Zellfreier Dot-Blot als praktische und anpassungsfähige Immunoassay-Plattform zum Nachweis der Antikörperantwort in humanen und tierischen Seren

Dieses Protokoll demonstriert die zellfreie Punktbluttechnik, eine anpassungsfähige, zugängliche und erschwingliche Immunoassay-Plattform, die als Reaktion auf die COVID-19-Pandemie entwickelt wurde. Zu den bestehenden Goldstandard-Immunoassay-Methoden gehören Variationen der ELISA-Technik und Lateral-Flow-Assays. Es besteht ein großes Interesse an der Entwicklung neuartiger Immunoassays unter Verwendung von Technologien wie Split Reported Proteins, elektrochemischen Grenzflächen und kolloidalen Nanopartikeln.

Die Herausforderung besteht darin, dass die meisten Goldstandard-Immunoassays für nicht-zentralisierte Gemeinschaften unzugänglich sind, da sie auf teure und hochentwickelte molekulare Komponenten und Geräte angewiesen sind. Diese neuartige CFDB-Immunoassay-Technik kann schnell an neu auftretende Ausbrüche angepasst werden. Es verwendet eine grundlegende Laborausrüstung und stützt sich vollständig auf molekulare Komponenten, die im eigenen Haus und mit geringen Ressourcen hergestellt werden können.

Beziehen Sie zunächst die Proteinsequenz aus der UniProt-Datenbank mit dem Zugangscode P0DTC9. Code zur Optimierung der Sequenz für die Ecoli-basierte Expression mit dem IDT-Code für die Optimierungstool. Fügen Sie die optimierte Sequenz in ein SnapGene-Template für das Rückgrat des Expressionskonstrukts ein, bevor Sie die optimierte Sequenz für die kommerzielle Synthese als einzelsträngiges DNA-Fragment bestellen, das in Wasser resuspendiert wird.

Führen Sie einen ersten Expressionstest im Fünf-Mikroliter-Maßstab durch, indem Sie der zellfreien Reaktion von ecoli BL21 10 %iges PCR-Produkt in einem PCR-Röhrchen zusetzen. Inkubieren Sie die Reaktion ohne Schütteln 15 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Beurteilen Sie die Expressionsqualität des Nukleokapsidproteins oder des NP-Antigens, indem Sie einen Mikroliter der zellfreien Reaktion auf 12%SDS-Seitengel laden und auf eine Nitrozellulosemembran für den Western Blot übertragen.

Assemblieren Sie eine zellfreie Reaktion im Ein-Milliliter-Maßstab unter Verwendung von 15 nanomolar gereinigten linearen Expressions-Template-Produkten für den zellfreien Dot-Blot-Assay. Inkubieren Sie die Expressionsmischung in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen unter Schütteln bei 80 U/min für 15 Stunden bei 30 Grad Celsius. Nach der Beurteilung der Expressionsqualität mittels Western Blot und der Aliquotierung von 50 Mikrolitern der Expressionsmischung lagern Sie die Aliquote bei minus 20 Grad Celsius. Verwenden Sie ein Master-Gitterbild wie gezeigt mit einem sechs x sechs Zentimeter großen Muster mit 12 x 12 Kreisen mit einem Durchmesser von jeweils zwei Millimetern, das der Spottkapazität einer 96-Well-Platte entspricht.

Nachdem Sie das Master-Gitter gedruckt haben, legen Sie das gedruckte Gitter fest zwischen zwei Schichten selbstklebender PCR-Platten-Deckenfolie und schneiden Sie das Sandwich entlang der äußeren Gitterränder zu. Hohlen Sie mit einem zwei Millimeter großen Biopsiestempel jeden markierten Kreis auf dem Gitter aus. Schneiden Sie ein 6,5 x 6,5 Zentimeter großes Stück Nitrozellulosemembran ab, positionieren Sie es unter dem Mastergitter auf einer sauberen Oberfläche und befestigen Sie es mit Klebeband.

Markieren Sie mit einem Markierungsstift die äußersten Kreispositionen auf der Nitrozellulosemembran, die als Hilfslinie für das Schneiden der Membran nach der Probenaufschluss dienen sollen. Verdünnen Sie die Serumproben eins bis 10 in PBS. Geben Sie mit einer Mikropipette ein dreifaches Volumen von 0,4 Mikrolitern jeder Probe auf die Nitrozellulosemembran an vorgegebenen Gitterpositionen.

Lassen Sie die gefleckten Proben binden und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen. Ziehen Sie die Nitrozellulosemembran vorsichtig mit einer Pinzette heraus und schneiden Sie sie entlang der markierten äußeren Kreise ein. Übertragen Sie die Membran in eine 10 Zentimeter große Petrischale, die 10 Milliliter Blockierlösung enthält.

30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln bei 100 U/min inkubieren. Nehmen Sie das 50-Mikroliter-Aliquot der zellfreien Antigenexpressionsmischung aus dem Gefrierschrank und geben Sie es nach dem Auftauen zu fünf Millilitern Blockierungslösung in einer 10 Zentimeter großen Petrischale. Die Membran wird direkt in diese antigenhaltige Lösung überführt und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, wobei sie bei 100 U/min geschüttelt wird.

Spülen und waschen Sie die Membran nach einer Stunde in TBST mit einem Gehalt von 0,05 % Tween 20. Geben Sie als Nächstes 10 Milliliter Blockierungspuffer mit 10 Mikrogramm pro Milliliter gereinigtem SpyCatcher, zwei Apex, zwei Proteine, zur Membran und legen Sie die Membran in eine Schale, die SpyCatcher Apex enthält. Eine Stunde lang unter Schütteln bei 100 U/min inkubieren Nach dem Spülen der Membran mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung oder TBS zweimal fünf Minuten lang in TBST waschen, gefolgt von einer abschließenden Spülung in TBS.

Kleben Sie ein Stück Parafilm auf eine saubere Arbeitsfläche in der Nähe des Blot-Imaging-Instruments und befestigen Sie es. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Sie auf die Membran klopfen und sie mit einer Pinzette auf den Parafilm legen. Geben Sie sofort drei Milliliter verbesserte Chemilumineszenz- oder ECL-Lösung auf die Membran und inkubieren Sie genau 90 Sekunden lang bei Raumtemperatur.

Nachdem Sie die Membran aus dem Klopf getrocknet haben, übertragen Sie sie in ein chemilumineszenzkompatibles Bildgebungsinstrument. Verwenden Sie die Bildanalysefunktion des Geräts, um Punktintensitäten zu erhalten, einschließlich für drei Blindpositionen auf der Nitrozellulosemembran. Halten Sie ein konstantes Messvolumen pro Spot aufrecht.

Exportieren Sie die Daten in eine Tabelle, um die korrekte Beschriftung jeder Spot-Position sicherzustellen. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der dreifachen Spot-Intensitäten. Subtrahieren Sie den Hintergrund der Nitrozellulosemembran von allen Probenmessungen.

Verwenden Sie dann die angegebene Gleichung, um einen Grenzwert für die Interpretation positiver oder negativer Ergebnisse zu erhalten. Zeichnen Sie abschließend die abgezogenen Cutoff-Daten in ein Balkendiagramm. Ein zellfreier Dot-Blot-Assay wurde an der vorcharakterisierten kommerziellen menschlichen Sarah durchgeführt, und ein Bild des Blots zusammen mit dem entsprechenden Signalintensitätsdiagramm ist in dieser Abbildung dargestellt.

Der zellfreie Dot-Blot-Assay identifizierte erfolgreich alle negativen Kontrollproben und die meisten positiven Proben. Unabhängige Tests des zellfreien Dot-Blot-Assays im National Microbiology Laboratory identifizierten alle 12 negativen und 12 positiven Patientenproben korrekt und bestätigten seine Robustheit. Der zellfreie Dot-Blot-Assay wies auch Antikörperreaktionen bei der SARS-CoV-2-infizierten Hamsterin Sarah nach, wobei in 18 von 24 Proben nach der Infektion, die fünf Tage nach der Reinfektion entnommen wurden, positive Signale beobachtet wurden, während alle Proben vor der Infektion negativ blieben.