Name: Zellfreier Dot-Blot als praktische und anpassungsfähige Immunoassay-Plattform zum Nachweis der Antikörperantwort in humanen und tierischen Seren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Erfahren Sie die zellfreie Dot-Blot-Technik für Immunoassays zur Antikörperdetektion in humanen und tierischen Seren. Diese kostengünstige Methode ermöglicht schnelle Anpassung an neue Krankheitserreger.

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Alle Hamsterversuche wurden am National Microbiology Laboratory (NML) der Public Health Agency of Canada durchgeführt, vom Canadian Science Centre for Human and Animal Health genehmigt und nach den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt. Alle menschlichen Serum-/Plasmaproben wurden kommerziell für interne Tests gewonnen oder von klinischen Mitarbeitern dem NML für unabhängige Tests am NML zur Verfügung gestellt.
1. Design und Erstellung von Antigen Linear Expression Templates (LETs)
<ol>
	<li>Entwerfen Sie die zellfreien Expressions-LETs für das Zielantigen basierend auf den Anweisungen in Norouzi et al.7 und mit einem N/C-terminalen SpyTag, wie in Norouzi et al.5 beschrieben. HINWEIS: Hier finden Sie Details zur Herstellung von SARS-CoV-2 Nukleokapsid Protein (NP, Aminosäuren 2-419).<ol>
		<li>Es ist sicherzustellen, dass das LET für den SARS-CoV-2-NP (Abbildung 1 und ergänzende Datei 1) 5'- und 3'-Ter-Stellen mit einer Puffersequenz von 50 Basenpaaren vor dem T7-Promotor und nach dem Stoppcodon enthält.</li>
		<li>Markieren Sie das NP-Protein am N-Terminus mit His 6-SpyTag-TEV.</li>
		<li>Beziehen Sie die Proteinsequenz aus der UniProt-Datenbank (Accession Code P0DTC9) und optimieren Sie sie für die E . coli-basierte Expression mit dem IDT-Codon-Optimierungstool8. Bestellen Sie diese Sequenz für die kommerzielle Synthese als einzelsträngiges DNA-Fragment, das in Wasser bei 10 ng/μL resuspendiert wird. HINWEIS: Die TEV-Protease-Spaltstelle und das His6-Tag sind keine wesentlichen Merkmale im LET-Design.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR-Amplifikation des DNA-Fragments mit dem universellen Ter FW (GGCTCCGAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCGGCC ACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCG) und Ter RV (CCGAGGCAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCTCAG CTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCC) unter Verwendung des High-Fidelity-DNA-Polymerase-Kits (siehe Materialtabelle)<ol>
		<li>Eine 100-μl-Reaktion wird wie folgt aufgebaut: 75 μl nukleasefreies Wasser, 20 μl 5x DNA-Polymerase-Puffer, 2 μl 10 mM dNTPs (Endkonzentration 200 μM), 0,5 μl 100 μM Ter-FW-Primer, 0,5 μl 100 μM Ter-RV-Primer, 1 μl 10 ng/μl einzelsträngiges LET, 1 μl(2U) DNA-Polymerase.</li>
		<li>Verwenden Sie die folgenden PCR-Einstellungen: Erstdenaturierung bei 98 °C für 30 s; 35 Zyklen: 98 °C für 6 s, 60 °C für 15 s, 72 °C für 90 s; Bei 4 °C halten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem kommerziellen PCR-Aufreinigungskit, überprüfen Sie seine Qualität, indem Sie eine Probe auf ein 1%iges Agarosegel laufen lassen, und messen Sie seine Konzentration auf einem UV-Vis-Spektralphotometer. HINWEIS: Rohe PCR-Produkte können auch direkt für die zellfreie Expression verwendet werden. Die Reinigung ermöglicht jedoch ein standardisierteres Verfahren.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67973/67973fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Lineare Expressionsvorlage für SARS-CoV-2-NP. Ein Schema, das die Merkmale des linearen DNA-Templates His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP darstellt. Wichtige DNA-Vorlagenelemente sind beschriftet. Die kodierende Sequenz für das interessierende Protein, hier das NP, wird für eine effiziente Expression unter die transkriptionelle Kontrolle eines T7-Promotors gestellt. Am N-Terminus wird das NP-Protein mit einem SpyTag für den spezifischen Nachweis unter Verwendung des SpyCatcher2-Apex2-Detektionsreagenzes angehängt. Die x6His-Tag- und TEV-Proteasestellen sind, obwohl sie als Teil des allgemeinen LET-Designs enthalten sind, für CFDB-Zwecke entbehrlich. An den Enden des linearen DNA-Templates sind "Upstream"- und "Downstream"-Ter-Stellen, denen jeweils jeweils 50 Basenpaar-Puffersequenzen vorangestellt sind, für den Tus-vermittelten Schutz vor dem Abbau exonukleolytischer DNA im zellfreien Lysat enthalten. Abkürzungen: NP = Nukleokapsidprotein; LET = lineare Ausdrucksvorlage; TEV = Tabakätzvirus; CFDB = zellfreier Dot-Blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67973/67973fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
2. Aufreinigung des Reporterproteins SpyCatcher2-Apex2
<ol>
	<li>Verwenden Sie das pET24b-SpyCatcher2-Apex2-Plasmid, das ursprünglich in Norouzi et al.5 konstruiert wurde (vollständige Sequenz in Supplemental File 2 und Plasmidkarte in Supplemental Abbildung S1), um das SpyCatcher2-Apex-2-Reporterprotein herzustellen.</li>
	<li>Bereiten Sie Agarplatten und Lysogenie-Bouillon (LB) mit 50 μg/ml Kanamycin vor. Transformieren Sie E . coli BL21 (DE3)-Zellen mit dem Plasmid pET24b-SpyCatcher2-Apex2. Impfen Sie eine einzelne Kolonie in eine 15-ml-Starter-LB-Kultur und züchten Sie sie über Nacht bei 37 °C und Schütteln bei 250 U/min.</li>
	<li>Am nächsten Tag geben Sie 10 ml der Starterkultur in 500 ml frisches LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin. Inkubieren Sie bei 37 °C und schütteln Sie bei 250 U/min, bis die Kultur bei 600 nm eine optische Dichte von 0,6-0,8 (~3 h) erreicht.</li>
	<li>Induzieren Sie die Expression von SpyCatcher2-Apex2, indem Sie die Kultur mit 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid und 1 mM 5-Aminolävulinsäurehydrochlorid ergänzen. Reduzieren Sie die Wachstumstemperatur auf 30 °C und lassen Sie die Kultur weitere 4 Stunden inkubieren.</li>
	<li>Ernten Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 min. Fahren Sie mit der Zelllyse fort oder lagern Sie das Pellet bis zur Verwendung bei -80 °C.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 20 ml Lysepuffer, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM NaCl, 1 mg/ml Lysozym, EDTA-freie Proteasehemmer-Tablette und 1 mM Dithiothreitol (DTT) enthält. Die Zellen werden durch Beschallung bei 50 % Amplitude in Intervallen von 5 s EIN und 10 s AUS für eine Gesamteinschaltzeit von 3 min lysiert.</li>
	<li>Das Lysat wird durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 1 h bei 4 °C geklärt. Der Überstand wird durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter geleitet.</li>
	<li>Häminchlorid in einer Endkonzentration von 250 μM zum geklärten Lysat geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren. Fahren Sie mit der Proteinreinigung fort. HINWEIS: Die Inkubation mit Häminchlorid maximiert den Häm-Einbau in die Apex-2-Peroxidase für eine optimale Enzymaktivität.</li>
	<li>Geben Sie 2,5 mL Ni-Harz zum geklärten Lysat und inkubieren Sie bei 4 °C unter leichtem Schütteln für 45 Minuten. Tragen Sie die Mischung auf eine Schwerkraft-Flow-Säule auf und waschen Sie das Harz mit 50 mL Tris-Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM NaCl und 1 mM DTT).</li>
	<li>Eluieren Sie das SpyCatcher2-Apex2-Protein in 25 ml Tris-Puffer, der 400 mM Imidazol enthält. Konzentrat und Puffer tauschen das Eluat mit einer Zentrifugalfiltereinheit in Tris-Puffer aus, wobei ein Endvolumen von 0,5 bis 1,0 ml angestrebt wird.</li>
	<li>Verwenden Sie den molaren Extinktionskoeffizienten von SpyCatcher2-Apex2 (27.390 M-1 cm-1), um die Proteinkonzentration auf einem UV-Vis-Spektralphotometer zu bestimmen. Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 40 % zugeben und die Aliquote bei -20 °C lagern. HINWEIS: Es wird erwartet, dass dieses Protokoll etwa 40 mg hochreines und aktives SpyCatcher2-Apex2 liefert, ausreichend für 400 CFDB-Läufe mit einer Standard-Blot-Größe von 96 Proben.</li>
	<li>Für den Nachweis von SpyTagged Proteinen mit herkömmlichem Western Blot9 und für CFDB-Experimente blockieren Sie die Membranen immer in 5 % fettfreier Trockenmilch in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween-20 (TBST). Verwenden Sie das SpyCatcher2-Apex2-Protein in einer Endkonzentration von 10 μg/ml in Blockierungslösung. HINWEIS: Der SpyCatcher2-Apex2-Reporter erfordert eine ECL-Lösung (Enhanced Chemilumineszenz) für die Signalentwicklung. Die ECL-Lösung kann kommerziell bezogen oder im eigenen Haus gemäß den Anweisungen in Mruk et al.10 hergestellt werden. Die endgültige ECL-Lösung besteht hier aus 0,4 mM p-Cumarsäure, 2,5 mM Luminol und 0,015 % H2O2 in 100 mM Tris-HCl (pH 8,6).</li>
</ol>
3. Zellfreie Produktion und Qualitätskontrolle von Antigenen
<ol>
	<li>Bereiten Sie ein zellfreies Lysat und Reaktionskomponenten von E. coli BL21 vor und fügen Sie es zusammen, indem Sie den Anweisungen in Levine et al.11 und Norouzi et al.5 folgen. Ergänzen Sie das endgültige Reaktionsgemisch mit 5 μM Tus-Protein und 1,2 μM T7-RNA-Polymerase wie folgt für eine repräsentative 100-μl-Reaktion: 14,6 μl Lösung A, 14 μl Lösung B, 33,3 μl E. coli BL21-Lysat, 2,5 μl 200 mM Tus-Protein, 1,2 μl 100 mM T7-RNA-Polymerase, 1 μl 1,5 μM lineares DNA-Template, 33,4 μl nukleasefreies Wasser. HINWEIS: In der ergänzenden Datei 3 finden Sie wichtige Anweisungen zur Herstellung eines zellfreien Lysats BL21 für E . coli und in der ergänzenden Tabelle S1 für eine detaillierte Rezeptur der Lösungen A und B. Das zellfreie Expressionssystem für E. coli kann auch unter Verwendung alternativer Protokolle hergestellt oder kommerziell erworben werden, solange die Reaktion mit Tus und T7-RNA-Polymerase ergänzt wird.</li>
	<li>Führen Sie einen ersten Expressionstest im 5-μl-Maßstab durch, indem Sie der zellfreien Reaktion in einem PCR-Röhrchen 10 % (v/v) Roh-PCR-Produkt zusetzen. Ohne Schütteln bei 30 °C für 15 h inkubieren.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Expressionsqualität des NP-Antigens, indem Sie 1 μl der zellfreien Reaktion auf ein 12%iges Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE) laden und anschließend auf eine Nitrozellulosemembran für Western Blot übertragen, wie in Schritt 2.12 beschrieben. Verwenden Sie das Reporterprotein SpyCatcher2-Apex2 für die Blot-Markierung über den SpyTag und optional einen spezifischen kommerziellen Antikörper (hier einen Anti-SARS-CoV-2-NP) gegen das Zielantigen.</li>
	<li>Assemblieren Sie eine zellfreie Reaktion im 1-ml-Maßstab mit 15 nM gereinigtem LET-Produkt, das für den CFDB-Assay verwendet wird. Die Expressionsmischung wird in einem konischen 15-ml-Röhrchen unter Schütteln bei 80 U/min für 15 Stunden bei 30 °C inkubiert. Überprüfen Sie die Expressionsqualität mit Western Blot und lagern Sie 50 μL Aliquots bei -20 °C.</li>
</ol>
4. Serum-Proben
<ol>
	<li>Beziehen Sie Serumproben (oder Plasmaproben für Menschen/Tiere) aus kommerziellen Quellen oder von klinischen Mitarbeitern oder intern unter Verwendung von Standardverfahren und gemäß den Richtlinien der institutionellen Ethikkommission für die Humanforschung oder der Kommission für Tierpflege und -verwendung. Stellen Sie sicher, dass geeignete Maßnahmen zur Probenvorbehandlung ergriffen wurden, um das Kontaminationsrisiko zu mindern. HINWEIS: Vorbehandlungsmaßnahmen können eine Behandlung mit Lösungsmittel und Reinigungsmitteln, eine Hitzeinaktivierung und Tests auf durch Blut übertragbare Virusmarker umfassen. Ein nützliches Protokoll für die Serum- und Plasmaisolierung aus Vollblut steht zur Verfügung12. Wie bei anderen Immunoassay-Plattformen ist nicht zu erwarten, dass Serumproben, die früh (&lt;3 Wochen) nach der Erstinfektion oder dem Ausbruch der Krankheit entnommen werden, ausreichende Mengen einer Antikörperreaktion enthalten, und ihre Ergebnisse sollten mit Vorsicht behandelt werden.</li>
	<li>Für die Qualitätsüberprüfung der SARS-CoV-2 NP CFDB-Reagenzien verwenden Sie das internationale Referenzgremium der Weltgesundheitsorganisation (WHO) des National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) für Anti-SARS-CoV-2-Immunglobulin, das x1 prä-COVID-19 und x4 SARS-CoV-2-positive Proben mit unterschiedlichen Gehalten an Anti-NP-Immunglobulinenenthält 13. Alternativ können Sie vorcharakterisierte gesunde und positive Serumproben aus anderen Quellen verwenden.</li>
	<li>Für CFDB-Experimente können Sie eine negative Kontrollprobe gewinnen oder vorbereiten, indem Sie mehrere (&gt;3) gesunde Serumproben zusammenfassen, um die Genauigkeit zu erhöhen und die Analyse und Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern.</li>
</ol>
5. Verfahren des zellfreien Dot-Blots (CFDB)
<ol>
	<li>Laden Sie die Master-Grid-Bilddatei herunter und drucken Sie sie aus (Ergänzende Abbildung S2). Das Master-Gitter ist ein 6 x 6 cm großes Muster mit 12 x 12 Kreisen mit je 2 mm Durchmesser und bietet eine ähnliche Fleckenkapazität wie eine 96-Well-Platte.</li>
	<li>Schieben Sie das Gitter fest zwischen zwei Lagen selbstklebender PCR-Platten-Siegelfolie ein und schneiden Sie es entlang der äußeren Gitterränder zu. Verwenden Sie einen 2-mm-Biopsiestanzer, um jeden markierten Kreis auszuhöhlen. HINWEIS: Dieser Master-Rost kann nach dem Abwischen mit 70% Ethanol mehrmals wiederverwendet werden.</li>
	<li>Schneiden Sie ein 6,5 x 6,5 cm großes Stück Nitrozellulosemembran ab und positionieren Sie es unter dem Master-Gitter auf einer sauberen Oberfläche, wobei Sie das Setup mit Klebeband sichern, wie in Abbildung 2 und Ergänzende Abbildung S3 gezeigt. Markieren Sie mit einem Markierungsstift die äußersten Kreispositionen auf der Nitrozellulosemembran, die als Leitfaden für das Schneiden der Membran nach der Probenaufschluss dienen sollen.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Serumproben zu 1/10 in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4). Verwenden Sie eine Mikropipette, um ein dreifaches Volumen von 0,4 μl jeder Probe an vorgegebenen Gitterpositionen auf die Nitrozellulosemembran zu dispensieren. Die Abgabe dauert ca. 15 s pro Stelle. HINWEIS: Achten Sie darauf, dass Sie jedem Assay sowohl Negativ- als auch Positivkontrollproben beifügen, da dies für die Analyse der Ergebnisse erforderlich ist.</li>
	<li>Lassen Sie die gefleckten Proben 10 Minuten bei Umgebungstemperatur binden und trocknen. Ziehen Sie die Nitrozellulosemembran vorsichtig mit einer Pinzette heraus und schneiden Sie entlang der markierten äußeren Kreise.</li>
	<li>Blockieren Sie die Membran in 10 ml Blockierungslösung (5 % fettfreie Trockenmilch in TBST) in einer 10 cm Petrischale für 30 Minuten bei Raumtemperatur und schütteln Sie sie leicht bei 100 U/min.</li>
	<li>Tauen Sie auf und geben Sie ein 50 μl Aliquot des zellfreien Antigenexpressionsgemisches zu 5 ml Blockierungslösung in einer 10 cm Petrischale. Die Membran wird direkt in diese antigenhaltige Lösung überführt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, wobei bei 100 U/min geschüttelt wird. HINWEIS: Dies ist der primäre Nachweisschritt, bei dem das SpyTagged-Antigen an antikörperhaltige Spot-Positionen bindet, falls vorhanden.</li>
	<li>Spülen Sie die Membran aus, waschen Sie sie 5 Minuten lang und spülen Sie sie erneut in TBST, bevor Sie mit dem sekundären Nachweisschritt fortfahren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran in 10 mL Blockierungspuffer mit 10 μg/ml gereinigtem SpyCatcher2-Apex2-Protein für 1 h unter Schütteln bei 100 U/min.</li>
	<li>Spülen Sie die Membran aus und waschen Sie sie 2 x 5 min in TBST, mit einer abschließenden Spülung in TBS.</li>
	<li>Kleben Sie ein Stück Parafilm auf eine saubere Arbeitsfläche in der Nähe des Blot-Imaging-Instruments und befestigen Sie es. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Sie mit einer Pinzette auf die Membran klopfen und die Membran auf den Parafilm legen.</li>
	<li>Geben Sie sofort 3 mL (100 μL/cm2) ECL-Lösung auf die Membran und inkubieren Sie sie genau 90 s lang bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Trocknen Sie die Membran sofort ab und übertragen Sie sie zur Visualisierung der Ergebnisse auf ein Chemilumineszenz-kompatibles Bildgebungsinstrument. HINWEIS: Die optimale Bildgebungszeit kann bei verschiedenen Instrumenten variieren. Es wird empfohlen, die Standardeinstellungen für die automatische Erfassungszeit des Geräts zu verwenden und, falls nicht vorhanden, vorcharakterisierte Serumproben zu verwenden, um die Bildaufnahmezeit zu optimieren.</li>
	<li>Verwenden Sie die Bildanalysefunktion des Geräts, um Punktintensitäten zu erhalten, einschließlich für drei leere (Hintergrund-)Positionen auf der Nitrozellulosemembran; Halten Sie ein konstantes Messvolumen pro Spot aufrecht. Exportieren Sie die Daten in eine Tabelle und denken Sie daran, jede Punktposition korrekt zu beschriften.</li>
	<li>Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung (SD) der dreifachen Punktintensitäten. Subtrahieren Sie dann den Hintergrund der Nitrozellulosemembran von allen Proben.</li>
	<li>Verwenden Sie die folgende Gleichung, um einen Grenzwert für die Interpretation der -/+-Ergebnisse zu erhalten: (Mittelwert der Negativkontrollen) + (3 x SD der Negativkontrollen). Betrachten Sie Proben als positiv, wenn ihre durchschnittliche Intensität über den Grenzwert fällt, und als negativ, wenn ihre durchschnittliche Intensität unter den Grenzwert fällt. HINWEIS: Ein Schema des CFDB-Verfahrens ist in Abbildung 3 dargestellt.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67973/67973fig02.jpg"> 
Abbildung 2: CFDB-Baugruppe. Ein Schema des Aufbaus des CFDB-Mastergitters und der NC-Membranbaugruppe. Das Master-Gitter wird auf der NC-Membran überlagert, um ein regelmäßiges, adressierbares Muster für die Spotting und Immobilisierung von Serumproben zu erhalten. Abkürzungen: CFDB = zellfreier Dot-Blot; NC = Nitrocellulose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67973/67973fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67973/67973fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Eine schematische Darstellung des CFDB-Arbeitsablaufs. Bei einem CFDB-Assay wird eine kleine Menge (&lt;0,4 μl) von 10x verdünnten Serumproben manuell auf eine vorgeschnittene Nitrozellulosemembran (linkes Bild) an diskreten, adressierbaren Stellen (mittleres Bild) aufgetragen. Ablage einer Serumprobe pro Spot in dreifachen Spots und Immobilisierung des Proteingehalts, einschließlich des gesamten Antikörperreservoirs der Seren, auf dem festen NC-Substrat (beige Flecken im mittleren Feld). In diesem Beispiel können die in den Serumproben enthaltenen Anti-NP-Antikörper zunächst durch das CFDB-Primärdetektionsreagenz SpyTag-NP gebunden und schließlich durch das CFDB-Sekundärdetektionsreagenz SpyCatcher2-Apex2 (vergrößerte Blase auf dem rechten Feld) nachgewiesen werden. Diese Abbildung stammt von Norouzi et al.5. Abkürzungen: CFDB = zellfreier Dot-Blot; NP = Nukleokapsidprotein; LET = lineare Ausdrucksvorlage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67973/67973fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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<li>Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+Escherichia+coli-based+cell-free+systems+for+robust%2C+high-density%2C+long-term+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage.</a> Biotechniques. 56 (4), 186-193 (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA-Leiter</td><td>NEB</td><td>N3232</td><td>Wird als Größenmarker für Agarosegele</td></tr><tr><td>verwendet 20 Aminosäuren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21-1KT</td><td>Ein Bestandteil der zellfreien Reaktion Lösung B</td></tr><tr><td>2 mm Biopsie-Stanze&nbsp;</td><td>Integra Miltex&nbsp;</td><td>33-31-P/25</td><td>Zur Herstellung von CFDB-Mastergittern</td></tr><tr><td>5-Aminolävulinsäurehydrochlorid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3785</td><td>Häm-Vorläufer zur Induktion von SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Agarosepulver</td><td>BioShop</td><td>AGA002</td><td>Für die elektrophoretische Analyse von DNA</td></tr><tr><td>Anti-SARS-CoV2-Nukleokapsid-Antikörper</td><td>Sinobiologisch</td><td>40588-T62</td><td>Für den WB-Nachweis von zellfrei produziertem NP-Antigen</td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc&nbsp; XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>Gel-Imager-Instrument</td></tr><tr><td>Zentrifugalkonzentratoren</td><td>Cytiva</td><td>28-9323-60</td><td>Für die Konzentration und den Pufferaustausch von Proteinen</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628257</td><td>Für die Ernte von Bakterienkulturen</td></tr><tr><td>Coenzym&nbsp; A Natriumsalzhydrat (CoA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3144</td><td>Eine Komponente der zellfreien Reaktion Lösung A</td></tr><tr><td>Farbvorgefärbter Proteinstandard (breites Spektrum)</td><td>NEB</td><td>P7719</td><td>Wird als Größenmarker für SDS-PAGE-Gele verwendet</td></tr><tr><td>Covid-19-Serumpanel</td><td>RayBiotech</td><td>CoV-PosSet</td><td>Vorcharakterisierte Seren zur Verifizierung und Optimierung von CFDB-Reagenzien/-Bedingungen</td></tr><tr><td>D-(&minus;)-3-Phosphoglycerinsäure-Dinatriumsalz (3-PGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>A Bestandteil der zellfreien Reaktion Lösung B</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td>Bestandteil von Puffern</td></tr><tr><td>E. coli 5-alpha</td><td>NEB</td><td>C2987&nbsp;</td><td>zur Plasmidpräparation</td></tr><tr><td>E. coli BL21&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C2530&nbsp;</td><td>Zur Herstellung von zellfreien Lysaten</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3)</td><td>NEB</td><td>C2527&nbsp;</td><td>Zur Ausprägung von SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>EDTA-freier Proteasehemmer</td><td>Tablette Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>Ein Bestandteil des E. coli Lysepuffers</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; New Brunswick&nbsp; Innova 43/43R Inkubator Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>EPM1320</td><td>Inkubator für die Züchtung von E. coli-Zellen zur Proteinexpression und zellfreien Lysatzubereitung</td></tr><tr><td>Folinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47612</td><td>Eine Komponente der zellfreien Reaktion Lösung A</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td>Komponente des SpyCatcher2-Apex2 Speicherpuffers</td></tr><tr><td>Heminchlorid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039&nbsp;</td><td>Zur Häm-Supplementierung von SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Zur Herstellung von ECL-Reagenz</td></tr><tr><td>Image Lab Software</td><td>Bio-Rad</td><td>1709690</td><td>Software für ChemiDoc Gel &nbsp; Bildgebungsinstrument</td></tr><tr><td>Isopropyl-b-D-1-thiogalactopyranosid&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>IPT001</td><td>Zur Induktion von SpyCatcher2-Apex2 Expressikon</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>Zur Herstellung von SpyCatcher2-Apex2 Bakterienkultur</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>BioShop</td><td>LBL406</td><td>Für E. coli Wachstum</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>BioShop</td><td>LBL407</td><td>Für E. coli Wachstum</td></tr><tr><td>Luminol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4685</td><td>Zur Herstellung von ECL-Reagenz</td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Zur Lyse von Bakterienzellen</td></tr><tr><td>Magnesiumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td>Eine Komponente der zellfreien Reaktion Lösung B</td></tr><tr><td>NEBExpress Ni-Harz&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1428S</td><td>Zur Reinigung von SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Fettfreier Trockenmilch</td><td>Bioshop</td><td>SKI400</td><td>Zur Blockierung von WB- und CFDB-Membranen</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>2099-1337410</td><td>Zur ECL-Inkubation von CFDB-Blots</td></tr><tr><td>p-Cumarsäure&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008</td><td>Zur Herstellung des ECL-Reagenzes</td></tr><tr><td>pET24b-SpyCatcher2-Apex2 Plasmid</td><td>Pardee Laboratory</td><td>N/A</td><td>Wird für die Expression des SpyCatcher2-Apex2-Proteins</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>verwendet Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td>Behälter für die Inkubation von WB- und CFDB-Membranen&nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 10%</td><td>BioShop</td><td>PBS405</td><td>Bestandteil der Puffer</td></tr><tr><td>Kaliumglutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>Ein Bestandteil der zellfreien Reaktion Lösung B</td></tr><tr><td>Kaliumoxalat Monohydrat (Oxalsäure)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223425</td><td>Ein Bestandteil der zellfreien Reaktion Lösung A</td></tr><tr><td>Vorgefertigtes SDS-PAGE Gel</td><td>BioRad</td><td>4561036EDU</td><td>Für die elektrophoretische Analyse der</td></tr><tr><td>Protein-Q5-High-Fidelity-DNA-Polymerase&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491&nbsp;</td><td>Für die PCR-Amplifikation von LETs</td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Zur Aufreinigung von LETs</td></tr><tr><td>Ribonukleotid-Lösungssatz</td><td>NEB</td><td>N0450S</td><td>Ein Bestandteil der zellfreien Reaktion Lösung A</td></tr><tr><td>Magermilchpulver</td><td>BioShop</td><td>SKI400</td><td>Wird als Blockierungsmittel für Western Blot und CFDB</td></tr><tr><td>verwendet Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>Ein Bestandteil von Proteinreinigungspuffern</td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Qsonica</td><td>Q500</td><td>Für die Lyse von Bakterienzellen</td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td>Ein Bestandteil der zellfreien Reaktion Lösung A</td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGSR33SS</td><td>Zur Sterilisation von Puffern und Lösungen</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td>Gerät zur Inkubation von PCR-Reaktionen</td></tr><tr><td>Transfer-RNA (tRNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8759</td><td>Ein Bestandteil der zellfreien Reaktion Lösung A</td></tr><tr><td>Tris gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Thermo Scientific</td><td>J60764. K2</td><td>Komponente aus WB- und CFDB-Waschpuffer</td></tr><tr><td>Trizma-Basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Zur Herstellung von Tris-Puffer</td></tr><tr><td>Tunair SS-5012 Half-Baffle Shake Flask, 2,5 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-01835-39</td><td>Gefäß für die Züchtung von E. coli-Zellen für die Proteinexpression und zellfreie Lysatvorbereitung</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioShop</td><td>TWN510</td><td>Komponente des WB- und CFDB-Waschpuffers</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Almedic</td><td>7728-A10-100</td><td>Für die Handhabung von CFDB NC-Membran-UV-Vis-Spektralphotometern</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>13400518</td><td>Zur Messung der Nukleinsäure- und DNA-Konzentration und Bakterienkultur OD</td></tr><tr><td>WHO Internationales Referenzgremium für Anti-SARS-CoV-2-Immunglubulin</td><td>NISBC</td><td>20/268</td><td>Vorcharakterisierte Seren zur Verifizierung und Optimierung von CFDB-Reagenzien/-Bedingungen</td></tr><tr><td>&beta;-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Hydrat (NAD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10127965001</td><td>Eine Komponente der zellfreien Reaktion Lösung A</td></tr></tbody></table>

zellfreier dot-blot als praktische und anpassungsfähige immunoassay-plattform zum nachweis der antikörperantwort in humanen und tierischen seren

Cell-Free Dot Blot as a Practical and Adaptable Immunoassay Platform for the Detection of Antibody Response in Human and Animal Sera

PCR-Amplifikation des linearen Expressions-Templates für das Zielantigen Zur PCR-Amplifikation des SARS-CoV-2 NP LET wurden universelle Ter-Forward- und Reverse-Primer verwendet, wie in Protokollabschnitt 1.2 beschrieben, und 1 μl des Produkts wurde auf einem Agarosegel überprüft (Abbildung 4), bevor mit der Aufreinigung des PCR-Produkts fortgefahren wurde.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/fil...

Zellfreier Dot-Blot als praktische und anpassungsfähige Immunoassay-Plattform zum Nachweis der Antikörperantwort in humanen und tierischen Seren

The string of global pathogenic outbreaks over the past two decades has highlighted the importance of serosurveillance strategies. Immunoassay platforms ...

cell-free-dot-blot-as-practical-adaptable-immunoassay-platform-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Mit Luminex Corporation xMAP-Mikrokugel-Technologie haben wir die Multiplex Fluorometric Immunoassay (MFIA) für serologischen Überwachung von verschiedenen Labors Tierarten entwickelt. Die MFIA ist eine Suspension Microarray, wo Antigen, Gewebekontrolle oder Immunglobuline kovalent an farbkodierten Polystyrol-Mikrokügelchen verbunden sind. Die MFIA Prüfverfahren sowie verschiedene Themen zur Fehlerbehebung adressiert ist.

Multiplexed Fluorometric Immunoassay Testing Methodology und Fehlerbehebung

Dieses Video beschreibt eine Immunoassay-Technik, bei der fluoreszierende magnetische Kügelchen oder Mikrosphären in Verbindung mit verschiedenen Antigenen verwendet werden, um gleichzeitig verschiedene Antikörper-Isotypen in einer Serumprobe nachzuweisen. Der Assay ist hilfreich, um die Serokonversion während einer Infektion oder nach der Impfung zu verstehen.

Multianalyt-Immunobead-Assay: eine flussbasierte Immunoassay-Technik zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Antikörper-Subtypen in humanen Serumproben

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung von zwei monoklonalen Antikörpern (mAbs) der IgG-Klasse, die stark auf Myoglobin von Walen reagieren. Diese mAbs werden auf einen kolloidalen immunchromatographischen Goldteststreifen aufgebracht, der auf dem Sandwichformat basiert, um das Mb von Walen und Delfinen von Robben und anderen Tieren zu unterscheiden.

Entwicklung eines Kolloidales-Gold-basierten Immunchromatographischer Teststreifen zum Nachweis von Cetacean Myoglobin

Menschliches peripheres Blut wird häufig zur Beurteilung der humoralen Immunantwort verwendet. Im Folgenden werden die Methoden zur Isolierung humaner B-Zellen aus peripherem Blut, zur Differenzierung humaner B-Zellen in Antikörper (Ab)-sezernierende B-Zellen (ASCs) in Kultur und zur Aufzählung der Gesamt-IgM- und IgG-ASCs über einen ELISpot-Assay beschrieben.

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

Wir zeigen eine Snap-Chip-Technologie für die Durchführung von cross-reactivity-freie gemultiplexten Sandwich Immunoassays durch Einrasten einfach zwei Folien. Ein Snap-Apparat dient zur Übertragung von zuverlässig Reagenzien von Microarray-Microarray. Die Snap-Chip kann für jede biochemischen Reaktionen erfordern NS1 der verschiedenen Reagenzien ohne Cross-Kontamination verwendet werden.

Snap Chip für Cross-reactivity frei und Spotter Multiplex Sandwich Immunoassays

Hier zeigen wir einen detaillierte Prozess der quantitativen Dot-Blot Analyse (QDB) durch die Bestimmung des absoluten Inhalts eines gezielten Proteins Deckelung Aktin Protein, Gelsolin erinnernden (CAPG), in drei verschiedenen Maus Geweben. Wir zeigen ein hoher Durchsatz, bequem, quantitative Immunoblot-Technik für die Validierung der Biomarker auf zelluläre und Gewebe.

Hoher Durchsatz, Absolute Bestimmung des Inhalts eines ausgewählten Proteins auf Gewebe Ebenen mit quantitativen Dot Blot Analyse (QDB)

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Charakterisierung von T-abhängigen und T-unabhängige Immunglobulin (Ig) Isotype Antworten bei Mäusen mittels ELISA. Diese Methode verwendet, allein oder in Kombination mit Flow Cytometry wird erlauben Forschern, Unterschiede in der B-Zell-vermittelten Ig Isotype Antworten bei Mäusen nach T-abhängigen und T-unabhängige Antigen-Immunisierung zu identifizieren.

Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay

Dieser Artikel beschreibt eine geeignete Methode zur gleichzeitigen Überwachung dynamischer Veränderungen in Antikörpertitern für zwei Immunglobulin-Isotypen (entweder IgA, IgM oder IgG), die sich aus einer Immunantwort auf eine SARS-CoV-2-Infektion oder -Impfung ergeben. Dieses "Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel" verwendet drei indirekte Immunoassays, die auf codierten Mikrosphären basieren und mit einem flussbasierten Multiplex-Leser mit "Dual-Channel"-Fähigkeit gelesen werden.

Dynamisches Monitoring der Serokonversion mittels Multianalyte Immunobead Assay für Covid-19

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Herstellung von Latexkügelchen für Assays mit IgY-Antikörpern für den Antigennachweis.

Standardisierung eines zytometrischen Bead-Assays auf Basis von Eigelb-Antikörpern

Vollblutbasierte Immunoassays bieten ein einfaches und ressourceneffizientes Werkzeug zur Analyse der antigenspezifischen Immunität für Diagnose- und Forschungszwecke. Dieser Artikel bietet ein optimiertes Vollblut-basiertes Protokoll mit dualer Co-Stimulation für eine umfassende Analyse der Immunität des Wirts gegen pilzliche und virale Krankheitserreger, einschließlich einer Version mit geringem Volumen für pädiatrische Patienten und Kleintiere.

Vollblutassay mit dualer Co-Stimulation zur antigenspezifischen Analyse der Immunität des Wirts gegen pilzliche und virale Krankheitserreger

Wir präsentieren einen validierten Sandwich-ELISA-Assay mit neuartigen monoklonalen Anti-HER2-Antikörpern. Dieser Assay ermöglicht die präzise Quantifizierung von zellgebundenem und freigesetztem HER2-Protein aus in vitro kultivierten Zellen und anderen Proben, einschließlich Blut und Geweben.

Validierter immunchemischer Assay zur umfassenden Bestimmung des humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2, der aus Zellen freigesetzt und an Zellen gebunden wird

Erfahren Sie die zellfreie Dot-Blot-Technik für Immunoassays zur Antikörperdetektion in humanen und tierischen Seren. Diese kostengünstige Methode ermöglicht schnelle Anpassung an neue Krankheitserreger.

Zellfreier Dot-Blot als praktische und anpassungsfähige Immunoassay-Plattform zum Nachweis der Antikörperantwort in humanen und tierischen Seren (Video) | JoVE Journal

Zellfreier Dot-Blot als praktische und anpassungsfähige Immunoassay-Plattform zum Nachweis der Antikörperantwort in humanen und tierischen Seren

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