zahnpulpa gefärbt. Nach der Immunfärbung wurden die Konstrukte mit einem konfokalen Laser-Rastermikroskop abgebildet (Abbildung 2D).
Schließlich, nach 7 Tagen Kultur, wurden die technischen Klappen mikrochirurgisch an der Oberschenkelarterie einer Ratte anastomosiert, wie im Protokoll beschrieben. Ein Video eines repräsentativen Verfahrens ist im Supplemental Video S1 zu sehen. Abbildung 2E zeigt ein repräsentatives Bild einer abgeschlossenen Anastomose vor dem Entfernen der Klemme, und Abbildung 2F zeigt ein repräsentatives Bild der Anastomosenstelle nach der Klemmentfernung und Hämostase. Vor dem Wundverschluss sollten keine Blutungen sichtbar sein.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63920/63920fig01.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative Bilder der hergestellten meso- und mikroskaligen Gefäße. (A) Schematischer Überblick über die Schritte des Protokolls. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung16. (B) CAD-Konstruktion für die Opferform des Gefäßgerüsts. (C) Seitenansicht einer repräsentativen 3D-gedruckten Opferform (Maßstabsleiste = 0,5 mm). (D) Draufsicht der Opferform (Maßstabsleiste = 0,5 mm) (E) Repräsentatives Gefäßgefäßgefäß, das nach dem Beschreibungsprotokoll hergestellt wird (Maßstabsleiste = 5 mm). (F) CAD-Konstruktion für das 3D-biogedruckte mikrovaskuläre Netzwerk rhCollMA. Rasterlinien = 1 mm. (G) Repräsentatives Bild eines hochentwickelten biogedruckten Gefäßnetzwerks, das HAMEC-ZsGreen1 in Grün zeigt. Maßstabsleiste = 200 μm. Abkürzungen: CAD = Computer-Aided Design; rhCollMA = rekombinantes humanes Kollagenmethacrylat; HAMEC = humane adipe mikrovaskuläre Endothelzellen; PLLA = Poly-L-Milchsäure; PLGA = Polymilch-Co-Glykolsäure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/63920fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63920/63920fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Bilder der zusammengesetzten vaskularisierten Klappe . (A) Ein Foto einer repräsentativen Montage von biogedruckten Mikrovaskulaturen und dem Gefäßgerüst. Maßstabsleiste = 1 mm. (B) Seitenansicht einer repräsentativen technischen Lappe, die 4 Tage nach der Endothelauskleidung des Gefäßgerüsts aufgenommen wurde. Die biogedruckte Mikrovaskulatur ist grün dargestellt (HAMEC-ZsGreen1), während die Endothelauskleidung rot dargestellt ist (HAMEC-tdTomato). Maßstabsleiste = 1 mm. (C) Repräsentatives Bild von Anastomosen zwischen der biogedruckten Vaskulatur in Grün und der Endothelauskleidung in Rot. Maßstabsleiste = 200 μm. (D) Repräsentatives Bild der Immunfärbung für glattes Muskelaktin (rot), Kerne (blau) und Endothelzellen (grün) nach 7 Tagen Inkubation. Maßstabsleiste = 0,1 mm. (E) Repräsentatives Bild einer abgeschlossenen Anastomose der technischen Klappe mit der Oberschenkelarterie einer Ratte vor dem Entfernen der Klemme und (F) nach der Klemmentfernung. Abkürzungen: HAMEC = Human adipose microvascular endothelial cells; SMA = Smooth Muscle Actin; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/63920fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzendes Video S1: Repräsentatives mikrochirurgisches Verfahren zur Anastomosion des Gefäßmusters an der Oberschenkelarterie einer Ratte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/supplementary%20video%201%20(1).mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>

Konstruierte Klappen erfordern ein integriertes funktionelles Gefäßnetzwerk. In diesem Protokoll stellen wir eine Methode zur Herstellung einer 3D-gedruckten Gewebeklappe vor, die ein hierarchisches Gefäßnetzwerk und seine direkten mikrochirurgischen Anastomosen an der Oberschenkelarterie der Ratte enthält.

Herstellung von technischen Gefäßklappen mit 3D-Drucktechnologien

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Unser Protokoll ermöglicht es Forschern, hierarchische Gefäßnetzwerke innerhalb einer vollständig entwickelten und implantierbaren Klappe zu generieren, was den Weg für neue Studien zum Verhalten von Blutgefäßen unter Integration in vivo ebnete. Diese Technik kombinierte die Vielseitigkeit von zwei 3D-Drucktechnologien, um Gefäße auf Mikro- und Mesoskala herzustellen und zusammenzubauen, die mittels Mikrochirurgie direkt mit Wirtsgefäßen anastomosiert werden können. Vollständig entwickelte vaskularisierte Lappen können zur Behandlung großer Gewebedefekte sowie zur Untersuchung von Gewebeentwicklungen und -integrationen eingesetzt werden.Die vorgeschlagenen Methoden können erweitert werden, um den Einbau gewebespezifischer Zellen zu untersuchen und die Verwendung verschiedener Bioink- und Trägermaterialien zu bewerten. Beginnen Sie mit dem Füllen der BVOH-Form mit 30 Mikrolitern der Polymerlösung. Zentrifugieren Sie die Form bei 100 mal g für 2 Minuten und füllen Sie die Form mit weiteren 20 Mikrolitern der Polymerlösung, um eine vollständige Abfüllung zu gewährleisten.Frieren Sie die gefüllten Formen bei minus 80 Grad Celsius für mindestens 30 Minuten ein, um sicherzustellen, dass die gesamte Polymerlösung gefriert. Entfernen Sie das Lösungsmittel aus den Schimmelpilzen, indem Sie sie über Nacht lyophilisieren. Um das Opferformmaterial zu entfernen, geben Sie die Formen nach dem Gefriertrocknungsprozess unter sanftem Rühren in ein 5-Liter-Deionwasserbad.Ersetzen Sie das Wasser im Bad, wenn es trüb wird. Wenn sich alle BVOH aufgelöst haben, trocknen Sie die Gerüste an der Luft und lagern Sie sie bis zur Verwendung in einer Vakuumkammer. Übertragen Sie etwa 4 Milliliter des vorbereiteten, verdichteten Trägermaterials mit einer Verdrängerpipette in jedes Bohrloch einer 12-Well-Platte.Klopfen Sie auf die Bohrlochplatte auf eine harte Oberfläche, um das Stützmaterial zu zwingen, sich gleichmäßig im Bohrloch zu verteilen. Bereiten Sie eine Suspension vor, die 2 Millionen HAMEC-ZsGreen und 6 Millionen Stammzellen der Zahnpulpa in 10 Millilitern Endothelzellmedium enthält. Zentrifen Sie die Zellsuspension bei 200 mal g für 4 Minuten, um ein Zellpellet zu erhalten, dann saugen Sie das überstehende Medium ab und suspendieren Sie das Zellpellet in 1 Milliliter rhCollMA-Biotinte, um eine Biotinte mit einer Gesamtzellkonzentration von 8 Millionen Zellen pro 1 Milliliter Biotinte zu erhalten.Bringen Sie eine Nadel mit einem Innendurchmesser von 0,22 Millimetern an eine 3-Milliliter-Bernsteindruckpatrone und legen Sie die Patrone in ein konisches 50-Milliliter-Rohr. Übertragen Sie 1 Milliliter der Zell-Bioink-Mischung auf die Druckpatrone, indem Sie sie von oben mit einer Verdrängungspipette füllen, um Blasen zu reduzieren. Setzen Sie die Druckpatrone in das entsprechende Werkzeug am Bioprinter ein.Skizzieren Sie ein 2D-Muster eines 4-Millimeter-Quadrats, das einen kreisförmigen Kanal mit einem Durchmesser von 2 Millimetern in der Mitte enthält. Extrudieren Sie die Skizze um 4 Millimeter, um einen 4-Millimeter-Würfel mit einem zentralen Kanal zu erhalten. Exportieren Sie dieses Objekt als STL-Datei.Importieren Sie eine 12-Well-Plate-STL-Vorlage in die Registerkarte Solid Modeling in der Bioprinter-Slicing-Software und platzieren Sie sie im dafür vorgesehenen Bereich des virtuellen Druckbetts. Importieren Sie die STL-Datei der Würfelform in die Registerkarte Volumenmodellierung in der Bioprinter-Slicing-Software. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen Externen Datenschnitt verwenden, gefolgt von Datenschnitt konfigurieren im Abschnitt Objekteigenschaft.Wählen Sie im Popup-Fenster ein geradliniges Muster für das Füllmuster aus und geben Sie 30% in die Fülldichte ein, und klicken Sie auf Akzeptieren. Klicken Sie auf den Würfel und bewegen Sie ihn mit der Maus, um eine Kopie der Würfelform in jeden gewünschten virtuellen Brunnen zu legen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Material hinzufügen auf der Registerkarte Materialien der Bioprinter-Schneidesoftware, um neue Materialeinstellungen für rhCollMA bioink zu erstellen.Wählen Sie die Materialeinstellungen für den Druck. Für Druck Typ 2 psi und für Geschwindigkeit Typ 20 Millimeter pro Sekunde in den entsprechenden Boxen. Weisen Sie die Werte für Linienbreite und Linienhöhe 0,24 Millimeter und den Beschleunigungswert 400 Millimeter pro Quadratsekunde zu.Klicken Sie auf der Registerkarte Volumenmodellierung auf das Cubeobjekt und dann auf das rhCollMA-Material aus dem Materialabschnitt, um es der Würfelform zuzuweisen. Klicken Sie auf der Registerkarte Bioassembly auf die Schaltfläche Druckauftrag senden, um den Druckauftrag an den Bioprinter zu senden. Laden Sie die mit der Zellbiotinte beladene Druckpatrone in das 3-Milliliter-Umgebungs-Pneumatik-Dosierwerkzeug des 3D-Extrusions-basierten Bioprinters.Klicken Sie auf die Schaltfläche Kühlen unter der Registerkarte Heizung oder Kühlung steuern auf dem Bildschirm der Bioprinter-Schnittstelle, um die Druckbetttemperatur auf 4 Grad Celsius einzustellen. Beladen Sie die Platte mit dem Stützbad auf das Druckerbett. Klicken Sie auf der Registerkarte Drucken auf dem Bildschirm der Bioprinter-Benutzeroberfläche auf den Druckauftrag und dann auf Start, gefolgt von GO, um den Druckauftrag zu starten.Belichten Sie die Wellplatte nach dem Drucken 305 Sekunden lang einer 405-Nanometer-Lichtquelle mit einer Intensität von 3 Milliwatt pro Quadratzentimeter, um die Vernetzung der rhCollMA-Biotinte einzuleiten. Nach der Vernetzung die Bohrlochplatte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für mindestens 20 Minuten inkubieren, bis das gesamte Stützbad schmilzt. Saugen Sie das verflüssigte Stützbad vorsichtig ab und ersetzen Sie es durch das Endothelzellmedium.Inkubieren Sie die Konstrukte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Unmittelbar nach der Entfernung des Stützmaterials des biogedruckten mikrovaskulären Netzwerks legen Sie ein mit Fibronektin beschichtetes PLLA:PLGA-Gefäßgerüst neben die biogedruckte Struktur. Setzen Sie das Gefäßgerüst in den Hauptkanal der biogedruckten Struktur ein.Inkubieren Sie die zusammengebauten Konstrukte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei Tage. Bereiten Sie eine Zellsuspension von tdTomato-exprimierenden menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen mit Fett in einer Konzentration von 10 Millionen Zellen pro Milliliter vor. Legen Sie einen 20-Mikroliter-Tröpfchen dieser Zellsuspension auf eine hydrophobe Oberfläche.Legen Sie die Gefäßgerüste vorsichtig auf das Tröpfchen, so dass das Lumen des Gerüsts an einem Ende mit dem Zelltröpfchen in Kontakt kommt. Saugen Sie das Tröpfchen vom gegenüberliegenden Ende des Gerüsts ab und füllen Sie sein Lumen mit der Zellsuspension. Legen Sie das sitzende Gerüst in ein Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie es für 60 Minuten in einen Rotator in einem befeuchteten Inkubator.Übertragen Sie schließlich das Gerüst in eine 12-Well-Platte und fügen Sie 2 Milliliter Endothelzellmedium hinzu. Die Seitenansicht einer repräsentativen technischen Klappe, die vier Tage nach der Endothelauskleidung des Gefäßgerüsts aufgenommen wurde, ist hier zu sehen. Die biobedruckte Mikrovaskulatur ist grün dargestellt, während die Endothelauskleidung rot dargestellt ist.Das repräsentative Bild zeigt die Anastomosen zwischen dem biogedruckten Gefäßsystem und der Endothelauskleidung. Die Immunfärbung für das Aktin, die Kerne und die Endothelzellen der glatten Muskulatur nach sieben Tagen Inkubation wird hier gezeigt. Das repräsentative Bild zeigt abgeschlossene Anastomosen der technischen Klappe mit der Oberschenkelarterie einer Ratte vor der Klemmentfernung und nach der Klemmentfernung.Diese Technik kann verwendet werden, um die Reifung und Integration von 3D-gedruckten Gefäßen in vivo zu untersuchen und die Perfusion des Implantats in der Hintergliedmaße zu überwachen, um das Potenzial und die Sicherheit für seine Verwendung zur Behandlung von Gewebedefekten zu ermitteln.

fabrication-engineered-vascular-flaps-using-3d-printing

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Bisher werden dicke Gewebedefekte typischerweise durch das Auftragen von autologen Gewebelappen oder manipuliertem Gewebe rekonstruiert. In diesem Protokoll stellen wir eine neue Methode zur Konstruktion von vaskularisierten Gewebelappen vor, die einen autologen Stiel tragen und als Ersatz für autologe Lappen dienen sollen.

Engineered Vaskularisierte Muskellappen

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Die Skalierung von Engineered Gefäßprothesen Mit 3D-gedruckte Führer und den Ring Stapelverfahren

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