Multiplexed Fluorometric Immunoassay Testing Methodology und Fehlerbehebung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist der Nachweis von Antikörpern gegen zufällige Infektionserreger bei Labortieren. Dies wird durch die Inkubation von Testserum mit antigenbeschichteten Mikrosphären erreicht. Als nächstes wird das Serum mit einem biotinylierten, markierten Spezies-spezifischen Anti-Immunglobulin inkubiert, das beliebige Antigen-Antikörper-Immunkomplexe nachweist.

Dann wird eine mit Streptavidin markierte FICO-Eryn-Fluor-Kraftlösung hinzugefügt, um biotinylierte Immunglobulinergebnisse nachzuweisen, die einen positiven oder negativen Antikörperstatus für gängige Wirkstoffe in Labornagetieren zeigen, basierend auf Multiplex-Fluoreszenz, Immunoassay-Netto-Score und fluoreszierenden Probenwerten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der bestehenden Methode wie Eliza besteht darin, dass MFIA ein Multiplex-Assay ist. Auf diese Weise kann ein Forscher bis zu hundert verschiedene Assays in einem einzigen Test screenen.

Nun, diese Technik verringert die Anzahl der Serumregionen und Einwegartikel, die in den bestehenden Methoden verwendet werden, und erhöht gleichzeitig die Menge an Informationen, die aus einem einzigen Test generiert werden. Nun, wir hatten die Idee, diese Methode zu verwenden, als wir eine große Anzahl von Serenproben auf mehrere Wirkstoffe testeten und sowohl den Arbeitsaufwand als auch die Testzeit reduzieren wollten. Donna Cohen, eine leitende Technologin aus unserem Labor, wird das Verfahren vorführen. Halten Sie zunächst zwei Puffer bereit, die für das Multiplex-, Fluoreszenz-, Immunoassay- oder MFIA-Verfahren erforderlich sind.

Das erste ist ein primäres Verdünnungsmittel, das von Charles River erhältlich ist und proprietäre Blockierungsmittel enthält, um unspezifische Wechselwirkungen für den Assay-Waschpuffer zu verringern. Bereiten Sie eine PBS-Lösung mit 1%BSA pH 7,4 vor, um Partikel zu entfernen. Filtrieren Sie den Puffer durch eine 0,2-Mikron-Flaschenaufsatzeinheit in steril etikettierte Behälter mit Assay-Waschpuffer.

Bereiten Sie zwei x Konzentrationen von biotinylierten Antispezies, IGG oder BAG und Streptokokken AVID und FICO erything oder SPE vor, die zur Markierung der Antigen-Antikörperkomplexe verwendet werden, die während des Inkubationsschritts des Testserums gebildet werden, um Proben der folgenden Materialien und Einwegartikel vorzubereiten: zusammengesetzte Mehr- und Einkanal-Mikropipetten und -spitzen sowie 96 Well-Mikrotiterplatten mit geringer Proteinbindung für die Proteinverdünnung. Nach der Entnahme von Blutproben und der Isolierung des Serums wird das Serum kurz vortext, bevor die Proben in einer 96-Well-Mikrotiterplatte in einem primären Verdünnungsmittel verdünnt werden, um eine ordnungsgemäße und gleichmäßige Evakuierung des Wells vor der Nassung zu gewährleisten. Jede Vertiefung der 96-Well-Testplatte mit Assay-Waschpuffer aspiriert die Lösung langsam während des gesamten Assays.

Die Aspiration sollte fünf bis 10 Sekunden dauern, um eine Aggregation von Kügelchen und das Verdichten von Kügelchen in der Filtermembran zu verhindern, was beides die Lesezeiten am Ende des Assays verlangsamen kann. Vergewissern Sie sich, dass der Flüssigkeitsabfluss gestoppt wurde, indem Sie die Unterseite der Testplatte mit Küchenpapier abtupfen. Es ist wichtig, die Testplatte nach jedem Waschschritt abzutupfen, um ein Austreten der Wells während der Inkubation zu verhindern.

Um die Perlen vorzubereiten, beginnen Sie mit dem Vortexen der schaftgekoppelten Perlensuspension. Dann beschallen Sie sie kurz in einem Bad. Es ist wichtig, die Perlen richtig zu resuspendieren, um aggregierte Perlencluster zu vermeiden, die zu längeren Lesezeiten führen können.

Geben Sie anschließend die 20-fache Stoffsuspension in eine zweifache Arbeitsraupenlösung in Primärverdünnungsmittel. Geben Sie dann 50 Mikroliter der beiden x Bead-Suspension in jede Assay-Vertiefung der vorbenetzten Testplatte. Pipettieren Sie 50 Mikroliter von je zwei x Test- und Kontrollserum auf die Testplatte auf der Grundlage einer vordefinierten Plattenkarte.

Befestigen Sie den Deckel auf der Platte. Decken Sie es mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie die Testplatte 60 Minuten lang auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur, um das Verdampfen von Lösungen zu vermeiden, die den Erfolg des Assays verhindern können. Halten Sie die Testplatte während aller Inkubationsschritte mit dem Plattendeckel bedeckt.

Darüber hinaus sollte die Schüttelgeschwindigkeit mehr als 400, aber weniger als 700 U/min betragen, damit die Kügelchen in Suspension bleiben, um den Serumantikörpern den Zugang zu allen Oberflächen der gekoppelten Antigene zu ermöglichen. Nachdem Sie die Platte in aufeinanderfolgenden Inkubationen der Kügelchen mit BAG und SPE gewaschen haben, waschen Sie die Proben erneut. Dann resuspendieren Sie die Kügelchen, indem Sie 125 Mikroliter Assay hinzufügen, waschen, puffern und zwei Minuten lang schütteln, um die Platte abzulesen.

Legen Sie es innerhalb von 10 Minuten nach der Wiederbelebung der Kügelchen in den Assay-Reader, wobei die Kügelchen nacheinander einen Detektor durchlaufen, wo sie zwei Lasern ausgesetzt werden. Ein Laser regt die internen Farbstoffe an, die den Farbsatz der Kügelchen identifizieren, und der andere regt den FICO-Reporterfarbstoff an. Die Intensität der FICO-Fluoreszenz für eine vorgegebene Anzahl von Kügelchen wird angegeben, wenn das FM FI die erste Vertiefung liest, um zu überprüfen, ob die ausgewählte Bead-Platte mit dem Bead-Profil in den Testwells übereinstimmt.

Wenn auf der Protokollanzeige Perlen außerhalb des dafür vorgesehenen Raupenbereichs liegen, wurde eine falsche Profilauswahl getroffen. Beads, die ordnungsgemäß resuspendiert wurden, füllen die angegebenen Bereiche aus, wie in der Assay-Reader-Software angegeben. Wenn die Kügelchen aggregiert sind, füllen sie ihre Bereiche nur langsam aus.

Sie können die Testplatte aus dem Lesegerät entfernen und die Vertiefungen manuell wieder aufhängen, um die Kügelchen zu trennen. Nehmen Sie die Testplatte aus dem Lesegerät und verwenden Sie eine Mehrkanalpipettenpipette, die jeweils drei- bis viermal verdreifacht wird. Geben Sie dann die Testplatte wieder in das Lesegerät zurück und fahren Sie mit der Untersuchung der Ergebnisse fort.

Melden Sie Fehler, wie z. B. unzureichende Bead-Zählungen oder sinkende IgG-Anti-IgG-Bead-Scores, und wiederholen Sie den Assay für diese Proben. Nachdem Sie die Daten nach Excel exportiert und den Netto-MFI berechnet haben, bestimmen Sie, ob eine der Testspiel-Assay-Kontrollen das Immunserum mit hohem Bereich ausschließt. Nicht bestandene Kontrollen sind nicht akzeptabel und der Test muss wiederholt werden.

Diese Tabelle enthält Daten für Testserum und Assay-Kontrollen von einer typischen Assay-Platte. Wurden alle IgG-Kontrollen bestanden. Die Testergebnisse für dieses Spiel deuten darauf hin, dass zahlreiche gewebereaktive und IgG-Kontrollproben versagten, wie in den orangefarbenen Vertiefungen zu sehen war.

A1C eins und F1 weisen auf ein reaktives TC-Gewebeversagen hin, wobei der TC-Score in Klammern dargestellt wird, während Wells B eins und E eins die beiden Arten von IgG-Fehlern bei der internen Kontrolle veranschaulichen: unzureichende Testantikörper oder Testreagenzien, BAG bzw. SPE. Die Ergebnisse der Testplatte werden nur interpretiert, wenn die Systemeignungskontrolle und die Serumkontrolle die hier gezeigten Akzeptanzkriterien erfüllen. Mikrosphären, die mit speziesspezifischem Anti-Test-Serum-Immunglobulin beschichtet sind, können aufgrund der Zugabe einer unzureichend zu hohen Probe, einer Probenverdünnung, falscher Spezies oder des Testens von Serums von einem immundefizienten Wirt fehlerhafte Ergebnisse aufweisen.

Wenn die Kontrollergebnisse des Testspiels zufriedenstellend sind, werden die einzelnen Testergebnisse wie folgt klassifiziert. Nach diesem Verfahren sollten wir zusätzliche Methoden wie Eliza, IFA und/oder Western Blot verwenden, um die anfänglichen unerwarteten oder positiven Befunde zu bestätigen. Es ist wichtig, diese Ergebnisse zu überprüfen, bevor Sie eine Entscheidung über das Tiermanagement treffen.

Dies kann durch die Anwendung unterschiedlicher Methoden an derselben Probe oder mit zusätzlichen Proben aus derselben Kolonie erfolgen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den metrischen Multiplex-Fluoro-Immunoassay durchführen und die in Ihrer Einrichtung erzielten Ergebnisse interpretieren. Auf diese Weise können Sie den Arbeitsaufwand reduzieren und gleichzeitig mehr Informationen aus jeder Testprobenbohrung sammeln.