Name: Hoher Durchsatz, Absolute Bestimmung des Inhalts eines ausgewählten Proteins auf Gewebe Ebenen mit quantitativen Dot Blot Analyse (QDB) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Erfahren Sie die quantitative Dot-Blot-Analyse (QDB) zur absoluten Proteinquantifizierung in Mausgeweben. Diese hochdurchsatzfähige Methode ermöglicht zuverlässige Biomarker-Validierung mit einfachem Protokoll.

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Diese Arbeit wird unterstützt durch Taishan Gelehrten Bau Engineering (gt), die Shandong ausgezeichnete Young Scientist Award (ZR2016JL026, G. T.), National Natural Science Foundation of China (31771284, 3167070448 und 81641108), Shandong Provinz natürlichen Wissenschaftsstiftung (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong Provinz Wissenschaft und Technologie (J14LE01 und J15LK03), Yantai Wissenschaft und Technologie plan(2015ZH083) und Binzhou Medizinische Universität wissenschaftliche Forschungsmittel (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), die schwedischen Forschungsrat gewähren 621-2011-4423 und 2015-4870. Diese Arbeit wird auch von "Yantai doppelte hundert Talent planen" und "Yantai Hi-Tech Zone Blue Ocean Talent Plan" gesponsert.

Alle tierische Verfahren nach Binzhou Medizinische Universität Tier Verwendung Richtlinie durchgeführt und von der ethischen fachkollegiat Binzhou Medizinische Universität genehmigt.
1. die Probenvorbereitung
<ol><li>Nehmen Sie 50 mg Maus Gewebe in einem 1,5 mL Tube. Fügen Sie 200 µL Lyse Puffer (50 mM Hepes, pH 7,4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM Na2P2O7, 1 % Triton x-100, 10 % Glycerin), ergänzt mit Protease und Phosphatase-Inhibitoren (100 mM NaF, 0,1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid, 5 µg/mL Pepstatin, 10 µg/mL Leupeptin, 5 µg/mL Aprotinin).</li>
	<li>Das Gewebe mit einem Homogenisator für 1 min auf Eis zu homogenisieren.</li>
	<li>Zentrifuge für 10 min bei 8 000 x g bei 4 ° C.</li>
	<li>Sammeln des Überstands in neue Schläuche (1,5 mL) und 1 µL für Protein-Konzentration-Assay mit BCA Kit herausnehmen. Hinweis: Alle gängigen Lyse-Puffer für western-Blot und Dot-Blot Analyse können für QDB Analyse verwendet werden.</li>
</ol>2. Bestimmung der Spezifität der Antikörper
<ol><li>Bereiten Sie Probe Lysates (20 µg) in Abschnitt 1.4, IgG kostenlose BSA (20 µg) standard Protein (600 Pg), western-Blot Analyse. Hinweis: IgG kostenlose BSA dient als Negativkontrolle und das standard-Protein dient als Positivkontrolle. Die Spezifität des Antikörpers wird durch ein Band der richtige Größe mit der western-Blot Analyse zeigt gezeigt.</li>
</ol>3. Definition des linearen Bereichs der QDB Analyse
<ol><li>Lösen Sie das standard-Protein mit DdH2O. verdünnt das Protein zu einer Konzentration von 1.200 Pg/µL.</li>
	<li>Verdünnen Sie das konzentrierte Protein aus den vorbereiteten Proben in Abschnitt 1.4 bis 4 µg/µL.</li>
	<li>Lösen Sie die BSA mit DdH2O. verdünnt das Protein zu einer Konzentration von 1.200 Pg/µL und 4 µg/µL.</li>
	<li>Eine Reihe von Verdünnung von standard Protein und vorbereiteten Proben waren bereit, unter der Leitung von Tabelle 1 und Tabelle 2.</li>
	<li>Proben und 10 µL 2 x Ladepuffer Mix 10 µL Verdünnung standard Protein oder Verdünnung vorbereitet (120mM Tris-HCl pH 6,8, 20 % Glycerin, 4 % SDS, 0,2 % Bromphenol blau, 200 mM DVB-t) zusammen.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>S1 (0pg/µl)</td>
			<td>S2 (33.3pg / µl)</td>
			<td>S3 (100pg/µl)</td>
			<td>S3 (300pg/µl)</td>
			<td>S5 (600pg/µl)</td>
			<td>S6 (1200pg/µl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard protein(1200pg/µl)</td>
			<td>0</td>
			<td>1.39</td>
			<td>4.17</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kostenlose BSA igG (4pg/µl)</td>
			<td>50</td>
			<td>48.61</td>
			<td>45.83</td>
			<td>37,5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>insgesamt</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Verdünnung Schema für standard Protein Kurve.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>X1 (0µg/µl)</td>
			<td>X2 (0.25µg / µl)</td>
			<td>X3 (0.5µg / µl)</td>
			<td>X4 (1µg/µl)</td>
			<td>X5 (2µg/µl)</td>
			<td>X6 (4 µg/µl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sample(4µg/µl)</td>
			<td>0</td>
			<td>3,125</td>
			<td>6.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kostenlose BSA(4µg/µl) igG</td>
			<td>50</td>
			<td>46.875</td>
			<td>43.75</td>
			<td>37,5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>insgesamt</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2. Verdünnung Schema für vorbereiteten Proben
<ol start="6"><li>Erhitzen Sie die Mischungen bei 85 ° C für 5 min.</li>
</ol>4. Ablauf der QDB Analyse
<ol><li>
Beispielanwendung
	<ol>
<li>Unterstützen Sie die QDB-Platte um die Unterseite der Platte berühren der Oberfläche des Tisches zu vermeiden. Zum Beispiel verwenden Sie eine leere Pipette-Info-Feld als Unterstützung.</li>
		<li>Laden Sie bis zu 2 µL der Probe in die Mitte der Membran an der Unterseite der einzelnen Einheit der QDB-Platte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trocknung der Plattenrandes
	<ol>
<li>Die geladene QDB-Platte für 1 h bei temperierten Raum (RT) oder als Alternative verlassen Sie die geladene Platte bei 37 ° C für 15 min in einem gut belüfteten Raum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sperrung der Plattenrandes
	<ol>
<li>Tauchen Sie die QDB-Platte in den Transfer-Puffer (0,039 M Glycin, 0,048 M Tris, 0,37 % SDS, 20 % Methylalkohol) und schütteln die Platte für 10 s.</li>
		<li>Spülen Sie die QDB-Platte vorsichtig mit TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung, 0,1 % Tween 20) dreimal und dann waschen der Platte für 5 min in TBST unter Konstanten schütteln.</li>
		<li>Die QDB-Platte mit blockierenden Puffer zu blockieren (5 % Magermilch in TBST (100 µL/Well) für 1 h unter Konstanten schütteln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Primärantikörper Inkubation
	<ol>
<li>Verdünnen Sie den primären Antikörper in den blockierenden Puffer bei einer gewählten Konzentration (von 1:500 bis 1:5 000), und geben Sie 100 µL in jedem einzelnen eine gewöhnliche 96-well-Platte. Legen Sie die QDB-Platte in der 96-well-Platte und inkubieren Sie die kombinierten Platten entweder für 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C unter Konstanten schütteln.</li>
		<li>Alternativ legen Sie die QDB-Platte in einer Schachtel, und füllen Sie das Feld mit blockierenden Puffer 2 bis 3 mm über dem Membran-Teil der Platte, wenn die gleichen Antikörper für die ganze Platte verwendet wird. Fügen Sie den primären Antikörper bei der gewählten Konzentration und inkubieren Sie die Platte entweder für 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C durch unter Konstanten schütteln.</li>
		<li>Spülen Sie die Platte vorsichtig mit TBST dreimal bevor es dreimal, jeweils 5 min unter Konstanten schütteln mit TBST gewaschen wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sekundäre Antikörper Inkubationszeit
	<ol>
<li>Verdünnen Sie der Sekundärantikörper in den blockierenden Puffer bei der gewählten Konzentration (von 1:1 000 um 01:50, 000) und entweder aliquoten 100 µL/Well in eine 96-well-Platte oder in einer Box wie beschrieben in Abschnitt 4.4.2 und dann Brüten Sie der QDB-Platte innen entweder die geladenen 96 gut pla Te oder die Box für 1 h bei RT unter Konstanten schütteln.</li>
		<li>Spülen Sie die QDB-Platte vorsichtig 3mal mit TBST ab, dann waschen Sie die Platte für 3 mal 5 min pro mit TBST unter Konstanten schütteln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantifizierung
	<ol>
<li>Bereiten Sie verstärkte Chemilumineszenz Substrat (ECL), indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.</li>
		<li>Aliquoten ECL-Substrat zu einem 96 well-Platte (100 µL/Well) und legen Sie die QDB-Platte im Inneren der 96-well-Platte für 2 min. unter ständigen schütteln.</li>
		<li>Entfernen Sie die QDB-Platte aus 96 well-Platte und schütteln kurz um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Legen Sie die Platte auf einer weißen Mikrotiterplatte.</li>
		<li>Schalten Sie den Mikrotestplatte Leser, und wählen Sie "Teller mit Deckel" auf der Benutzeroberfläche vor Platzierung der kombinierten Platten (QDB-Platte + weiße Platte Adapter) im Inneren der Mikrotestplatte Leser zur Quantifizierung. Hinweis: Achten Sie darauf, die weißen, undurchsichtigen Mikrotiterplatte als einen Adapter verwenden, um Störungen von der Platte zu vermeiden. Achten Sie darauf, wählen "Teller mit Deckel" um zu vermeiden, Verklemmen der Maschine in Kombination Teller (QDB-Platte + 96-well-Platte Adapter) werden innerhalb der Mikrotestplatte Leser gesetzt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Western+blotting%22%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proposal+for+validation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A proposal for validation of antibodies.</a> Nat Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li>
<li>Hawkes, R., Niday, E., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dot-immunobinding+assay+for+monoclonal+and+other+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies.</a> Anal Biochem. 119 (1), 142-147 (1982).</li>
<li>Engvall, E., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay+%28ELISA%29.+Quantitative+assay+of+immunoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22G.+Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin.</a> G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).</li>
<li>Engvall, E., Jonsson, K., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay.+II.+Quantitative+assay+of+protein+antigen%2C+immunoglobulin+G%2C+by+means+of+enzyme-labelled+antigen+and+antibody-coated+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes.</a> Biochim Biophys Acta. 251 (3), 427-434 (1971).</li>
<li>Paweletz, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+phase+protein+microarrays+which+capture+disease+progression+show+activation+of+pro-survival+pathways+at+the+cancer+invasion+front%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front.</a> Oncogene. 20 (16), 1981-1989 (2001).</li>
<li>Tibes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+phase+protein+array%3A+validation+of+a+novel+proteomic+technology+and+utility+for+analysis+of+primary+leukemia+specimens+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reverse phase protein array: validation of a novel proteomic technology and utility for analysis of primary leukemia specimens and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cancer Ther. 5 (10), 2512-2521 (2006).</li>
<li>Solier, C., Langen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+proteomics+and+biomarker+research+-+current+status+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody-based proteomics and biomarker research - current status and limitations.</a> Proteomics. 14 (6), 774-783 (2014).</li>
<li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+dot+blot+analysis+%28QDB%29%2C+a+versatile+high+throughput+immunoblot+method%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantitative dot blot analysis (QDB), a versatile high throughput immunoblot method.</a> Oncotarget. 8 (35), 58553-58562 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren Yunyun Zhang, Wenfeng Zhang und Jiandi Zhang sind Mitarbeiter von Zestern Biotechniques, die QDB-Platten, die in diesem Artikel verwendeten produziert. Wenfeng Zhang und Yunyun Zhang deklarieren Interessenkonflikt, und Jiandi Zhang hat Patentanmeldungen eingereicht. Die anderen behaupten keine Interessenskonflikte.

Unter all den aktuellen verfügbaren Immunoassay Techniken der Proteinanalytik mit Ausnahme von ELISA ist QDB Analyse die einzige Methode zur absoluten Inhalt eines spezifischen Proteins auf Zell- und Gewebe Ebenen in einem hohen Durchsatz-Format zu erreichen. Obwohl mit stabilen Isotopen-Label Standard, Massenspektrometrie in der Lage, absolute Quantifizierung von ein paar Proteine zu erreichen ist, ist diese Methode noch nicht für hohe Durchsatzleistung entwickelt. In dieser Studie haben wir den Prozess der QDB Analyse zur absoluten Bestimmung der CAPG Protein-Ebene in Maus Gewebe einschließlich der Nieren, Milz und Prostata zu erreichen. CAPG Ebenen erwiesen sich zwischen 200 bis 360 Pg/g in Maus Niere Geweben, 460 bis 650 Pg/g in Maus Milz und 330 bis 390 Pg/g in Maus Prostata Gewebe.
Im Vergleich zu ELISA, erfordert QDB Analyse minimale Anstrengungen in einem normalen Labor entwickelt werden. Erstens ist die QDB-Platte eine basiert auf eine Nitrocellulose-Membran den Beschichtung Schritt bei ELISA zu beseitigen. Zweitens erfordert QDB Analyse nur eine statt zwei spezifische Antikörper in einem Sandwich ELISA. Drittens ermöglicht die hohe Bindungskapazität der Nitrozellulose-Membran im Vergleich zu der ELISA-Platte-Oberfläche auch die Membran gegen die strengen Waschschritte, die normalerweise in der Immunoblot Analyse verwendet, um den Hintergrund Störungen zu reduzieren. Diese Funktion ist sehr nützlich bei der Analyse von komplizierterer Lysates aus Zellen und Geweben hergestellt. Im Gegensatz dazu wird die Reduzierung des Hintergrunds bei der Analyse der komplizierten Mobilfunk und Gewebe Lysates aufgrund der relativ geringen Bindungskapazität von ELISA-Platten, eine echte Herausforderung in den Entwicklungsprozess.
QDB-Analyse kann problemlos in jedem Labor beim Zugriff auf einen spezifischen Antikörper übernommen werden. Es ist jedoch wichtig zu erwähnen, dass die Spezifität des Antikörpers ein relativer Begriff ist, durch Faktoren wie die Art, die Gewebetypen und Zelltypen begrenzt. Wie in Abbildung 1Agezeigt, CAPG Antikörper ist spezifisch, bei der Analyse der lysate aus Mausniere, Milz und Prostata, und noch wird unspezifisch bei der Analyse der Maus Leber. In der Tat fanden wir routinemäßig einen Antikörper spezifisch für einen Gewebetyp, aber nicht immer konkrete zu anderen Gewebetyp von derselben Art sein. So ist die vorherige western-Blot Analyse notwendig, um die Spezifität der QDB Analyse zu gewährleisten. In der Tat kann die relative Spezifität des Antikörpers die falsche Ergebnisse, die oft im Zusammenhang mit ELISA Analyse verursachen wie egal wie viel Mühe die Herstellerfirma kann verbracht haben um die Spezifität des Assays, gewährleisten sie alle möglichen erschöpfen kann nicht Arten von Proben die Benutzer können mit ihren ELISA-Produkten zu analysieren.
Wie bei allen Immunoassays, ist möglicherweise ein Problem mit der QDB-Analyse-Methode die fehlende Konsistenz der Qualität des kommerziellen Antikörpers. Auch wenn die scheinbare Qualität eines Antikörpers aus der gleichen Firma (gleiche Katalog, usw.) wird verwendet, könnte es große Unterschiede von einem Kauf zum anderen aufgrund der Variabilität von Charge zu Charge. Daher, wenn volles Vertrauen in die Qualität der verfügbaren Antikörper erreicht wird, ist neu Charakterisierung des Antikörpers bei jedem Einkauf wichtig.
Zusammenfassend lässt sich sagen stellen wir hier ein detailliertes Protokoll und ein Beispiel, wenn die QDB-Analyse-Methode verwenden, um absolute quantitative Bestimmung eines spezifischen Proteins Ebene der Gewebe zu erreichen. Wir zeigen, dass die QDB-Analyse-Methode ein praktisches Werkzeug für jedermann ist, hoher Durchsatz, quantitative Immunoblot Analyse interessiert ist. Dessen Eignung zur Sicherstellung der unbedingte Wille des Inhalts eines spezifischen Proteins Mobilfunk und Gewebe Ebene auch zeichnen diese Technik aus traditionellen Immunoblot-Techniken. Diese Funktion ermöglicht die Kombination und Vergleich der Ergebnisse aus mehreren Analysen, ein Schritt notwendig, vor allem in größeren Bevölkerungsstudien und die Realisierung von relevanten Assoziationsstudien auf proteinebene in naher Zukunft.

Neben Zeugen biomedizinische Forschung mit der aufregenden Zuführungen in der Genomforschung in den letzten Jahren auch den bedeutenden Fortschritt in der Proteomik-Forschung. Mit zunehmender Anhäufung von biologischen Daten an beiden genomic und Proteomic Ebenen, im Mittelpunkt der biomedizinischen Forschung in der wahrnehmbaren Zukunft geworden mit bioinformatischen Tools, um diese Daten zu analysieren. Folglich, der Erfolg von laborprotokollen Forschung wirft Nachfrage für mehr und bessere Qualität der Daten aus der biologischen und biomedizinischen Forschung, eine Aufgabe kann nur erreicht werden, durch Weiterentwicklung der Technik bei genomischen und Proteomik.
Massenspektrometrie (MS) und Immunoblot Analyse sind derzeit zwei vorherrschenden Techniken der Proteinanalytik. MS hat in den letzten Jahren zur Analyse von Tausenden von einzelnen Proteine gleichzeitig ermöglichen die Proteomic Forschung dominiert. Der Immunoblot-basierten Techniken, einschließlich western-Blot und Dot-Blot, auf der anderen Seite haben auch eine bedeutende Rolle in der Proteinforschung sogar seit seiner Erfindung1,2,3,4gespielt, 5. Enzym verbunden Immunosorbentprobe Assay (ELISA)5,6,7 und umgekehrter Phase Protein Microarray (RPPM)8,9 das Hochdurchsatz-Format der Immunoblot angesehen werden kann Analyse. Aber messen alle diese Immunoassay-Methoden außer ELISA, die relative Expression eines spezifischen Proteins. Die relative Natur dieser Methoden wird ein echtes Problem für Bevölkerungsstudien, wie die Analyse zum gleichen Zeitpunkt getan werden muss, alle Anstrengungen zur Erhöhung der Größe des Pools durch mehrere Analysen zu verhindern. Darüber hinaus sind die Ergebnisse aus diesen Studien abgeleitet nur semi-quantitativen, so komplizieren Bioinformatik Bemühungen in der Datenanalyse. Unterdessen zwar ELISA gut geeignet für hohen Durchsatz absolute Analyse der Proteinproben, scheint diese Technik, Herausforderungen in komplexen Umgebungen wie Zellen oder Gewebe wegen seiner niedrigen Bindungskapazität und multiplexing10entsprechen.
Wir entwickeln ein Immunoblot-Verfahren geeignet für Bevölkerungsstudien mit den wichtigsten Merkmalen, bequem, hoher Durchsatz, quantitative und eignet sich für absolute Bestimmung der Proteingehalt, und nannte diese Technik quantitative Dot-blot Analyse (QDB)11. In dieser Studie wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur QDB-Analyse und die Methode durch die Bestimmung des absoluten Proteingehalts eines spezifischen Proteins CAPG, in drei verschiedenen Maus Gewebe einschließlich der Nieren, Milz und Prostata zu demonstrieren. Wir denken, dass dieses ausführliche Protokoll auch die Machbarkeit und den Komfort dieser Methode veranschaulicht und geben Hinweise auf die möglichen Fallstricke in der Praxis dieser Methode zu vermeiden.

<table><tbody><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>Tecan</td><td>Tecan Infinite 200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>QDB-Platte</td><td>Yantai Zestern Co.Ltd</td><td></td><td>Platten sind auf Anfrage zur Verifizierung entweder per E-Mail oder beim Besuch www.zestern.net erhältlich.</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniReiner Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) (min x bov, ck, gt, gp, sys hms, hrs, hu, ms, rat, shp sr prot)</td><td>jackson</td><td>&nbsp; 711-035-152</td><td></td></tr><tr><td>Verstärktes Chemilumineszenzsubstrat</td><td>Thermo</td><td>32134</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-CAPG&nbsp;</td><td>Sino Biologic Inc</td><td>14213-T52</td><td></td></tr><tr><td>CAPG-Protein</td><td>Sino Biologic Inc</td><td>14213-HNAE</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Tianjin Ruiji Jin Special Chemical Co., Ltd</td><td>10461220</td><td></td></tr><tr><td>Mgcl2</td><td>Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>20120802</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884-500G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>BNN1913</td><td></td></tr><tr><td>Na2P2O7</td><td>Haituo Test</td><td>20160914</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid</td><td>Sigma</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>Z290033</td><td></td></tr><tr><td>Leupepin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A3428</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T6455</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L5750-500G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol Blue</td><td>Sigma</td><td>B-0126</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td></td></tr></tbody></table>

hoher durchsatz, absolute bestimmung des inhalts eines ausgewählten proteins auf gewebe ebenen mit quantitativen dot blot analyse (qdb)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

Fehlt eine bequeme, behindert quantitative, hohen Durchsatz Immunoblot Methode zur absoluten Bestimmung des Inhalts eines spezifischen Proteins Mobilfunk und Gewebe Ebene deutlich den Fortschritt in der Proteomik-Forschung. Ergebnisse von derzeit verfügbaren Immunoblot-Techniken abgeleitet sind auch relativ, Verhinderung jeglicher Bemühungen um unabhängige Studien mit einer umfangreichen Analyse der Proteinproben kombinieren. In der vorliegenden Studie zeigen wir den Prozess der quantitativen Dot-Blot Analyse (QDB), absolute Quantifizierung in einem hohen Durchsatz-Format zu erreichen. Mit einem im Handel erhältlichen Protein-Standard, sind wir in der Lage, den absoluten Inhalt der Deckelung Aktin Protein, Gelsolin erinnernden (CAPG) in Proteinproben von drei verschiedenen Maus-Gewebe (Niere, Milz und Prostata) zusammen mit einer detaillierten bestimmen Erklärung der experimentellen Details. Wir schlagen die QDB-Analyse als bequeme, quantitative, hohen Durchsatz Immunoblot Methode der absolute Quantifizierung der einzelnen Proteine auf Mobilfunk und Gewebe. Diese Methode wird im wesentlichen Biomarker Validierung und Verifizierung der Weg in den verschiedenen Bereichen der biologischen und biomedizinischen Forschung unterstützen.

Die Bestimmung der absoluten Höhe der jedes Protein, einschließlich des CAPG-Proteins im Maus-Gewebe erfordert einen spezifischen Antikörper und ein gereinigtes Protein als Standard. Des linearen Bereichs der Analysen der standard Protein und die Lysates muss auch vor eine groß angelegte Analyse eingerichtet werden. Des linearen Bereichs des Antikörpers ist stark abhängig von der Antikörper per se, und das entsprechende Verdünnung an einen spezifischen Antikörper müssen von jedem einzelnen Benutzer überprüft werden.
Wir zunächst ermittelt die Spezifität des Antikörpers CAPG in Mausniere, Milz und Prostata Gewebe mit western-Blot Analyse mit der Negativkontrolle (IgG kostenlose BSA) und Positivkontrolle (handelsübliche CAPG Protein) (Abb. 1A). Der Antikörper Anti-CAPG war spezifisch gegen Lysaten aus Maus Milz, Herz, Muskeln und Prostata (ein Band erkannt). Unspezifische Bänder wurden in Lysaten aus Niere und Leber beobachtet. Allerdings waren die unspezifische Bänder in Niere lysate, deutlich schwächer als die spezifischen Band, was darauf hindeutet, dass die Antikörper für Niere gewebeanalysen eignet. Als nächstes des linearen Bereichs des Proteins standard und die Höhe der Lysates für Analysen wurden durch zwei nebeneinander Dosis-Kurven ermittelt. Ein handelsübliches CAPG Protein wurde seriell verdünnt, wie in Tabelle 1 bezogen auf unsere Erfahrungen und die Gewebe-Lysaten der Mausniere, Milz und Prostata wurden auch verdünnt, bezogen auf die Menge der Gesamt-Protein in der Lysates bestimmt durch ein BCA Gesamtprotein Entschlossenheit Kit. Zwei Dosis Studien wurden nebeneinander durchgeführt und in Abbildung 1Bzusammen gezeichnet. Die entsprechende Menge an Lysates Mausniere, Milz und Prostatakrebs wurden basierend auf den QDB Messsignalen Mikrotestplatte Leser in willkürliche Einheit gewählt. Die ursprüngliche Lesart für dieses Experiment ist in Tabelle 3dargestellt.
In den letzten Schritt, die seriell verdünnten CAPG Protein Standard und Lysaten aus Mausniere wurden Milz und Prostata auf die QDB-Platte geladen. In diesem Fall haben wir Last 0,3 µg/Probe für Lysates aus Mausniere und Milz und 1 µg/Probe für Lysates aus Maus Prostata Analyse, wie auf diesen Ebenen die QDB-Lesung am mindestens 20-fache über dem Hintergrund während gut innerhalb des linearen Bereichs der Analyse basierend auf der Dosis-Kurve die Lysates und das Protein standard. Die Platte wurde des beschriebenen QDB-Protokolls unterzogen, bevor die Platte direkt vom Leser Mikrotestplatte quantifiziert wurde. Mit der seriell verdünnt gereinigtes CAPG Protein, konnten wir aufbauen einer Dosis-Wirkungs-Kurve, die Gleichung und R2 durch einfache Regressionsanalyse mit verfügbaren Software (z. B. Microsoft Office excel). Die QDB Signale von Lysaten von Maus Nieren, Milz und Prostata wurden auf die absolute Menge des Proteins CAPG in diese Lysates unter Verwendung der etablierten Gleichung umgestellt, und die Ergebnisse wurden durch die Gesamt-Protein-Menge, in diesem Fall 0,3 µg für Lysates aus korrigiert Maus-Milz und Nieren und 1 µg für Lysates aus Maus Prostata für die letztendliche Konzentration des Proteins CAPG in diesen Geweben als Pg/µg. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1C mit die ursprüngliche Lesart angezeigt dargestellt Tabelle 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56885/56885fig1.jpg"> Abbildung 1 . Repräsentatives Ergebnis einer QDB-Analyse zur Bestimmung der absoluten CAPG Ebenen in drei Maus Geweben (Niere, Milz und Prostata). A. Untersuchung der Spezifität der Kaninchen Anti-CAPG Antikörper mit Maus Gewebe Lysates vorbereitet aus Milz, Herz, Muskel, Niere, Leber und Prostata mit westlichen blot Analyse mit der Negativkontrolle (IgG kostenlose BSA) und Positivkontrolle (kommerziell verfügbaren CAPG Protein). B. Definition der linearen Bereich QDB Analysen der Kaninchen Anti-CAPG Antikörper mit Lysates vorbereitet von Prostata, Niere, Milz und mit gereinigt rekombinante CAPG Protein standard. Die Ergebnisse waren durchschnittlich Triplicates. C. Absolute Bestimmung der CAPG in Lysaten aus Maus Nieren, Milz und Prostata vorbereitet. Jeder Balken repräsentiert ein Gewebe aus einer einzelnen Maus. Die Ergebnisse wurden im Durchschnitt von dreifacher Ausfertigung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/56885/56885fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/56885/56885table3.jpg"> Tabelle 3: Ergeben Sie sich aus Mikrotestplatte Leser der Dosis Studien mit beiden seriell verdünnt, gepoolte Lysates aus Maus Milz, Nieren und Prostata und gereinigtes rekombinante CAPG Protein.
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/56885/56885table4.jpg">
Tabelle 4: Ergebnis von Mikrotestplatte Leser der QDB-Analyse von der absoluten Höhe der CAPG in Maus Nieren (8), Milz (4) und Prostata (5) mit Hilfe eines rekombinanten Proteins CAPG serienmäßig.

Hier zeigen wir einen detaillierte Prozess der quantitativen Dot-Blot Analyse (QDB) durch die Bestimmung des absoluten Inhalts eines gezielten Proteins Deckelung Aktin Protein, Gelsolin erinnernden (CAPG), in drei verschiedenen Maus Geweben. Wir zeigen ein hoher Durchsatz, bequem, quantitative Immunoblot-Technik für die Validierung der Biomarker auf zelluläre und Gewebe.

Hoher Durchsatz, Absolute Bestimmung des Inhalts eines ausgewählten Proteins auf Gewebe Ebenen mit quantitativen Dot Blot Analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Diese Methode kann als ELISA auf Gewebeebene bezeichnet werden, um sich von der traditionellen relativen semiquantitativen Quantifizierung des Proteingehalts auf Zell- und Gewebeebene zu distanzieren, die derzeit im Forschungslabor und im Bereich der klinischen Diagnostik üblich ist. Die Hauptvorteile dieser Technik lassen sich in drei Worten beschreiben: hoher Durchsatz, quantitativ und absolut. Wenn wir ein weiteres Wort hinzufügen würden, wäre es einfach.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich bis in den Bereich der Proteomik, während die Verifizierung der Biomarker im Hochdurchsatzformat erreicht werden kann. Diese Methode hat breite Anwendungen in der Forschung und im klinischen Bereich. Die Quantifizierung der Proteinmenge auf zellulärer und Gewebeebene ist derzeit noch primitiv.Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, keine Probleme haben, diese Technik zu erlernen, und sie ist recht einfach und erfordert minimale Laborkenntnisse, um sie durchzuführen. Wir freuen uns, die Zuverlässigkeit, Einfachheit und Genauigkeit der Technik am Tiermodell zu demonstrieren. Die Proben können mit jeder traditionellen Methode der Probenvorbereitung unter Verwendung von Lysepuffern, die üblicherweise im Forschungslabor verwendet werden, mit oder ohne Reinigungsmittel wie MP40 oder Triton X.In unserem Fall verwenden wir Triton X Lysepuffer.Geben Sie eine Scheibe Gewebe von fünf bis 100 Milligramm in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie anschließend 200 Mikroliter Lysepuffer hinzu, der mit Protease- und Phosphataseinhibitoren ergänzt ist. Anschließend homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Homogenisator eine Minute lang auf Eis.Zentrifugieren Sie die Probe dann 10 Minuten lang bei 8.000 g bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand in neue Röhrchen und entnehmen Sie einen Mikroliter zur Messung der Gesamtproteinmenge im Proteinlysat mit einem Proteinbestimmungskit, z. B. einem BCA-Assay. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und messen Sie dann die Absorption bei 562 Nanometern auf einem Mikroplatten-Reader.In diesem Schritt wird unter Verwendung eines rekombinanten Proteins mit bekannter Konzentration als Standard das Protein auf eine Konzentration von 12.000 Pikogramm pro Mikroliter als Stammlösung verdünnt. In der Zwischenzeit verdünnen Sie die vorbereitete Probe auf vier Mikrogramm pro Mikroliter. Um zuverlässigere Ergebnisse zu erzielen, empfehlen wir, eine Mischung von Probenlysaten zu verwenden, um Unterschiede zwischen den einzelnen Proben zu vermeiden.Verdünnen Sie sowohl das Standardprotein als auch die vorbereiteten Proben für eine typische Dosisstudie seriell. BSA wurde ergänzt, um sicherzustellen, dass für jede Probe ungefähr die gleichen Mengen des Proteins geladen wurden. Mischen Sie danach 10 Mikroliter des seriell verdünnten Standardproteins oder der Probenlysate mit 10 Mikrolitern 2X-Ladepuffer.Dann erhitzest du die Mischung fünf Minuten lang bei 85 Grad Celsius. Platzieren Sie bei diesem Verfahren eine leere Pipettenspitzenbox unter der QDB-Platte, um zu vermeiden, dass die Unterseite der Platte die Tischoberfläche berührt. Laden Sie bis zu zwei Mikroliter der Probe in die Membranmitte am Boden einer einzelnen Einheit der QDB-Platte.Lassen Sie die Unterseite der QDB-Platte während des Ladevorgangs niemals eine Oberfläche berühren und laden Sie nicht zu viel für einzelne Vertiefungen. Unserer Erfahrung nach nicht mehr als vier Mikroliter pro Vertiefung. Lassen Sie anschließend die geladene QDB-Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder lassen Sie die geladene Platte 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem gut belüfteten Raum.Um die Platte zu blockieren, tauchen Sie die QDB-Platte in den Transferpuffer und schütteln Sie sie vorsichtig 10 Sekunden lang. Spülen Sie danach die QDB-Platte dreimal vorsichtig mit TBST ab und waschen Sie die Platte dann fünf Minuten lang in TBST unter ständigem Schütteln. Blockieren Sie anschließend die QDB-Platte mit Blockierpuffer für eine Stunde unter ständigem Schütteln.Verdünnen Sie nun den Primärantikörper im Blockierungspuffer in einer gewählten Konzentration und geben Sie 100 Mikroliter davon in jede einzelne Vertiefung einer gewöhnlichen 96-Well-Platte. Setzen Sie die QDB-Platte in die 96-Well-Platte ein und inkubieren Sie die kombinierten Platten entweder zwei Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius unter ständigem Schütteln. Spülen Sie die Platte danach dreimal vorsichtig mit TBST ab, bevor Sie sie jeweils dreimal fünf Minuten lang unter ständigem Schütteln mit TBST waschen.Als nächstes verdünnen Sie den Sekundärantikörper in dem Blockierungspuffer in der gewählten Konzentration und aliquotieren Sie 100 Mikroliter in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie dann die QDB-Platte in der beladenen 96-Well-Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln. Spülen Sie die QDB-Platte dreimal vorsichtig mit TBST ab und waschen Sie die Platte dann dreimal fünf Minuten mit TBST unter ständigem Schütteln.Bereiten Sie für die Quantifizierung das ECL-Substrat vor und aliquotieren Sie es in eine 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern pro Well. Setzen Sie dann die QDB-Platte zwei Minuten lang unter ständigem Schütteln in die 96-Well-Platte ein. Nehmen Sie danach die QDB-Platte von der 96-Well-Platte und schütteln Sie sie kurz, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.Legen Sie anschließend die Platte auf eine weiße Mikrotiterplatte. Schalten Sie als Nächstes den Mikroplatten-Reader ein und wählen Sie die Platte mit Abdeckung auf der Benutzeroberfläche aus, bevor Sie die kombinierten Platten zur Quantifizierung in den Mikroplatten-Reader legen. Achten Sie darauf, dass Sie die Platte mit Abdeckung wählen, um Fehler zu vermeiden.Diese Abbildung zeigt die Spezifität von Kaninchen-Anti-CAPG-Antikörpern unter Verwendung von Mausgewebelysaten, die aus Milz, Herz, Muskeln, Niere, Leber und Prostata mit Western-Blot-Analyse hergestellt wurden. Der lineare Bereich der QDB-Analyse von Kaninchen-Anti-CAPG-Antikörpern unter Verwendung von Lysaten, die aus Prostata, Niere und Milz hergestellt wurden, und unter Verwendung eines gereinigten rekombinanten CAPG-Proteinstandards wurde definiert. Die Ergebnisse waren durchschnittlich dreifach.Und hier ist die absolute Bestimmung der CAPG-Spiegel in Lysaten gezeigt, die aus Nieren, Milz und Prostata von Mäusen hergestellt wurden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier bis 24 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass für das gesamte Verfahren ein vorher festgelegter spezifischer Antikörper verwendet wird.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die biostatistische Analyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, die nur durch eine absolute Messung der individuellen Proteingehalte auf Zell- oder Gewebeebene erreicht werden können. Seit ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Proteomik-Forschung geebnet, um die mögliche Beziehung von Protein-Biomarkern mit verschiedenen Krankheiten auf Bevölkerungsebene zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine QDB-Analyse im Hochdurchsatzformat durchführen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem oder tierischem Gewebe äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Dieses Video zeigt eine quantitative Dot-Blot- oder QDB-Technik zur absoluten Quantifizierung von Proteinen, die in einer Gewebeprobe von Interesse sind. Die Proteine in der Probe werden auf der Nitrozellulosemembran in den Vertiefungen einer QDB-Platte immobilisiert. Unter Verwendung von Zielprotein-spezifischen Antikörpern, die mit einem Peroxidase-Enzym markiert sind, wird ein chemilumineszierendes Substrat oxidiert, um Licht zu erzeugen, das gemessen wird, um die Proteinkonzentration der...

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Hoher Durchsatz, Absolute Bestimmung des Inhalts eines ausgewählten Proteins auf Gewebe Ebenen mit quantitativen Dot Blot Analyse (QDB) (Video) | JoVE Journal

Hoher Durchsatz, Absolute Bestimmung des Inhalts eines ausgewählten Proteins auf Gewebe Ebenen mit quantitativen Dot Blot Analyse (QDB)

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