Name: Erweiterung des Verständnisses der Tumormikroumgebung mittels massenspektrometrischer Bildgebung von formalinfixierten und paraffineingebetteten Gewebeproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Massenspektrometrie-Bildgebung für Tumormikroumgebungen mit formalinfixierten und paraffineingebetteten Proben. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Charakterisierung von bis zu 40 Markern mit Einzelzellauflösung.

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Die Autoren danken Don Norwood von Editing Services, Research Medical Library bei MD Anderson für die Bearbeitung dieses Artikels und dem Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory am Department of Translational Molecular Pathology bei MD Anderson. Diese Veröffentlichung resultierte zum Teil aus der Forschung, die durch die wissenschaftliche und finanzielle Unterstützung für das Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) ermöglicht wurde, das durch das National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) dem University of Texas MD Anderson Cancer Center Cancer Immune Monitoring and Analysis Center (CIMAC) zur Verfügung gestellt wurde.

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<li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Die umfassende Aufklärung der komplexen, komplizierten Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Komponenten eines TME bleibt ein zentrales Ziel der Krebsforschung. Die Hersteller haben im Rahmen dieser Bemühungen zahlreiche Multiplex-Assays eingeführt, insbesondere in den letzten 5 Jahren. Die multiplexierte räumliche Analyse ist ein vielseitiges und leistungsfähiges Werkzeug, das die gleichzeitige Kategorisierung mehrerer Ziele erleichtert und gleichzeitig die strukturelle Morphologie in Tumorproben bewahrt. Räumlich...

Die Bedeutung der zahlreichen Zelltypen, die klonale Tumorpopulationen umgeben, ist ein entscheidendes Element bei der Kategorisierung der Karzinogenese. Das Interesse an der Aufklärung dieser Zusammensetzung und Wechselwirkungen der Tumormikroumgebung (TME) ist nach der Etablierung der immunbasierten Therapie als Teil des Krebsbehandlungsarsenals kontinuierlich gestiegen. Daher haben sich die Behandlungsstrategien von einem tumorzentrierten Ansatz zu einem TME-zentrierten Ansatz verlagert1.
Die Bemühungen, die Rolle von Immunzellen bei der Tumorüberwachung und Krebsentstehung aufzuklären, haben in den letzten Jahren auffallend zugenommen 2,3. In der medizinischen Forschung entstand eine Vielzahl von Methoden, darunter zytometrische Methoden und Singleplex- und Multiplex-Bildgebungstechnologien, als Teil dieses Versuchs, die einzigartigen Wechselwirkungen mehrerer Elemente von TMEs zu entschlüsseln.
Bahnbrechende Methoden wie die Durchflusszytometrie (erfunden in den 1960er Jahren), die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und die Massenzytometrie konzentrieren sich hauptsächlich auf die Identifizierung und Quantifizierung von TME-Komponenten4. Obwohl zytometrische quantitative Techniken eine Phänotypisierung der Immunlandschaft ermöglichen, ist die Bestimmung der zellulären räumlichen Verteilung unmöglich. Umgekehrt erhalten Methoden wie die Standard-Singleplex-Immunhistochemie die Gewebearchitektur und ermöglichen es den Forschern, die zelluläre Verteilung zu analysieren, obwohl eine reduzierte Anzahl von Zielen in einem einzelnen Gewebeabschnitt eine Einschränkung dieser Methoden darstellt 5,6. In den letzten Jahren haben sich Multiplex-Bildgebungstechnologien für die Einzelzellauflösung wie Multiplex-Immunfluoreszenz, Barcoding-Fluoreszenzbildgebung und bildgebende Massenspektrometrie als umfassende Strategien zur Gewinnung von Informationen über die gleichzeitige Markerfärbung unter Verwendung desselbenGewebeabschnitts 7 herausgestellt.
Hier stellen wir eine Technologie vor, die metallmarkierte Antikörper und sekundäre Ionenmassenspektrometrie koppelt und die Quantifizierung der Einzelzellauflösung, die Marker-Coexpression (Phänotypisierung) und die räumliche Analyse unter Verwendung formalinfixierter, paraffineingebetteter (FFPE) und frisch gefrorener (FF) Gewebeproben ermöglicht 8,9. FFPE-Proben sind die am häufigsten verwendeten Materialien für die Gewebearchivierung von Proben und stellen eine leichter verfügbare Ressource für gemultiplexte Bildgebungstechnologien dar als frisch gefrorene Proben10. Darüber hinaus bietet diese Technologie die Möglichkeit, Bilder Monate später wieder aufzunehmen. Hier besprechen wir unsere Färbe- und Bildverarbeitungsprotokolle mit FFPE-Gewebeproben.

<table><tbody><tr><td>100% Reagenzalkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8382</td><td></td></tr><tr><td>95% Reagenzalkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3404</td><td></td></tr><tr><td>80% Reagenzalkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3279</td><td></td></tr><tr><td>70% Reagenzalkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R315</td><td></td></tr><tr><td>20X TBS-T</td><td>Ionpath</td><td>567005</td><td></td></tr><tr><td>10X Low-Barium PBS pH 7,4</td><td>Ionpath</td><td></td><td></td>567004</tr><tr><td>10X Tris pH 8,5&nbsp;</td><td>Ionpath</td><td>567003</td><td></td></tr><tr><td>4°; C Kühlschrank</td><td>ThermoScientific</td><td>REVCO</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere P10</td><td>Olympus</td><td>24-401</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere P20</td><td>Olympus</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere P200</td><td>Olympus</td><td>24-412</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere P1000</td><td>Olympus</td><td>24-430</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugalfilter Ultrafree-MC</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Deionisiertes H2O-Ionenpfad</td><td></td>- <td>567002</td><td></td></tr><tr><td>Eselserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>EasyDip Objektträger-Färbeglas,</td><td>Grünelektronenmikroskopie Sciences</td><td>71385-G</td><td></td></tr><tr><td>EasyDip Objektträger-Färbegefäß, Gelbe</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>71385-Y</td><td></td></tr><tr><td>EasyDip Objektträger-Färbeset (Glas+Rack), Weiß</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>71388-01</td><td></td></tr><tr><td>EasyDip Edelstahlhalter</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>71388-50</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd 70% EM-Qualität</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>16360</td><td></td></tr><tr><td>Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) Puffer: 10X Tris mit EDTA, pH 9</td><td>Dako</td><td>S2367</td><td></td></tr><tr><td>Hitzebeständiger Objektträger Kammer</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 62705-01</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophober Barrierestift</td><td>Fisher</td><td>50-550-221</td><td></td></tr><tr><td>MIBI/O Software</td><td>Ionpath</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MIBIcontrol Software</td><td>Ionpath</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MIBIslide</td><td>Ionpath</td><td>567001</td><td></td></tr><tr><td>MIBIscope</td><td>Ionpath</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Feuchtigkeitskammer (Feuchtkammer)</td><td>Simport</td><td>M922-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Tabletten</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944100</td><td></td></tr><tr><td>PT Modul</td><td>Thermo Scientific</td><td>A80400012</td><td></td></tr><tr><td>sterile Einweg-Filtereinheiten mit schnellem Durchfluss</td><td>Fisher Scientific</td><td>097403A</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>BioRocker</td><td>S2025</td><td></td></tr><tr><td>Spin Säule (Ultrafree-MC Spin Filter, 0,5 mL 0,1 μm; m )</td><td>MillQ</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Schiebeofen</td><td>Fisher Scientific</td><td>6901</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumschrank Exsikkator</td><td>VWR</td><td>30621-076</td><td></td></tr><tr><td>Task-Whipe</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4L</td><td></td></tr></tbody></table>

erweiterung des verständnisses der tumormikroumgebung mittels massenspektrometrischer bildgebung von formalinfixierten und paraffineingebetteten gewebeproben

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Fortschritte bei immunbasierten Therapien haben die Krebsbehandlung und -forschung revolutioniert. Dies hat eine wachsende Nachfrage nach der Charakterisierung der Tumorimmunlandschaft ausgelöst. Obwohl die Standard-Immunhistochemie für die Untersuchung der Gewebearchitektur geeignet ist, beschränkt sie sich auf die Analyse einer kleinen Anzahl von Markern. Umgekehrt können Techniken wie die Durchflusszytometrie mehrere Marker gleichzeitig auswerten, obwohl Informationen über die Gewebemorphologie verloren gehen. In den letzten Jahren haben sich Multiplexstrategien, die phänotypische und räumliche Analysen integrieren, als umfassende Ansätze zur Charakterisierung der Tumorimmunlandschaft herausgebildet. Hier diskutieren wir eine innovative Technologie, die metallmarkierte Antikörper und Sekundärionen-Massenspektrometrie kombiniert und sich auf die technischen Schritte in der Assay-Entwicklung und -Optimierung, Gewebevorbereitung sowie Bildaufnahme und -verarbeitung konzentriert. Vor der Färbung muss ein metallmarkiertes Antikörperpanel entwickelt und optimiert werden. Dieses Hi-Plex-Bildsystem unterstützt bis zu 40 metallmarkierte Antikörper in einem einzigen Gewebeabschnitt. Bemerkenswert ist, dass das Risiko von Signalinterferenzen mit der Anzahl der im Panel enthaltenen Marker zunimmt. Nach dem Panel-Design sollte besonders auf die Metallisotopenzuordnung zum Antikörper geachtet werden, um diese Interferenz zu minimieren. Vorläufige Paneltests werden mit einer kleinen Untergruppe von Antikörpern und anschließende Tests des gesamten Panels in Kontrollgeweben durchgeführt. Formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebeschnitte werden gewonnen und auf goldbeschichtete Objektträger montiert und weiter gefärbt. Die Färbung dauert 2 Tage und ähnelt stark der immunhistochemischen Standardfärbung. Sobald die Proben gefärbt sind, werden sie in das Bildaufnahmegerät gelegt. Sichtfelder werden ausgewählt, Bilder werden erfasst, hochgeladen und gespeichert. Der letzte Schritt ist die Bildaufbereitung zur Filterung und Beseitigung von Störungen mit der Bildverarbeitungssoftware des Systems. Ein Nachteil dieser Plattform ist das Fehlen von Analysesoftware. Die erzeugten Bilder werden jedoch von verschiedenen Computerpathologie-Software unterstützt.

Mandel- und Lungenadenokarzinom-TMA-Gewebeschnitte (5 mm dick) wurden entnommen und auf die Mitte von goldbeschichteten Objektträgern gelegt, wobei die Spezifikationen bezüglich Gewebegröße und sicherer Ränder der Objektträger eingehalten wurden. Für eine optimale Färbung sind freie Glasränder von 5 mm bzw. 10 mm zwischen dem Geweberand und den seitlichen bzw. unteren Rändern der Objektträger notwendig. Die Gewebeabschnitte wurden vor der Färbung über Nacht in einem Ofen gebacken, um die ordnungsgemäße Haftung des Abschn...

Im Zeitalter der Krebsimmuntherapie hat das Interesse an der Aufklärung der Dynamik der Tumormikroumgebung markant zugenommen. Dieses Protokoll beschreibt eine massenspektrometrische Bildgebungstechnik in Bezug auf ihre Färbe- und Bildgebungsschritte, die eine stark gemultiplexte räumliche Analyse ermöglichen.

Erweiterung des Verständnisses der Tumormikroumgebung mittels massenspektrometrischer Bildgebung von formalinfixierten und paraffineingebetteten Gewebeproben

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Diese Protokolle ermöglichen die Quantifizierung der Einzelzellauflösung, die Koexpression von Markern und eine spezielle Analyse unter Verwendung von formalinfixierten und paraffineingebetteten und frisch gefrorenen Gewebeproben, um die Rolle von Immunzellen bei Krebs aufzuklären. Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die gleichzeitige Charakterisierung eines 40-Markers auf einem einzelnen Gewebeabschnitt erleichtert und die Struktur des Gewebes in den Proben weitgehend bewahrt. Der kritische Schritt ist die Antikörperoptimierung und -validierung.Wenn der Schritt nicht abgeschlossen wird, kann dies zu Bildern mit geringer Qualität führen, die die Beibehaltung qualitativ hochwertiger, reproduzierbarer Daten und Ergebnisse beeinträchtigen können. Beginnen Sie damit, alle Antikörper-haltigen Röhrchen bei 10.000 x G für fünf Minuten herunterzudrehen, fügen Sie einzelne Antikörper in den Blockierpuffer und mischen Sie gut. Stören Sie den Boden des Antikörperröhrchens nicht, wenn Sie es pipettieren.Filtern Sie das Antikörperpanel durch Vorbenetzung einer 0,1 Mikrometer Zentrifugalfiltervorrichtung mit 100 Mikrolitern Blockierpuffer. Drehen Sie den Filter bei 10.000 x G für zwei Minuten und entfernen Sie den blockierenden Pufferdurchfluss mit einer Pipette. Dann wird das Antikörperpanel in eine Spinsäule überführt und der Filter bei 10.000 x G zwei Minuten lang gedreht.Verwerfen Sie die Spin-Säule und verwenden Sie den Durchfluss als gefilterte Antikörperplatte. Entfernen Sie für die Antikörperfärbung den blockierenden Puffer von den Objektträgern, indem Sie jeden Objektträger auf die Seite kippen und die Kanten vorsichtig gegen einen Aufgabenwischer klopfen. Legen Sie die Objektträger in eine Feuchtigkeitskammer und geben Sie 100 bis 200 Mikroliter Antikörper-Master-Mix in das Gewebe.Fügen Sie positive und negative Kontrollobjektträger in die Färbecharge und inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 4 Grad Celsius. Um das Gerät einzurichten, melden Sie sich bei der Steuerungssoftware an und klicken Sie auf Aufwachen, wenn sich das Gerät im Schlafmodus befindet. Klicken Sie auf Exchange-Beispiel, um eine Folie zu laden, und klicken Sie dann auf Weiter, um die Tür zu öffnen.Legen Sie den Objektträger in den Ladeschlitz mit einer Probe nach oben und dem Etikett auf der rechten Seite, klicken Sie auf Weiter, um die Tür zu schließen. Wählen Sie das Projekt und dann den Foliennamen für das geladene Beispiel aus. Visualisieren Sie das Panoramabild auf dem optischen Diabildbereich für das Sichtfeld oder die FOV-Auswahl, klicken Sie auf das Menü Modus und wählen Sie Sekundärelektronendetektor, klicken Sie dann auf das Menü Bildgebungsmodus und wählen Sie QC 300 Mikrometer.Klicken Sie auf Jog Stage, um die FOV-Position zu steuern, und klicken Sie dann auf die Pfeile, um zu navigieren und die Position des FOV auszuwählen. Klicken Sie auf FOV hinzufügen, stellen Sie 400 Mikrometer mal 400 Mikrometer als Feldgröße ein und wählen Sie Fein als Bildgebungsmodus und 1 Millisekunde Verweilzeit und klicken Sie auf Bestätigen. Nachdem Sie eine FOV-Liste erstellt haben, fahren Sie mit dem Bildfokus fort und passen Sie die Stigmatisierung an, indem Sie den Strahl in eine Geweberegion bewegen, die nicht abgebildet wird.Passen Sie die Parameter an, bis ein klares zentrales Bild erhalten wird, klicken Sie auf Start Run. Die aufgenommenen Bilder werden automatisch hochgeladen und in der webbasierten Bildverwaltungsanwendung gespeichert. Die hier gezeigte Matrix beschreibt den prozentualen Übersprech, der sich aus der Reinheit und den Oxiden der Sonde ergibt.Hier zeigen blaue Kästchen größer oder gleich 0,5% Übersprechen und klare Felder weniger als 0,5% Übersprechen an. Für die Massen-Tags werden hier Sonden angezeigt, die mindestens 0,5% Übersprechen in keine Kanäle, einen oder zwei Kanäle oder mehr als zwei Kanäle beigetragen haben. Massenkanäle, die mindestens 0,5% Übersprechen von keinen Sonden, einer oder zwei Sonden oder mehr als zwei Sonden erhalten, werden ebenfalls angezeigt.Die repräsentativen Färbebilder in verschiedenen Geweben wie Lungenadenokarzinom, nicht-neoplastische Niere und Mandeln sind hier dargestellt. Ein Bild eines Mandelgewebeschnitts, der mit dieser Technik gefärbt und vor dem Filtern und Korrigieren mit einem digitalen Bildanalyseprogramm eines Drittanbieters visualisiert wurde, wird hier vorgestellt. Das Bild des gleichen Abschnitts unter den gleichen Bedingungen nach Filter- und Korrekturschritten wird hier angezeigt.Diese Methode generiert Bilder, die in eine digitale Bildanalysesoftware eines Drittanbieters hochgeladen werden können, was eine umfassende Analyse wie Gewebekompartimentierung, Zellsegmentierung, Marker-Co-Expression sowie Nachbaranalyse und Fernanalyse ermöglicht. Hochmultiplex-Bildgebungsverfahren sind durch Forschung verfügbar. Durch den Aufbau verschiedener Panels können Forscher Krebs-, normale, paraneoplastische, entzündliche und infektiöse Proben untersuchen.

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Cancer Research

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Quantitative massenspektrometrische Analyse von Krebs-Zellen-Proteome Abgeleitet von Liquid und soliden Tumoren

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Erweiterung des Verständnisses der Tumormikroumgebung mittels massenspektrometrischer Bildgebung von formalinfixierten und paraffineingebetteten Gewebeproben (Video) | JoVE Journal

Erweiterung des Verständnisses der Tumormikroumgebung mittels massenspektrometrischer Bildgebung von formalinfixierten und paraffineingebetteten Gewebeproben

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