Dreidimensionale Bildgebung von tumortragendem Gewebe mit dem iterativen Bleaching erweitert den Multiplexitätsansatz

Diese Forschung konzentriert sich auf die Identifizierung von Angriffspunkten für immunmodulatorische Medikamente und komplexe solide gastrointestinale Tumoren. Die Analyse der zellulären Landschaft der Tumormikroumgebung ist absolut entscheidend für das Verständnis der Anfälligkeit für Behandlungen wie Immuntherapien. Einzelzellsequenzierung und Durchflusszytometrie helfen bei der Charakterisierung der Mikroumgebung des Tumors, aber es fehlt der räumliche Kontext. In jüngster Zeit sind Multiplex-Bildgebungs- und Transkriptomik-Plattformen entstanden, um die Mikroumgebung des Tumors in ihrem In-vivo-Kontext zu untersuchen.

Die verfügbaren Multiplex-Technologien zur Analyse der Tumormikroumgebung, ob iterativ oder All-in-One, sind auf zwei Dimensionen beschränkt. Dieses Protokoll erweitert die Charakterisierung in die Tiefendimension und bietet Einblicke über einzelne FFPE- oder Schnellschnitte hinaus.

[Erzähler] Zu Beginn werden die Gewebeblätter in einen Probenbecher mit warmem Erntemedium umgefüllt und auf eine Heizplatte am Vorbereitungstisch gelegt. Montieren Sie das Gewebe auf Plattformen in einer 15 Zentimeter großen Platte, die das Erntemedium enthält. Legen Sie das tumortragende Gewebe vorsichtig mit der mesothelialen Seite nach oben über die kleine Öffnungsseite der Plattform und befestigen Sie es mit einer 2-0-Seidennaht. Legen Sie die vorbereitete Gewebeplattform umgekehrt vollständig in eine 24-Well-Platte mit Erntemedium ein. Zur Fixierung geben Sie 10 Milliliter Fixiermittel in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 30 Millilitern kaltem PBS, um 40 Milliliter Fixierpuffer herzustellen. Übertragen Sie das auf Plattformen montierte Gewebe mit einer Pinzette in den Fixierpuffer. Und 24 Stunden bei 4 Grad Celsius inkubieren. Dekantieren Sie das Fixiermittel. Ersetzen Sie es durch 40 Milliliter kaltes PBS. Und 10 Minuten bei 4 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie zum Färben 1 Milliliter Blockierungspuffer in eine Vertiefung und setzen Sie die Gewebeplattform ein. Mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einer Wippe blockieren, die auf eine niedrige Drehzahl von 30 U/min eingestellt ist. Bereiten Sie 0,8 Milliliter Antikörper-Farbstofflösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor und zentrifugieren Sie sie zwei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 10.000 g. 0,75 Milliliter des Überstands werden in eine saubere Vertiefung einer 9-Well-Inkubationsplatte überführt. Und setzen Sie eine gewaschene Plattform ein. Wickeln Sie die Platte in Alufolie ein. Und inkubieren Sie mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einer Wippe, die auf eine niedrige Drehzahl von 30 U/min eingestellt ist. Waschen Sie die Plattform in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen mit 40 Millilitern PBS 10 Minuten lang bei 4 Grad Celsius. Geben Sie 0,1 Milliliter PBS in die Mitte des Glasbodens einer 3,5 Zentimeter großen Bildgebungsschale und stellen Sie es beiseite. Schrauben Sie den Höhenverstellring locker im Uhrzeigersinn in den Außendeckel ein. Montieren Sie die Plattform in den inneren Kunststoffhalter, um die Ausrichtung der Kerbnut zu gewährleisten. Sichern Sie die Plattform mit dem Schieber. Setzen Sie den zusammengebauten Bildgebungsadapter auf die Glasbodenschale und senken Sie den Höhenverstellring vorsichtig ab, bis das Gewebe den Puffer berührt. Sobald der optimale Abstand zum Glas erreicht ist, geben Sie 0,2 Milliliter PBS mit der Unterseite nach oben auf das Gewebe, um eine Austrocknung des Gewebes während der Bildgebung zu verhindern. Starten Sie die Bildaufnahmesoftware. Wählen Sie das entsprechende Objektiv aus, z. B. 20X oder 40X, und fügen Sie das entsprechende Immersionsmedium hinzu. Wählen Sie die Bildaufnahmeparameter aus, z. B. eine Scangeschwindigkeit von 600 Hertz, eine XY-Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln, dreizeilige Mittelwerte und einen bidirektionalen Scan. Wählen Sie die passenden Laserlinien aus oder passen Sie den Weißlichtlaser an die Anregungs- und Emissionsspektren der für die Färbung verwendeten Fluorophore an. Setzen Sie die zusammengebaute Bildgebungsschale in den Probenhalter auf dem Mikroskoptisch ein. Zentrieren Sie die Probe mit dem XY-Regler, bringen Sie das Objektiv an das Deckglas heran und starten Sie die Bildaufnahme. Führen Sie nach jeder Bildgebungsrunde einen Bleichschritt durch. Bereiten Sie 5 Milliliter Lithiumborhydridlösung mit 1,5 Milligramm pro Milliliter in destilliertem Wasser vor und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie 1 Milliliter der Lithiumborhydridlösung in eine saubere Vertiefung der 9-Well-Inkubationsplatte und setzen Sie die gewaschene Plattform 60 Minuten lang bei Raumtemperatur ein. Waschen Sie die Plattform kurz in 20 Millilitern PBS in einer konischen Tube. Überprüfen Sie, ob das verbleibende Fluoreszenzsignal mit der höchsten Lasereinstellung für die Z-Kompensation verwendet wird. Eine tumortragende Peritonealprobe, die mit der ersten Runde der iterativen Bleaching-Extends-Multiplexität oder IBEX 1-Panel zur Visualisierung gefärbt wurde, ist hier dargestellt. Die Tumorläsionen wurden als rosettenartige Strukturen identifiziert, die für CD44 und Podoplanin doppelt positiv waren und deren Kernanordnungen für papilläre Mesotheliome charakteristisch sind. Hochauflösende Immunfluoreszenzbilder ausgewählter Regionen aus der tumortragenden Peritonealprobe sind hier zu sehen. Diese Bilder zeigen Tumorregionen und Schnittstellen zwischen Tumortertiär und lymphatischer Struktur, was eine konsistente Infiltration von Immunzellen mit einer hohen Dichte an CD45-positiven Zellen zeigt. Diese Abbildung zeigt die iterative Immunfluoreszenzfärbung über die IBEX-Zyklen eins bis sechs und veranschaulicht die räumliche Verteilung von Immun- und Strukturmarkern innerhalb der Schnittstelle zwischen Tumorläsion und tertiärer lymphatärer Struktur. Hier werden die maximalen Projektionen verschiedener optischer Schnitte dargestellt. Diese 3D-Bildgebung bestätigte, dass sich Tumorläsionen und tertiäre lymphoide Strukturen in unterschiedlichen Z-Tiefen befinden, was die Grenzen der 2D-Bildgebung bei der Erfassung komplexer Gewebearchitekturen aufzeigt.