Hoher Durchsatz, Absolute Bestimmung des Inhalts eines ausgewählten Proteins auf Gewebe Ebenen mit quantitativen Dot Blot Analyse (QDB)

Diese Methode kann als ELISA auf Gewebeebene bezeichnet werden, um sich von der traditionellen relativen semiquantitativen Quantifizierung des Proteingehalts auf Zell- und Gewebeebene zu distanzieren, die derzeit im Forschungslabor und im Bereich der klinischen Diagnostik üblich ist. Die Hauptvorteile dieser Technik lassen sich in drei Worten beschreiben: hoher Durchsatz, quantitativ und absolut. Wenn wir ein weiteres Wort hinzufügen würden, wäre es einfach.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich bis in den Bereich der Proteomik, während die Verifizierung der Biomarker im Hochdurchsatzformat erreicht werden kann. Diese Methode hat breite Anwendungen in der Forschung und im klinischen Bereich. Die Quantifizierung der Proteinmenge auf zellulärer und Gewebeebene ist derzeit noch primitiv.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, keine Probleme haben, diese Technik zu erlernen, und sie ist recht einfach und erfordert minimale Laborkenntnisse, um sie durchzuführen. Wir freuen uns, die Zuverlässigkeit, Einfachheit und Genauigkeit der Technik am Tiermodell zu demonstrieren. Die Proben können mit jeder traditionellen Methode der Probenvorbereitung unter Verwendung von Lysepuffern, die üblicherweise im Forschungslabor verwendet werden, mit oder ohne Reinigungsmittel wie MP40 oder Triton X.In unserem Fall verwenden wir Triton X Lysepuffer.

Geben Sie eine Scheibe Gewebe von fünf bis 100 Milligramm in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie anschließend 200 Mikroliter Lysepuffer hinzu, der mit Protease- und Phosphataseinhibitoren ergänzt ist. Anschließend homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Homogenisator eine Minute lang auf Eis.

Zentrifugieren Sie die Probe dann 10 Minuten lang bei 8.000 g bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand in neue Röhrchen und entnehmen Sie einen Mikroliter zur Messung der Gesamtproteinmenge im Proteinlysat mit einem Proteinbestimmungskit, z. B. einem BCA-Assay. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und messen Sie dann die Absorption bei 562 Nanometern auf einem Mikroplatten-Reader.

In diesem Schritt wird unter Verwendung eines rekombinanten Proteins mit bekannter Konzentration als Standard das Protein auf eine Konzentration von 12.000 Pikogramm pro Mikroliter als Stammlösung verdünnt. In der Zwischenzeit verdünnen Sie die vorbereitete Probe auf vier Mikrogramm pro Mikroliter. Um zuverlässigere Ergebnisse zu erzielen, empfehlen wir, eine Mischung von Probenlysaten zu verwenden, um Unterschiede zwischen den einzelnen Proben zu vermeiden.

Verdünnen Sie sowohl das Standardprotein als auch die vorbereiteten Proben für eine typische Dosisstudie seriell. BSA wurde ergänzt, um sicherzustellen, dass für jede Probe ungefähr die gleichen Mengen des Proteins geladen wurden. Mischen Sie danach 10 Mikroliter des seriell verdünnten Standardproteins oder der Probenlysate mit 10 Mikrolitern 2X-Ladepuffer

Dann erhitzest du die Mischung fünf Minuten lang bei 85 Grad Celsius. Platzieren Sie bei diesem Verfahren eine leere Pipettenspitzenbox unter der QDB-Platte, um zu vermeiden, dass die Unterseite der Platte die Tischoberfläche berührt. Laden Sie bis zu zwei Mikroliter der Probe in die Membranmitte am Boden einer einzelnen Einheit der QDB-Platte.

Lassen Sie die Unterseite der QDB-Platte während des Ladevorgangs niemals eine Oberfläche berühren und laden Sie nicht zu viel für einzelne Vertiefungen. Unserer Erfahrung nach nicht mehr als vier Mikroliter pro Vertiefung. Lassen Sie anschließend die geladene QDB-Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder lassen Sie die geladene Platte 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem gut belüfteten Raum.

Um die Platte zu blockieren, tauchen Sie die QDB-Platte in den Transferpuffer und schütteln Sie sie vorsichtig 10 Sekunden lang. Spülen Sie danach die QDB-Platte dreimal vorsichtig mit TBST ab und waschen Sie die Platte dann fünf Minuten lang in TBST unter ständigem Schütteln. Blockieren Sie anschließend die QDB-Platte mit Blockierpuffer für eine Stunde unter ständigem Schütteln.

Verdünnen Sie nun den Primärantikörper im Blockierungspuffer in einer gewählten Konzentration und geben Sie 100 Mikroliter davon in jede einzelne Vertiefung einer gewöhnlichen 96-Well-Platte. Setzen Sie die QDB-Platte in die 96-Well-Platte ein und inkubieren Sie die kombinierten Platten entweder zwei Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius unter ständigem Schütteln. Spülen Sie die Platte danach dreimal vorsichtig mit TBST ab, bevor Sie sie jeweils dreimal fünf Minuten lang unter ständigem Schütteln mit TBST waschen.

Als nächstes verdünnen Sie den Sekundärantikörper in dem Blockierungspuffer in der gewählten Konzentration und aliquotieren Sie 100 Mikroliter in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie dann die QDB-Platte in der beladenen 96-Well-Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln. Spülen Sie die QDB-Platte dreimal vorsichtig mit TBST ab und waschen Sie die Platte dann dreimal fünf Minuten mit TBST unter ständigem Schütteln.

Bereiten Sie für die Quantifizierung das ECL-Substrat vor und aliquotieren Sie es in eine 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern pro Well. Setzen Sie dann die QDB-Platte zwei Minuten lang unter ständigem Schütteln in die 96-Well-Platte ein. Nehmen Sie danach die QDB-Platte von der 96-Well-Platte und schütteln Sie sie kurz, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.

Legen Sie anschließend die Platte auf eine weiße Mikrotiterplatte. Schalten Sie als Nächstes den Mikroplatten-Reader ein und wählen Sie die Platte mit Abdeckung auf der Benutzeroberfläche aus, bevor Sie die kombinierten Platten zur Quantifizierung in den Mikroplatten-Reader legen. Achten Sie darauf, dass Sie die Platte mit Abdeckung wählen, um Fehler zu vermeiden.

Diese Abbildung zeigt die Spezifität von Kaninchen-Anti-CAPG-Antikörpern unter Verwendung von Mausgewebelysaten, die aus Milz, Herz, Muskeln, Niere, Leber und Prostata mit Western-Blot-Analyse hergestellt wurden. Der lineare Bereich der QDB-Analyse von Kaninchen-Anti-CAPG-Antikörpern unter Verwendung von Lysaten, die aus Prostata, Niere und Milz hergestellt wurden, und unter Verwendung eines gereinigten rekombinanten CAPG-Proteinstandards wurde definiert. Die Ergebnisse waren durchschnittlich dreifach.

Und hier ist die absolute Bestimmung der CAPG-Spiegel in Lysaten gezeigt, die aus Nieren, Milz und Prostata von Mäusen hergestellt wurden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier bis 24 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass für das gesamte Verfahren ein vorher festgelegter spezifischer Antikörper verwendet wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die biostatistische Analyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, die nur durch eine absolute Messung der individuellen Proteingehalte auf Zell- oder Gewebeebene erreicht werden können. Seit ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Proteomik-Forschung geebnet, um die mögliche Beziehung von Protein-Biomarkern mit verschiedenen Krankheiten auf Bevölkerungsebene zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine QDB-Analyse im Hochdurchsatzformat durchführen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem oder tierischem Gewebe äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten.