Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

Das übergeordnete Ziel dieser ELISpot-Methodik ist es, die Quantifizierung von humanen Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus dem Blut zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im biomedizinischen Bereich zur Immunologie von B-Zellen und zur Impfstoffforschung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie den Nachweis und die Messung von Antikörper-sezernierenden B-Zellen auf Einzelzellebene ermöglicht.

Das Verfahren wird von Tsung-Chih Tseng, einem Doktoranden aus meinem Labor, vorgeführt. Unmittelbar nach der Entnahme einer 10-ml-Blutprobe aus der Vena cubitalis medianus in ein 15-ml-Röhrchen mit kaliumsupplementiertem EDTA das Röhrchen mehrmals umdrehen, um die Bildung von Gerinnseln zu verhindern. Geben Sie dann 35 ml autoklavierten Lysepuffer für rote Blutkörperchen in die Zellen für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur.

Wenn Licht durch das Röhrchen zu sehen ist, zentrifugieren Sie das Blut und bestätigen Sie das Vorhandensein eines weißen Kügelchens. Entfernen Sie den restlichen Lysepuffer mit 10 ml autoklaviertem PBS und suspendieren Sie das Pellet erneut in 10 ml RPMI 1640 Medium. Richten Sie die Zellen für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid in eine 10-cm-Kulturschale ein.

Schwenken Sie dann die Kulturschale vorsichtig einige Male und geben Sie die schwimmenden Zellen in ein konisches 15-ml-Kunststoffröhrchen. Nach zwei Wäschen durch Zentrifugation wird das Pellet bei der fünf- bis zehnfachen Zehntelkonzentration von sechs Zellen pro ml in 200 Mikrolitern kaltem PBS-Puffer wieder suspendiert und 5 Mikroliter eines biotinylierten Anti-Human-Antikörpercocktails hinzugefügt, der für Blutzellen spezifisch ist, pro mal Zehntel der sechsten Zellen. Nach einer 30-minütigen Inkubation auf Eis waschen Sie die Zellen in einem 10-fachen überschüssigen Volumen sterilen PBS und suspendieren Sie das Pellet erneut in fünf Mikrolitern Streptavidin-konjugierten Mikrokügelchen pro mal Zehntel der sechs Zellen für eine 30-minütige Inkubation auf Eis.

Am Ende der Inkubation geben Sie zwei ml PBS-Puffer in die Zellen und stellen Sie das Röhrchen acht Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Magnetständer. Wenn sich die Mikrokügelchen an der Wand des Röhrchens festgesetzt haben, überführen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues konisches Röhrchen und geben Sie 2 weitere ml PBS-Puffer in die Zellen. Nach der zweiten Überstandsentnahme werden die gepoolten Zellen durch Zentrifugation gesammelt und die Zellen in ein Fünf-ml-Polystyrolröhrchen und einen frischen PBS-Puffer in einer Konzentration von einem mal Zehntel der sieben Zellen pro ml überführt.

Nach der Vorbereitung der unspezifischen Blockierung wird ein Mikrogramm jedes Selektionsantikörpers pro mal zehntel der sechs Zellen in das Röhrchen gegeben, wobei das Röhrchen vorsichtig gemischt wird, um eine 30-minütige Inkubation auf Eis zu erhalten. Während der letzten fünf Minuten der Inkubation geben Sie fünf Mikroliter 7-AAD zu den Zellen. Geben Sie dann zwei Milliliter frisches PBS in die Zellen und den Vortex, bevor Sie zentrifugieren.

Suspendieren Sie das Pellet in einem frischen Sortierpuffer mit einem Ein- bis Fünffachen der Konzentration von sieben Zellen pro Milliliter und filtrieren Sie die Zellen durch ein 40-Mikron-Zellsieb in ein neues Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen. Sortieren Sie dann die Zellen durch Durchflusszytometrie in drei 15-ml-Röhrchen mit 5 ml frischem RPI-Medium, um die naiven B-Zellen, Gedächtnis-B-Zellen und Plasmablasten-Plasmazellen zu sammeln. Wenn alle Zellen geerntet wurden, säen Sie die Untergruppen in einzelne Vertiefungen einer 12-Well-Zellkulturplatte mit einer ein- bis zehnfachen Zehntelkonzentration der fünften Zellen pro Milliliter in frischem RPMI-Medium.

Als nächstes aktivieren Sie die B-Zellen mit fünf Mikrogramm CPG ODN 2006 pro mal Zehntel der sechsten Zellen pro Milliliter pro Vertiefung im Zellkultur-Inkubator für fünf Tage. Am Ende der Aktivierung 30 Mikroliter 35%iges Ethanol und destilliertes Wasser für 30 Sekunden in jede Vertiefung der ELISpot-Platten geben. Ersetzen Sie dann das Ethanol in jeder Vertiefung durch 150 Mikroliter autoklaviertes, doppelt destilliertes Wasser und inkubieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um das restliche Ethanol zu entfernen.

Führen Sie eine PBS-Wäsche durch, gefolgt von der Zugabe von 50 Mikrolitern des polyklonalen FAB2-Fragments von Anti-Human-IG in jede Vertiefung. Waschen Sie die Teller zweimal mit PBS, wie gerade gezeigt. Blockieren Sie die unspezifische Bindung in jeder Vertiefung mit 200 Mikrolitern frischem PBS mit BSA für zwei Stunden bei Raumtemperatur.

Nach einer weiteren PBS-Waschserie inkubieren Sie die Vertiefungen in 100 Mikrolitern frischem RPMI 1640 Medium bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie dann das Medium in jeder ELISpot-Vertiefung durch die entsprechende Anzahl aktivierter B-Zellen. Bringen Sie das endgültige Volumen jeder Vertiefung auf 150 Mikroliter mit frischem RPMI-Medium und stellen Sie die ELISpot-Platte dann für acht bis 14 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück.

Am Ende der Inkubationszeit entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Vertiefungen mit 200 Mikrolitern PBS plus Tween20 für fünf- bis dreiminütige Wäschen. Geben Sie nach der letzten Wäsche die entsprechenden Nachweisantikörper in die entsprechenden Vertiefungen und inkubieren Sie die Platten zwei Stunden lang im Dunkeln. Nach einer weiteren PBS-Waschserie geben Sie 50 Mikroliter BCIPMBT-Substrat für fünf bis 15 Minuten bei Raumtemperatur in jede Vertiefung

Wenn violette Flecken auftreten, stoppen Sie die Reaktion mit 100 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser pro Vertiefung und spülen Sie die Platte mit fließendem Leitungswasser aus. Trocknen Sie dann die ELISpot-Membran an der Luft, die vor Licht geschützt ist. In dieser Spender-PBMC-Probe waren nach der Lyse der roten Blutkörperchen und der Depletion der adhärenten Zellen etwa 10 Prozent der Lymphozyten CD19-positive B-Zellen.

Im B-Zell-Kompartiment waren etwa 50 Prozent der Zellen CD27-negative naive B-Zellen und 50 Prozent CD27-exprimierende Gedächtnis-B-Zellen. Die CPG-Behandlung von gereinigten humanen B-Zellen und CD19+CD27+ für fünf Tage, wie gerade gezeigt, führt typischerweise zur Erzeugung von 50 bis 200 IgM- und 10 bis 50 IgG-Antikörperzellen, die von einer mal zehn bis zu den vierten aktivierten B-Zellen sezerniert werden. Einmal gemeistert, kann diese ELISpot-Technik in drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, ist es wichtig, daran zu denken, die Stelle mit geeigneten Einfangreagenzien zum Nachweis der Antikörper-Sekretionszellen zu codieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Vakzinologie, um die Wirksamkeit von Impfstoffen in groß angelegten Studien und longitudinalen Follow-ups zu untersuchen. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man menschliche B-Zellen aus dem Blut reinigt.

Trennen Sie naive und Gedächtnis-B-Zellen für ihre Differenzierung und führen Sie einen ELISpot-Aufsatz durch, um Antikörper-sekretierende Zellen zu qualifizieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Blut gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten.