Name: Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut mittels ELISpot-Assay. Diese Methode ermöglicht die Einzelzellanalyse humoraler Immunantworten für die Impfstoffforschung.

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Diese Studie wurde durch ein Forschungsstipendium des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie des Exekutiv-Yuan von Taiwan (NSC99-2320-B-002-011) unterstützt. Ich möchte mich für den exzellenten Service bedanken, den der durchflusszytometrische Analyse- und Sortierkern des ersten Kernlabors am College of Medicine der National Taiwan University bietet.

Menschliche periphere Blut muss von gesunden Spendern unter informierte Einwilligung eingeholt werden, und die Verwendung von Blutproben müssen den genehmigten Leitlinien, die einzelnen Institutional Review Boards entsprechen. In dieser Studie auf das Protokoll menschlichem Blut an einer Demonstration der Ergebnisse der Durchflusszytometrie (Abbildung 1) und ELISPOT - Tests verwenden (Abbildung 3) wurde durch den Internal Review Board der National Taiwan University Hospital (Protokollnummer 201307019RINB) zugelassen. 1. Isolierung und Reinigung von humanen peripheren Blut-B-Zellen <ol><li> Zeichnen ~ 10 ml Blut aus dem Median Cubitalvene (in der Ellenbeuge anterior zum Ellenbogen) in einen 15-ml - Röhrchen mit K 2 EDTA (1,5 bis 2,0 mg / ml Blut) und sofort wird das Röhrchen mehrere Male Gerinnsel zu verhindern Bildung. </li><li> 35 ml autoklavierten (121 ° C, 15 min) von roten Blutzellen (RBC) Lyse - Puffer (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, und 1 mM EDTA; pH 7,4) an dem Rohr die frische Blutprobe (≥ 3: 1 enthält, vol / vol) und Inkubieren bei Raumtemperatur (RT) für nicht mehr als 5 min. HINWEIS: Das Aussehen der Lichtdurchlässigkeit durch das Rohr zeigt die Beendigung der RBC-Lyse. </li><li> Zentrifuge bei 600 × g bei RT für 5 min. Stellen Sie sicher, dass das Pellet in der Farbe weiß ist. </li><li> Das Pellet mit 10 ml autoklavierten phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na 2 HPO 4 und 1,47 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) und zentrifugiert wie in Schritt 1.3. </li><li> Überstand verwerfen, das Pellet mit 10 ml RPMI 1640-Medium (ergänzt: 10% fötalem Kälberserum, 100 U / ml Penicillin / Streptomycin, 0,25 ug / ml Amphotericin B, und 2 mM L-Glutamin), und die dann die Platte Zellen in einer 10 cm Kulturschale (10 ml Blut pro Schale). Die Schale in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 für 30 min. </li><li> wirbeln Sie leicht die Kulturschale ein paar Mal und legen Sie dieKulturmedium (Suspensionszellen) in 15-ml-Kunststoff konische Röhrchen. Entsorgen Sie die anhaftenden Zellen (meist Makrophagen) auf den Kulturschalen. </li><li> Zentrifuge bei 600 × g bei RT für 5 min. Überstand verwerfen. </li><li> Das Pellet mit 1 ml RPMI-1640-Medium. Zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der isolierten Leukozyten beträgt normalerweise mehr als 90% durch Trypanblau-Ausschluss. </li><li> Zentrifuge wie in Schritt 1.7 und Resuspendieren der Zellen in ~ 200 &amp; mgr; l kaltem PBS - Puffer (0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA) bei einer Konzentration von von 5 bis 10 x 10 6 Zellen / mL. </li><li> Werden 5 &amp; mgr; l von biotinyliertem anti-humanem AB - Cocktail spezifischen Blutzellen (für die negative Selektion von B - Zellen) pro 10 6 Zellen und Inkubieren auf Eis für 30 min 21. HINWEIS: Die Anti-Human-Ab-Cocktail sollte zumindest Abs spezifisch für CD2 (oder CD3), CD14 und CD16 umfassen. </li><li> Fügen Sie einen 10-fachen Überschuss Volumensteriler PBS zu den Zellen, Zentrifuge bei 600 × g für 5 min und der Überstand verworfen. </li><li> In gleichen Mengen an Streptavidin-konjugierten Microbeads (5 &amp; mgr; l pro 10 6 Zellen) zu dem Pellet und gründlich mischen. </li><li> Inkubieren auf Eis für 30 min in einem 15 ml konischen Kunststoffrohr. </li><li> 2 mL PBS-Puffer in das Rohr. </li><li> Das Röhrchen wird in einem Magnetfuß und Inkubation bei RT für 8 min. Die braunen Microbeads allmählich neben dem Magneten 22 an der Rohrwand befestigen. </li><li> Mit dem Rohr in dem magnetischen Ständer verbleiben, übertragen sorgfältig den Überstand in ein neues steriles 15-ml - Röhrchen 22. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,14-1,16, und verbinden die beiden Überstände, die die unberührte B-Zellen enthalten. Entsorgen Sie die Mikrokügelchen. </li><li> Zentrifuge bei 600 × g bei RT für 5 min. Überstand verwerfen. </li><li> Das Pellet in RPMI 1640-Medium für Downstream-Experimenten. HINWEIS: In der Regel, 1 - 5 x 10 5 B - Zellen witha Reinheit von mehr als 95% von 10 ml peripherem Blut 23 isoliert werden. </li></ol> 2. Reinigung und Trennung von Speicher- und Naïve B-Zellen aus B-Zellen isoliert <ol><li> Verwenden gereinigten Zellen aus Schritt 1 und bestimmen die Zellzahl einer Zählkammer oder eine automatische Zellzähler verwendet wird. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 100 &amp; mgr; l kaltem PBS-Puffer nach der Zentrifugation bei 600 xg und RT für 5 min. </li><li> Hinzufügen von 1 bis 2 &amp; mgr; g biotinyliertem CD27 mAb pro 10 6 Zellen und Inkubieren auf Eis für 30 min. </li><li> 10 ml PBS-Puffer in das Röhrchen und Zentrifugieren bei 600 xg für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 50 &amp; mgr; l PBS-Puffer. </li><li> Hinzufügen gleiche Mengen von Streptavidin magnetische Microbeads (1 - 2 &amp; mgr; g / 10 6 Zellen) zu den Zellen in einem 15-ml - Kunststoff - konisches Rohr. </li><li> Vorsichtig mischen gut und Inkubation auf Eis für 30 min. </li><li> Hinzufügen von 2 bis 3 ml PBS-Puffer in das Röhrchen. </li><li> Setze dasRohr in einen magnetischen Ständer und für 8 Minuten bei RT inkubieren, die braunen Microbeads zu ermöglichen an der Seite am nächsten zu dem Magneten zu befestigen. </li><li> Mit dem Rohr in dem magnetischen Ständer übertragen sorgfältig den Überstand-Fraktion in ein neues steriles Röhrchen. Diese Fraktion enthält die angereicherten CD27 - naiven B - Zellen. </li><li> Wird in 5 ml der Röhre die Mikrokügelchen enthält , und resuspendieren sanft die Mikrokügelchen (dh der angereicherten Fraktion von CD27 + Gedächtnis - B - Zellen) , 24-25. </li><li> Zentrifuge bei 600 × g bei RT für 5 min. Resuspendieren der Pellets mit RPMI 1640-Medium für die Downstream-Experimenten. HINWEIS: In der Regel ~ 30 - gereinigt werden können , 60% der B - Zellen als CD27 + Speicherzellen von den PBMCs eines gesunden Spenders 7, 25-26. </li></ol> 3. Zellsortierung für die Sammlung von Naïve B Zellen, Gedächtnis-B-Zellen und PBs / PCs <ol><li> Unter Verwendung der aus Schritt gereinigten Zellen 1, bestimmen die Zellzahl eine hemocytome mitter oder eine automatische Zellzähler. </li><li> Resuspendieren der Zellen in kaltem PBS - Puffer bei einer Konzentration von 10 7 pro ml in einem 5 ml - Polystyrolröhrchen. </li><li> Merken 1 - 2 ug Human - IgG pro 10 6 Zellen und Inkubation auf Eis für 10 min für den Block Fc. </li><li> 1 &amp; mgr; g jedes der Anti-CD19-APC (Klon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (Klon: O323) und Anti-CD38-PE (Klon: HIT2) pro 10 6 Zellen; gut mischen und Inkubation auf Eis für 30 min 4, 27. </li><li> In den letzten 5 Minuten in Schritt 3.4, fügen Sie 5 ul der kommerziellen 7-Aminoactinomycin D (7-AAD). </li><li> 2 mL PBS zu dem Rohr, vortex und Zentrifuge bei 600 × g für 5 min. </li><li> Resuspendieren der Zellen in Sortierpuffer (steriles PBS mit 2% BSA und 2 mM EDTA) bei einer Konzentration von 1 bis 5 x 10 7 Zellen pro ml in einem Rohr 15 mL. </li><li> Filtern Sie die Zellen durch eine Nylon-Mesh-Zelle Sieb (40 &amp; mgr; m Porengröße) Zellklumpen zu beseitigen. </li><li> Trennen der Zellen mit einer durchflusszytometrischen sorter ausgestattet mit drei Laser: violett (405 nm), Blau (488 nm) und Rot (640 nm). HINWEIS: Der blaue Laser allein reicht für 3-Farben - 27-28 Durchflusszytometrie. </li><li> Sortieren Sie die Zellen in drei 15-ml - Röhrchen für die gleichzeitige Sammlung von naiven B - Zellen (CD19 + CD27 -) (5 ml RPMI - Medium enthält), Gedächtnis - B - Zellen (CD19 + CD27 +) und PBs / PCs (CD19 + CD27 + / hallo CD38 +) 3-4, 28. HINWEIS: Sortieren naiven und Gedächtnis-B-Zellen können kultiviert werden, wie in Schritt 4 beschrieben. </li></ol> 4. In vitro Differenzierung von isolierten humanen CD19 + B - Zellen, Gedächtnis - B - Zellen CD19 + CD27 + und CD19 + CD27 - Naïve B - Zellen <ol><li> Unter Verwendung der gereinigten Zellen in den Schritten 1.19, 2.10, 2.11 und 3.10, bestimmen die Zellzahl mit einem Hämozytometer oder eine automatische Zellzähler. </li><li> Resuspendieren der Zellen mit RPMI 1640-Medium,bei einer Konzentration von 1 - 10 x 10 5 pro mL und sie in die Vertiefungen einer 12-Well - Platte aliquotiert. </li><li> Hinzufügen CpG (ODN 2006) bei 5 &amp; mgr; g / 10 6 Zellen / mL 18, 29. </li><li> Kultur der Zellen in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 für 5 Tage. </li><li> Ernten Sie die Zellen aus jeder Vertiefung, legen Sie sie getrennt in 15-ml-Röhrchen, 5 ml PBS in jedes Röhrchen und zentrifugieren bei 600 xg und RT für 5 min. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer oder eine automatische Zellzähler. Resuspendieren der Zellen in einer Konzentration von 1 - 10 x 10 5 pro ml mit RPMI - 1640 - Medium. </li></ol> 5. ELISPOT-Assay <ol><li> Zugabe von 30 &amp; mgr; l 35% Ethanol in destilliertem Wasser zu jeder Vertiefung der ELISpot-Platten für 30 s. HINWEIS: Beim Pipettieren vermeiden jederzeit in den Vertiefungen der Membran zu berühren. </li><li> Invert ELISPOT Platten um das Ethanol zu entfernen. </li><li> Setzen Sie 150 ul autoklaviert ddH 2 O in jede Vertiefung und inkubierensie bei RT für 5 min zu spülen Sie das restliche Ethanol aus; 3 min mit einer Wasch von sterilem PBS bei RT folgen. HINWEIS: Die Schritte 5.1 bis 5.3 optional sein können, abhängig von der Herstellung der Platten. </li><li> Stellen 50 ul von 5 ug / ml polyklonalen F (ab &#39;) 2 - Fragment von anti-human - Ig (IgG + IgM + IgA) (in PBS) in jede Vertiefung der ELISpot Platten und Inkubieren sie bei 4 ° C über Nacht (bevorzugt) oder 37 &amp; deg ; C für 2 h 11. HINWEIS: Seal die Ränder der Platten mit Parafilm bis zur Verwendung. </li><li> Kehren Sie die Platten nicht gebundenen Abs zu entfernen, 200 &amp; mgr; l PBS in jede Vertiefung und inkubieren sie zweimal bei RT für 3 Minuten jedes Mal. </li><li> Mit 200 ul PBS mit 5% BSA (oder RPMI 1640-Medium) zu jeder Vertiefung für die Blockierung und inkubieren bei RT für 2 h. </li><li> Kehren Sie die Platten, die die Blockierungspuffer zu entfernen. Waschen jede Vertiefung zweimal mit 200 ul PBS, wie in Schritt 5.5. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l RPMI 1640-Medium in jede Vertiefung und Inkubieren sie bei 37 ° C. </li><li> Wenn Sie bereit sind, die Zellen auf Seed-, invertieren die Platten das RPMI 1640-Medium zu entfernen. </li><li> Seed 100 ul (5 · 10 &amp; sup4 ; ), 50 &amp; mgr; l (2,5 x 10 &amp; sup4 ; ) und 25 ul (1,25 x 10 4) der Zellen (von den Schritten 1,19, 2,10, 2,11, 3,10 und 4,6) in die Vertiefungen einer ELISpot Platte. Mit RPMI 1640-Medium, bringen das Volumen auf 150 &amp; mgr; l / Vertiefung. HINWEIS: Ein Minimum von einer oder zwei 2-fache serielle Verdünnungen für die Zellen Plattieren wird empfohlen. </li><li> Inkubiere die Platten in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 für 8-14 h 18. Vermeiden Sie die Platten während der Inkubation zu bewegen. </li><li> Kehren Sie die Platten, die die Zellen und RPMI-1640-Medium zu entfernen. </li><li> Mit 200 &amp; mgr; l / Vertiefung PBS-T (PBS mit 0,05% Tween 20) und inkubieren sie 5 mal bei RT, jeweils für 3 min. Die Platte umdrehen den Waschpuffer zwischen jedem der 5 Wäschen zu entfernen. </li><li> Fügen entweder Ziege-anti-human-IgG-alkalische Phosphatase (AP), Fcy-spezifischen Abs (für IgG-Nachweis, 1: 5.000 in PBS-T) Oder Ziege-anti-human IgM-AP, Fcμ fragmentspezifische Abs (für IgM-Erkennung, 1: 5.000 in PBS-T) in die vorgesehenen Vertiefungen und für 2 h im Dunkeln bei RT inkubieren. </li><li> Waschen jede Vertiefung zweimal mit 200 ul PBS, wie in Schritt 5.5. </li><li> In 50 ul / Vertiefung Bromchlorindolylphosphat-Nitro-Blau-Tetrazolium (BCIP / NBT) Substratlösung. Lilafarbener Flecken erscheinen normalerweise in 5 bis 15 min. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l / Vertiefung von ddH 2 O , um die übermäßige Entwicklung von Flecken zu verhindern. </li><li> Spülen Sie die Platten mit fließendem Leitungswasser nach der vollständigen Entwicklung aller Flecken. </li><li> Entfernen Sie die unterirdische Entwässerungs der Platten und lassen sie in der Dunkelheit an der Luft trocknen. </li><li> Zählen Sie die Flecken mit einem automatischen Plattenlesegerät mit einer Bildaufnahme / Analyseeinheit (zB ein automatischer Scanner oder manuell über ein Binokular). HINWEIS: Die Platten können später bei RT im Dunkeln und analysiert gespeichert werden. </li></ol>

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</ol>

Der Autor erklärt keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Isolierung und Reinigung von humanen peripheren Blut-B-Zellen Normalerweise können RBCs effizient durch Lysepuffer (Schritt 1.2) gebrochen und gelöscht werden. Es ist wichtig, nicht die PBMCs mit dem RBC-Lyse-Puffer länger als 5 min inkubieren, da die Lebensfähigkeit der Zellen kann durch das Ammoniumchlorid beeinflußt werden. Alternativ kann RBCs und Blutplättchen gleichzeitig durch das folgende Protokoll entfernt werden. Mischen frisches Vollblut mit Säure-Citrat-...

B-Zellen spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung der humoralen Immunität. Sie entwickeln sich zunächst im Knochenmark und geben Sie den Blutstrom als naive B-Zellen, die in die lymphatischen Geweben, wie der Milz wandern können, Lymphknoten und Mandeln, für die weitere Entwicklung. Bei Ag Begegnung einige naive B-Zellen wandern in Lymphfollikeln, wo Keimzentrum-B-Zellen in den Speicher B-Zellen und Plasmablasten unterscheiden können (PBS) / Plasmazellen (PCs). Während die meisten PBs / PCs in den Blutstrom Egress, liegen einige schließlich im Knochenmark terminale Differenzierung in langlebigen PCs 1 zu unterziehen. B - Zellen im Umlauf sind heterogen, und in einem stabilen Zustand, PBs / PCs sind selten im peripheren Blut 2. Als Folge der Verfügbarkeit von Lineage-spezifische Oberflächenmarker hat Durchflusszytometrie eine beliebte Methode zur Identifizierung und Charakterisierung der B-Zell-Untergruppen in peripherem Blut werden. Eine erweiterte Anwendung von Fluss cytometry ist die Zugabe eines Zellsortierer-Funktion, die die Trennung und Isolation der einzelnen Untergruppen von B-Zellen mit hoher Reinheit ermöglicht. Basierend auf der Expression spezifischer Oberflächenrezeptoren in verschiedenen Entwicklungsstadien werden menschliche zirkulierende B - Zellen allgemein in drei Haupt Subpopulationen: naive B - Zellen (CD19 + CD27 - CD38 -), Gedächtnis - B - Zellen (CD19 + CD27 + CD38 -) und PBs / PCs (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Abbildung 1). Naive B-Zellen von Natur haben Ags nicht auf. Jedoch können sie differenziert IgM + CD27 + Gedächtnis - B - Zellen sein. Obwohl naive B - Zellen sind homogene B-Zell - Antigenrezeptor (BCR) -assoziierten Moleküle (zB CD19, CD20 und CD22) sie heterogen in ihrer Immunoglobulin Repertoire in 5 ausdrückt. Die Mehrheit der CD27 + Gedächtnis - B - Zellen können in CD27 unterschieden werden+ / hallo CD38 + PBs / PCs 6. Darüber hinaus Gedächtnis - B - Zellen und PBs / PCs sind polyklonalen und zeigen Entwicklungs und funktionelle Heterogenität 4-7. PBs / PCs im Umlauf sind in der Regel von kurzer Dauer und nicht CD138 Ausdruck bringen, sondern solche aus im Knochenmark zu beruhigen wird terminal differenzieren und werden langlebig. Ausdifferenzierten PCs exprimieren CD138 und CD27 - Moleküle auf ihren Oberflächen 8 herunterregulieren. Da sowohl PBs und PCs geeignet sind, sezer Abs, in vielen Fällen sind sie gemeinsam als ASCS bezeichnet. Im Gegensatz dazu weder naive B - Zellen noch Gedächtnis - B - Zellen können erhebliche Mengen an Abs 9-10 produzieren. Dennoch, als isoliert, sowohl naiven und Gedächtnis - B - Zellen können in 3 in ASCS differenziert - 10 Tage , an denen 6 in der richtigen Kulturbedingungen gelegt, 15.11. In der Tat, abgeleitet ASCS von in vitro Differenzierung teilen ähnliche Oberfläche Ausdrücke von CD27 und CD38 mit denen direkt isoliert from peripheren Blut 6. Darüber hinaus unterscheiden sich die ASCs in vitro eine geringe Oberflächen CD20, ähnlich dem von zirkulierendem PBs / PCs 6 auszudrücken. Obwohl die Kultur stamm ASCs alle kurzlebigen sind, können sie Abs sezernieren, was anzeigt, dass sie funktionell kompetent sind und in der Lage der humoralen Immunität beitragen. Beide ELISA und ELISpot sind bei weitem die am häufigsten angewandten Methoden, mit denen auf die humorale Immunantwort funktionelle Informationen zu erhalten. ELISA ist ein 96-Well - Platte-basierten Assays, und es ist häufig der Titer des Serums Ag-spezifischen Abs und anderen Analyten (zB Cytokine) zu messen. Es ist bequem und skalierbar. ELISA ist ein Festphasen Enzym - Assay zu verwenden , 16 das Vorhandensein von Abs oder anderen Substanzen, wie Serum, in einer flüssigen Probe nachzuweisen. Die Auslesungen aus Serum ELISAs wurden, um die Immunantwort des Körpers darzustellen weit verbreitet. Ein Werkzeug erforderlich für den Erwerb von Readouts von ELISA-Assays ist ein spektrophotometrische Mikrotiterplatten-Lesegerät. Der Leser kann die optische Dichte (OD) der Endprodukte typischerweise bestimmen , aus der Reaktion von Meerrettich - Peroxidase (HRP) -konjugierte Detektions Abs und ihre spezifischen Substrate resultierenden 17. Hinsichtlich der humoralen Immunantwort auf die Berichterstattung, Serum Ab Ebenen durch ELISA bestimmt bezeichnen die kollektive, nicht aber einzelne, Leistung von ASCS im Körper. Außerdem versagt ELISA berücksichtigt die Beteiligung von Gedächtnis-B-Zellen, die sekretieren Abs nicht. Wie ELISA ist ELISpot ein weit verbreitetes Verfahren zum Nachweis und der Überwachung der Immunantwort in peripheren Blutproben 17-18. ELISpot ist eine Technik, um einen Sandwich-ELISA bezogen. Darin werden die Zellen in das Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membran-backed Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten gegeben für eine Kurzzeitkultur. Der ELISPOT-Assay ist analog zur Durchführung Western-Blotting auf einer Mikrotiterplatte und developing die Flecken auf der PVDF-Membran in jeder Vertiefung. Ein automatisiertes ELISpot Lesesystem oder ein Stereomikroskop für die manuelle Zählung ist nicht erforderlich. Der Hauptvorteil der ELISpot in einer Immunantwort Erfassungs ist seine hervorragende Empfindlichkeit in der Quantifizierung von ASCs und Cytokin-sezernierenden Zellen. Er berichtet ihre funktionellen Aktivitäten in humoralen und zellulären Immunität sind. Bei der Messung der humoralen Immunfunktion, Serum Ab durch ELISA und der Anzahl von ASCs bestimmt Ebenen durch ELISpot aufgezählt werden oft korreliert, aber die Daten Ablesungen aus diesen beiden Assays haben einige Unterschiede in der funktionellen Auswirkungen 19-20. Der Hauptvorteil der ELISpot ist die Empfindlichkeit der Methode. Die Höhe des Serum-Ab-Titer, wie durch ELISA berichtet wird, semi-quantitativ als OD Ablesungen dargestellt, um die relative Ab Ebene bezeichnet, oder mehr quantitativ, als Konzentration Ablesungen, wenn eine bekannte Menge an den richtigen Isoformen der ABS ist als Referenz enthalten. Im Gegensatz dazu sind die Ergebnisse der ELISpot presented als die absolute Zahl der Anbeterinnen in einem Zellpool von Interesse (zB unfraktioniertem einkernigen peripheren Blutzellen (PBMCs) und gereinigte B - Zellen aus PBMCs). ELISpot können einen einzelnen ASC erkennen, aber ELISA erfordert Ab Mengen von ASCS optimierten Assay abhängigen Konzentrationen vor der Messung zu erreichen. Daher ELISpot ist offensichtlich überlegen ELISA in Empfindlichkeit der Quantifizierung. Außerdem ist ELISpot auch für die in vitro differenzierte ASCs von aktivierten Gedächtnis - B - Zellen zu quantifizieren. Gedächtnis-B-Zellen sezernieren Abs nicht aber in ASCS bei Aktivierung unterscheiden kann; Sie haben daher keinen Beitrag zum Serum durch ELISA nachgewiesen Abs. Somit ist ELISpot die Methode der Wahl bei der Messung der Immunantwort des Speichers B-Zellen nach der Aktivierung in Kultur zirkuliert. Es ermöglicht die Überwachung der Aufrechterhaltung der Langzeit humorale Immunität.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer K2E</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td>10 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>endotoxinfrei</td></tr><tr><td>Trypanblau 0,5%ige Lösung</td><td>Biological Industries</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>IMag Human B Lymphozytenanreicherungsset</td><td>BD Biosciences</td><td>558007</td><td></td></tr><tr><td>biotinyliertes CD27 mAb</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>Klon O323</td></tr><tr><td>Streptavidin magnetische Mikrokügelchen</td><td>BD Biosciences</td><td>9000810</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Blaues Nylon-Mesh-Zellsieb, 40 & mu; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD19-APC</td><td>Biolegend</td><td></td><td>302212-Klon HIB19</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD27-eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0279-42</td><td>Klon O323</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD38-PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td>303516-Klon HIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD38-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>560677</td><td>Klon HIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td></td><td>304006-Klon HI30</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482-Klon HI30</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus/Ratte/Mensch CD27-PerCP Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td></td><td>124213-Klon LG.3A10</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD27-PerCP Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>65429</td><td>Klon L128</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD19-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-064</td><td>Klon LT19</td></tr><tr><td>Anti-humaner CD19-FITC</td><td>GeneTex</td><td></td><td>GTX75599-Klon LT19</td></tr><tr><td>Anti-humaner CD20-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555622</td><td>Klon 2H7</td></tr><tr><td>biotinyliertes anti-humanes CD27</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>Klon O323</td></tr><tr><td>biotinyliertes anti-humanes CD27</td><td>eBioscience</td><td>13-0279-80</td><td>Klon O323</td></tr><tr><td>7-Aminoactinomycin D (7-AAD)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>CpG (ODN 2006)</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-2006</td><td>Typ B CpG</td></tr><tr><td>Rekombinant human IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant human IL-10</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant human IL-21</td><td>PeproTech</td><td>200-21</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant human sCD40L</td><td>PeproTech</td><td>310-02</td><td></td></tr><tr><td>Protein A von S. aureus Cowan (SAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82526</td><td></td></tr><tr><td>Pokeweed Mitogen (PWM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9379</td><td></td></tr><tr><td>MultiScreen Filterplatten, 0,45 &micro; Mio. Porengröße</td><td>Merck Millipore</td><td>MSIPS4510</td><td>sterile, klare 96-Well-Filterplatte mit hydrophober PVDF-Membran</td></tr><tr><td>BCIP/NBT-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6404</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT Einzelreagenz, alkalisches Phosphatase-Substrat</td><td>Merck Millipore</td><td>ES006</td><td></td></tr><tr><td>Humanes IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Humanes IgG, Fc-Fragment</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 Fragment von Ziegen-Anti-Human-Ig (IgG + IgM + IgA)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-127</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-IgG-Phosphatase gegen Ziegen, Fc&gamma-Fragment-spezifisch</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Human-IgM-alkalische Phosphatase, Fc&micro; fragmentspezifisch</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-043</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-IgG-Peroxidase, Fc&gamma-Fragment-spezifisch</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-008</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Human-IgM-Peroxidase, Fc&Mikro; fragmentspezifisch</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-095</td><td></td></tr><tr><td>BD ELISPOT AEC-Substrat-Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>551951</td><td></td></tr><tr><td>C.T.L. ImmunoSpot-Analysator</td><td>C.T.L.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die isolation, differenzierung und quantifizierung von human-antikörper-sezernierenden b-zellen aus blut: elispot als functional readout der humoralen immunität

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Das Kennzeichen der humoralen Immunität ist funktional ASCs zu erzeugen, das zu synthetisieren und ABS spezifisch für ein Antigen (Ag), beispielsweise einem Pathogen sekretieren, und sind für Wirtsabwehr eingesetzt. Zur quantitativen Bestimmung des funktionellen Status der humoralen Immunantwort eines Individuums, sowohl Serum Abs und Zirkulieren ASCs als funktionelle Auslesungen üblicherweise gemessen. Beim Menschen ist peripherem Blut die bequemste und leicht zugänglich Probe, die zur Bestimmung der humoralen Immunantwort durch den Host B-Zellen hervorgerufen werden können. Distinct B-Zell-Untergruppen, einschließlich ASCS, kann über die Auswahl mit linienspezifischen Ab-konjugierte Mikrobeads oder über Zellsortierung mit Durchflusszytometrie direkt aus dem peripheren Blut isoliert werden. Darüber hinaus kann gereinigtes naiven und Gedächtnis-B-Zellen in Kultur in ASCs aktiviert und differenziert werden. Die funktionellen Aktivitäten von ASCs zu Ab Sekretion beitragen kann durch ELISpot quantifiziert werden, was ein Assay, Enzym konvergiert ist-linked immunoabsorbance-Assay (ELISA) und Western-Blot-Technologien, um die Aufzählung einzelner ASCS auf Einzelzellebene zu ermöglichen. In der Praxis hat sich die ELISPOT-Tests zunehmend verwendet Impfstoffwirksamkeit zu bewerten, wegen der Leichtigkeit der Handhabung einer großen Anzahl von Blutproben. Die Verfahren zur Isolierung von humanen B - Zellen aus dem peripheren Blut, die Differenzierung von B - Zellen in ASCs in vitro und die Verwendung von ELISpot für die Quantifizierung von Gesamt - IgM- und IgG-ASCs wird hier beschrieben.

PBMCs wurden von roten Blutkörperchen und anhaftenden Zellen verarmt (Schritte 1,2 bis 1,7). Ein Aliquot (2 x 10 6) Zellen wurden zu einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen , um die Populationen von naiven B - Zellen, Gedächtnis - B - Zellen und PBS / PCs in dem peripheren Blut (Abbildung 1) veranschaulichen. In diesem PBMCs des Spenders, etwa 10% der Lymphozyten waren CD19 + B - Zellen. In der B-Zellenraum ist der Anteil der CD19 +</...

Menschliches peripheres Blut wird häufig zur Beurteilung der humoralen Immunantwort verwendet. Im Folgenden werden die Methoden zur Isolierung humaner B-Zellen aus peripherem Blut, zur Differenzierung humaner B-Zellen in Antikörper (Ab)-sezernierende B-Zellen (ASCs) in Kultur und zur Aufzählung der Gesamt-IgM- und IgG-ASCs über einen ELISpot-Assay beschrieben.

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Das übergeordnete Ziel dieser ELISpot-Methode besteht darin, die Quantifizierung menschlicher antikörpserzeugender B-Zellen aus dem Blut zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im biomedizinischen Bereich bezüglich der Immunologie der B-Zellen und der Impfstoffforschung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Detektion und Messung antikörpserzeugender B-Zellen auf Einzelzell-Ebene ermöglicht wird.Den Versuch wird Tsung-Chih Tseng, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Unmittelbar nach der Entnahme einer 10-ml-Blutprobe aus der Vena mediana cubiti in ein 15-ml-Röhrchen mit kaliumhaltigem EDTA das Röhrchen mehrmals umdrehen, um Gerinnung zu verhindern. Anschließend 35 ml autoklavierten Erythrozyten-Lysepuffer zu den Zellen geben und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Wenn Licht durch das Röhrchen hindurch sichtbar ist, zentrifugieren Sie das Blut und bestätigen Sie das Vorhandensein eines weißen Pellets. Entfernen Sie den restlichen Lysepuffer mit 10 ml autoklaviertem PBS und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml RPMI 1640 Medium. Impfen Sie die Zellen in einer 10 cm-Kulturschale für eine 30-minütige Inkubation bei 37

the-isolation-differentiation-quantification-human-antibody-secreting

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Identifizierung von mikrobiellen Ziele der adaptiven Immunität bei idiopathischer Krankheiten können durch die Verwendung des enzyme-linked immunospot Test durchgeführt werden.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantifizierung von Th-1 zelluläre Immunantworten gegen mikrobielle Antigene

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von B-Zellen aus menschlichem peripherem Blut mit biotinylierten Antikörpern, die spezifisch für Nicht-B-Zellen sind, und Streptavidin-konjugierten magnetischen Mikrokügelchen.

Isolierung und Reinigung von B-Zellen aus menschlichem peripherem Blut

In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll für die durchflusszytometrische Sortierung von naiven B-Zell-, Gedächtnis-B-Zell- und Plasmablasten-Plasmazell-Subpopulationen aus menschlichen peripheren Blut-B-Zellen. Die verschiedenen B-Zell-Subpopulationen können anhand einer Fluorophor-basierten Antikörperbindung an die CD19-, CD27- und CD38-Rezeptoren unterschieden werden, die auf den B-Zell-Oberflächen exprimiert wird, gefolgt von einer Zellsortierung.

Durchflusszytometrische Zellsortierung für verschiedene zirkulatorische B-Zellpopulationen

Dieses Video zeigt die Verwendung des ELISpot-Assays zur Beurteilung der Funktion von Antikörper-sezernierenden B-Zellen, ASCs. Die von den ASCs sezernierten Antikörper interagieren mit den membrangebundenen polyklonalen Antikörperfragmenten, die von den enzymkonjugierten IgG- oder IgM-Antikörpern nachgewiesen werden. Der farbige Fleck, der in jeder Vertiefung produziert wird, zeigt das Vorhandensein des Isotyps des spezifischen Antikörpers an, der mit der sekretorischen Aktivität der B-Zellen...

Funktionelle Bewertung von Antikörper-sezernierenden B-Zellen mittels ELISpot-Assay

Neue Generationen von Funktionstests, wie Gamma-Interferon (IFN-γ) ELISpot, die Zytokin-Produktion zu erkennen an der Einzelzellebene und bieten sowohl quantitative und qualitative Charakterisierung der T-Zell-Reaktionen können zum Zell-vermittelten Immunantworten gegen Varicella-Zoster-gerichtet zu bewerten Virus (VZV).

Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay zu beurteilen, Varicella-Zoster-Virus-spezifische Zellvermittelte Immunität nach Nabelschnurblut-Transplantation

Eine einfache aber wirksame Methode, die magnetischen Nanopartikel verwendet antigen-reaktiven B-Zellen für die funktionale und phänotypische Analyse zu erfassen und zu bereichern beschrieben.

Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung von menschlichen Antikörpern, die spezifisch für ein Antigen des Interesses, ausgehend von seltenen B-Zellen im menschlichen Blut zirkulieren. Generation dieser natürliche Antikörper ist rasch und effizient, und die Antikörper erhalten können sehr ähnliche Antigene unterscheiden.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Charakterisierung von T-abhängigen und T-unabhängige Immunglobulin (Ig) Isotype Antworten bei Mäusen mittels ELISA. Diese Methode verwendet, allein oder in Kombination mit Flow Cytometry wird erlauben Forschern, Unterschiede in der B-Zell-vermittelten Ig Isotype Antworten bei Mäusen nach T-abhängigen und T-unabhängige Antigen-Immunisierung zu identifizieren.

Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay

Die BSelex-Methode zur Identifizierung und Wiederherstellung einzelner antigenspezifischer Antikörper aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen kombiniert Durchflusszytometrie mit einzelliger PCR und Klonen.

Einzellige Screening-Methode zur Auswahl und Wiederherstellung von Antikörpern mit gewünschten Besonderheiten aus angereicherten menschlichen Gedächtnis B-Zellpopulationen

Vollblutbasierte Immunoassays bieten ein einfaches und ressourceneffizientes Werkzeug zur Analyse der antigenspezifischen Immunität für Diagnose- und Forschungszwecke. Dieser Artikel bietet ein optimiertes Vollblut-basiertes Protokoll mit dualer Co-Stimulation für eine umfassende Analyse der Immunität des Wirts gegen pilzliche und virale Krankheitserreger, einschließlich einer Version mit geringem Volumen für pädiatrische Patienten und Kleintiere.

Vollblutassay mit dualer Co-Stimulation zur antigenspezifischen Analyse der Immunität des Wirts gegen pilzliche und virale Krankheitserreger

Erfahren Sie die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut mittels ELISpot-Assay. Diese Methode ermöglicht die Einzelzellanalyse humoraler Immunantworten für die Impfstoffforschung.

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität (Video) | JoVE Journal

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

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