Name: Multiplexed Fluorometric Immunoassay Testing Methodology und Fehlerbehebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Erfahren Sie die multiplexe fluorometrische Immunoassay-Methode zur gleichzeitigen Detektion von Antikörpern gegen Infektionserreger bei Labortieren. Diese Technik reduziert Zeit und Ressourcen im Vergleich zu herkömmlichen ELISA-Tests erheblich.

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Die Forschung hier vorgestellte wurde von Charles River unterstützt.

<ol><li>MFIA Rodent Methods Manual [Internet]. , Charles River. Available from:
		
	 <a target="_blank" href=" http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf"> http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf</a> (2011).</li>
<li>Rodent MFIA Validation Summary Report [Internet]. , Charles River. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf">http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf</a> (2007).</li>
<li>Jacobson, R. H., et al. Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobson%2C+RH+%22Manual+of+Standards+for+Diagnostic+Tests+and+Vaccines%22">Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines</a>. , Office International des Epizooties (OIE). France. 8-15 (1996).</li>
<li>Wright, P. F. International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWright%2C+PF+%22Rev.+sci.+tech.+Off.+int.+Epiz%22">Rev. sci. tech. Off. int. Epiz</a>. 17 (2), Office International des Epizooties (OIE). France. 527-533 (1998).</li>
<li>Pepe, M. S. The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction. , Oxford University Press. Oxford, New York. (2003).</li>
<li>Barr, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+interpretation+of+diagnostic+tests+for+feline+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Comparison and interpretation of diagnostic tests for feline immunodeficiency virus infection.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 199, 1377-1381 (1991).</li>
</ol>

Alle Autoren arbeiten für Charles River RADS, ein führender Anbieter von Tier-Serologie Test-Dienstleistungen und Reagenzien.

Die MFIA Testprozess ist hoch effizient und erfordert weniger Ausrüstung und kleinere Probe und Reagenz Volumen als herkömmliche Singleplex Tests. Die Funktionalität des Multiplex-System gibt dem Benutzer die Flexibilität, um gleichzeitig zu screenen für mehrere Stämme oder Serotypen von gemeinsamen Agenten in Labornagetieren (dh Coronavirus, Parvoviren etc.). Dies ermöglicht es uns, maßgeschneiderte Perlen Panels basieren auf den Bereich von Interesse (zB spezifische Virus-Familie) entwerfen und ist anpassungsfähig an Screening andere Arten von Biomolekülen einschließlich Zytokine und andere Biomarker. Darüber hinaus ermöglicht es uns, mehrere interne Kontrollsystem Assays integrieren, um Probe und System Eignung zu überprüfen und dadurch sicherzustellen, die Genauigkeit der Ergebnisse. Dazu gehören Gewebe-Steuerung und IgG-Anti-Testserum Arten Immunglobulin (αIg) beschichtete Kugel-Sets zu Probe Eignung zu bewerten. Eine Gewebemarkiervorrichtung Steuerwulst erkennt unspezifische Bindung von Serum-Immunglobulin und das αIg Wulst Steuerung bestätigtdass Serum wurde hinzugefügt und enthält eine ausreichende Immunglobulin-Konzentration. Eine weitere Kontrolle Wulst mit Serum Immunglobulin Spezies beschichtet wird, zeigt, dass die markierten Reagentien und Assay Reader ordnungsgemäß funktionieren. Andere im Handel erhältliche Multiplex-Format serologischen Assays (zB Microarrays, ImmunoComb) nicht bieten diese gleiche Ergebnis Bestätigung. Die Fähigkeit zu verengen die mögliche Quelle der Assay Versagen vor Nachprüfung helfen kann ein Ermittler auf Zeit und Material zu sparen. Kritische Aspekte des MFIA sollte vor der Wiederholung einer fehlgeschlagenen Probe bestätigt werden. Da der Test bei Raumtemperatur durchgeführt wird, sollte verifiziert, dass die Temperatur etwa 27 Labor ist ° C ± 2 ° C, höhere Temperaturen führen kann als erwartet Scores für Kontrollen und Proben zu senken. Waschen ist vielleicht der wichtigste Schritt im Assay. Die Versicherung, dass die Testplatte richtig gewaschen, abgetupft und resuspendiert beseitigen könnendie überwiegende Mehrzahl der Abtastfehler aufgrund einer geringen Anzahl Wulst (aufgrund aggregierten Kügelchen) oder unzureichende Reagenzzugabe (Passwort durch Dochtwirkung aus der Testplatte Filterboden). Wir routinemäßig zählen 25 Perlen pro Assay (Agent) und haben keinen statistischen Unterschied in den Ergebnissen durch Zählen höhere Anzahl von Perlen, die auch zu einer längeren Lesezeit für die Platte führen. Wir haben umfassende Validierungsstudien MFIA auf mehrere Arten der am häufigsten verwendeten Versuchstiere (Maus, Ratte, Hamster, Meerschweinchen und Kaninchen) durchgeführt, um die diagnostische Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Robustheit durch das Testen einer großen Anzahl von bekannten positiven und negativen Serumproben zu demonstrieren und Vergleich ihrer ELISA, IFA und MFIA Ergebnisse. Die Nachweisgrenzen (dh Standard-Immunserum Titration Endpunkte) von MFIA vergleichbar waren, und in einigen Fällen übertroffen, wie bei entsprechenden ELISA. Diagnostische Spezifität, mit SPF Nager sera gemessen als 99%, die gesamte Korrespondenz between ELISA und MFIA durchgeführt am bekannten positiven und bekannten negativen Seren war größer als 95%. Zusammenfassend erwiesen diese Ergebnisse, dass eine gute Multiplex MFIA Stellvertreter für den ELISA ist Singleplex, und ist geeignet für die beabsichtigte Verwendung, dh in der Routine serologischen Überwachung von Versuchstieren Kolonien.

multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology und fehlerbehebung

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

Um die Qualität von Tiermodellen in der biomedizinischen Forschung verwendet sicherzustellen, haben wir eine Reihe von diagnostischen Tests Strategien und Methoden, um festzustellen, ob Tiere zufällige Infektionserregern (Viren, Mykoplasmen, und anderen anspruchsvollen Mikroorganismen) ausgesetzt wurden entwickelt. Infektionen von immunkompetenten Tieren im Allgemeinen vorübergehend, jedoch Serum-Antikörperantworten gegen Infektionen oft innerhalb von Tagen bis Wochen festgestellt werden und bleiben über die gesamte Lebensdauer des Wirts. Serologie ist die primäre diagnostische Methode, mit der Versuchstiere werden überwacht. Historisch die indirekter Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ist die wichtigste Methode zur serologischen Überwachung Screening. Der ELISA ist als Singleplex durchgeführt, wobei ein mikrobielles Antigen-Antikörper-Reaktion pro Vertiefung gemessen. Im Vergleich der MFIA als gemultiplexte Assay durchgeführt. Da die Mikrokügelchen in 100 verschiedene Farbskalen kommen, können bis zu 100 verschiedene Assays simultan durchgeführt werdeneously in einem Mikrotiterplatten. Diese Innovation reduziert die Menge an Serum, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien für Routinetests erforderlich, während die Erhöhung der Menge von Informationen aus einem einzigen Test gut erhalten. Darüber hinaus sind wir in der Lage, mehrere interne Kontrollsystem Perlen integrieren, um Probe und System Eignung zu überprüfen und dadurch sicherzustellen, die Genauigkeit der Ergebnisse. Dazu gehören Gewebe-Steuerung und IgG-Anti-Testserum Arten Immunglobulin (αIg) beschichtete Kugel-Sets zu Probe Eignung zu bewerten. Wie in den ELISA und IFA detektiert der Gewebekontrolle unspezifische Bindung von Serum-Immunglobulin. Die αIg Steuerung (Serum-Steuerung) bestätigt, dass das Serum wurde hinzugefügt und enthält eine ausreichende Immunglobulinkonzentration während die IgG-Kontrolle Wulst (System Suitability Kontrolle), mit Serum Arten Immunglobulin beschichtet, zeigt, dass die markierten Reagenzien und Luminex Leser ordnungsgemäß funktionieren.

Mit Luminex Corporation xMAP-Mikrokugel-Technologie haben wir die Multiplex Fluorometric Immunoassay (MFIA) für serologischen Überwachung von verschiedenen Labors Tierarten entwickelt. Die MFIA ist eine Suspension Microarray, wo Antigen, Gewebekontrolle oder Immunglobuline kovalent an farbkodierten Polystyrol-Mikrokügelchen verbunden sind. Die MFIA Prüfverfahren sowie verschiedene Themen zur Fehlerbehebung adressiert ist.

Multiplexed Fluorometric Immunoassay Testing Methodology und Fehlerbehebung

Um die Qualität der in der biomedizinischen Forschung verwendeten Tiermodelle zu gewährleisten, haben wir eine Reihe von diagnostischen Teststrategien und -methoden entwickelt, um zu bestimmen, ob ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Antikörper gegen zufällig vorkommende infektiöse Erreger in Laboratoriumstieren nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem man das Testserum mit antigenbeschichteten Mikrokügelchen inkubiert. Anschließend wird das Serum mit einer biotinylierten, artsspezifischen Anti-Immunglobulin-Markierung inkubiert, die beliebige Antigen-Antikörper-Immunkomplexe erkennt.Anschließend wird eine mit Streptavidin markierte FICO eryn Fluor force-Lösung hinzugefügt, um biotinylierte Immunglobuline nachzuweisen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen den positiven oder negativen Antikörperstatus gegenüber häufigen Erregern bei Laborrodentien, basierend auf multiplexen Fluoreszenz-, Immunoassay-Nettoscore- und fluoreszenten Probenwerten. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu etablierten Verfahren wie ELISA liegt darin, dass es sich bei MFIA um ein Multiplex-Assay handelt. Dies ermöglicht es einem Forscher, bis zu hundert verschiedene Assays in einem einzigen Test durchzuführen.Nun, diese Technik verringert die Menge an verwendeten Serumproben und Einwegartikeln im Vergleich zu bestehenden Methoden und erhöht gleichzeitig die Menge an Informationen, die aus einem einzigen Test gewonnen werden können. Die Idee, diese Methode anzuwenden, kam uns erstmals, als wir eine große Anzahl von Serumproben auf mehrere Erreger testeten und sowohl den Arbeitsaufwand als auch die Testdauer reduzieren wollten. Die Durchführung des Verfahrens wird Donna Cohen demonstrieren, eine leitende Technologin aus unserem Labor. Zunächst bereiten Sie zwei Puffer vor, die für das Multiplex-Fluoreszenz-Immunoassay-Verfahren (MFIA) benötigt werden.Das erste ist ein primärer Verdünnungspuffer, der von Charles River erhältlich ist und proprietäre Blockierstoffe enthält, um unspezifische Wechselwirkungen im Waschpuffer für den Assay zu verringern. Bereiten Sie eine Lösung von PBS mit 1 % BSA, pH 7,4, zu, um Partikel zu entfernen. Filtern Sie den Puffer mithilfe eines 0,2-Mikron-Flaschenaufsatzfilters in sterile, beschriftete Behälter unter Verwendung des Waschpuffers für den Assay. Bereiten Sie zwei x Konzentrationen von biotinylierten Antispezies, IGG oder BAG sowie Strep AVID und FICO Erything oder SPE vor, die zur Markierung der Antigen-Antikörper-Komplexe verwendet werden, die während des Inkubationsschritts mit Testserum gebildet werden, um Proben der folgenden Materialien und Einwegartikel vorzubereiten: mehrkanalige und einkanalige Mikropipetten sowie Spitzen und 96-Loch-Mikrotiterplatten mit geringer Proteinbindung für die Proteindilution. Nach der Sammlung von Blutproben und der Isolierung des Serums vortexen Sie das Serum kurz, bevor Sie die Proben in einem 96-Loch-Mikrotiterplatten im Primärverdünnungspuffer verdünnen, um eine ordnungsgemäße und gleichmäßige Entleerung der Brunnen sicherzustellen. Benetzen Sie jeden Brunnen der 96-Loch-Testplatte vorab mit dem Assay-Waschpuffer und aspirieren Sie die Lösung langsam während des gesamten Assays.Die Aspiration sollte fünf bis zehn Sekunden dauern, um eine Aggregation der Perlen und deren Verdichtung in der Filtermembran zu verhindern, da beides die Messdauer am Ende des Assays verlängern kann. Überprüfen Sie, ob der Flüssigkeitsablauf gestoppt ist, indem Sie die Unterseite der Testplatte mit Papiertüchern abtupfen. Es ist wichtig, die Testplatte nach jedem Waschschritt abzutupfen, um ein Nachfließen aus den Vertiefungen während der Inkubation zu verhindern.Um die Kügelchen vorzubereiten, beginnen Sie damit, die gelagerte gekoppelte Kügelchensuspension zu wirbeln. Anschließend werden sie kurz in einem Bad beschallt. Es ist entscheidend, die Kügelchen ordnungsgemäß wieder in Suspension zu bringen, um aggregierte Kügelchenansammlungen zu vermeiden, die zu längeren Messzeiten führen können.Nächste Stufe: Die 20 x-Stammsuspension in eine 2 x Arbeitsperlsuspension im primären Verdünnungsmittel auffüllen. Anschließend 50 Mikroliter der 2 x Perlsuspension in jedes Testloch der vorbenetzten Testplatte pipettieren. Je 50 Mikroliter der jeweiligen 2 x Test- und Kontrollseren entsprechend einer vordefinierten Plattenkarte auf die Testplatte übertragen.Befestigen Sie den Deckel auf der Platte. Bedecken Sie sie mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie die Testplatte 60 Minuten lang auf einem horizontal schwingenden Schüttler bei Raumtemperatur, um eine Verdunstung der Lösungen zu vermeiden, die den Erfolg des Assays beeinträchtigen könnte. Halten Sie die Testplatte während aller Inkubationsschritte mit dem Plattendekel bedeckt.Außerdem sollte die Schüttelgeschwindigkeit höher als 400, aber niedriger als 700 U/min sein, damit die Perlen in Suspension bleiben und die Serumantikörper Zugang zu allen Oberflächen der gekoppelten Antigene haben. Nach dem Waschen der Platte in sequenziellen Inkubationen der Perlen mit BAG und SPE die Proben erneut waschen. Anschließend die Perlen wieder aufschwemmen, indem 125 µL Assay-Waschpuffer zugegeben werden, und zwei Minuten lang schütteln, um die Platte auszulesen.Platzieren Sie es innerhalb von 10 Minuten nach der Resuspendierung der Beads in den Assay-Reader; die Beads passieren nacheinander einen Detektor, in dem sie zwei Lasern ausgesetzt werden. Ein Laser regt die internen Farbstoffe an, die den Farbsatz der Beads identifizieren, und der andere regt den FICO-Erything-Reporterfarbstoff an. Die Intensität der FICO-Erything-Fluoreszenz für eine vorbestimmte Anzahl von Beads wird als FM-FI-Wert gemeldet. Lesen Sie die erste Vertiefung, um zu überprüfen, dass das ausgewählte Bead-Panel mit dem Bead-Profil in den Testvertiefungen übereinstimmt.Wenn Perlen außerhalb ihres vorgesehenen Perlenbereichs auf der Protokollanzeige erscheinen, wurde eine falsche Profilauswahl getroffen. Richtig resuspendierte Perlen füllen ihre spezifischen Bereiche gemäß der Angabe in der Assay-Lesersoftware aus. Wenn die Perlen aggregiert sind, füllen sie ihre Bereiche nur langsam aus.Sie können die Testplatte aus dem Reader nehmen und die Vertiefungen manuell resuspendieren, um die Beads zu trennen. Entfernen Sie die Testplatte aus dem Reader und pipettieren Sie mit einem Mehrkanalpipettiergerät jede Vertiefung drei bis vier Mal auf und ab. Danach stellen Sie die Testplatte wieder in den Reader und setzen die Ergebnisprüfung fort.Berichten Sie über Fehler wie unzureichende Bead-Zahlen oder abfallende IgG-anti-IgG-Bead-Scores und wiederholen Sie den Assay für diese Proben. Nach dem Export der Daten in Excel und der Berechnung der netto MFI ermitteln Sie, ob eines der Testspiel-Assay-Kontrollen ausgeschlossen werden muss, mit Ausnahme des Immuserums im hohen Bereich. Alle fehlgeschlagenen Kontrollen sind inakzeptabel, und der Assay muss wiederholt werden.Diese Tabelle zeigt Daten für Testserum und Assay-Kontrollen von einer typischen Assay-Platte. Alle IgG-Kontrollen waren erfolgreich. Die Testergebnisse für diese Platte zeigen, dass zahlreiche gewebereaktive Proben und IgG-Kontrollproben fehlgeschlagen sind, wie in den orangefarbenen Vertiefungen zu sehen ist.A1C eins und F1 zeigen einen TC-Gewebereaktivitätsausfall an, wobei die TC-Wertung in Klammern angegeben ist; Wells B eins und E eins veranschaulichen die beiden Arten von IgG-Interna-Steuerungsausfällen, unzureichendes Testantikörper- oder Testreagenz, BAG bzw. SPE. Die Testplatten-Ergebnisse werden nur interpretiert, wenn die Systemtauglichkeitskontrolle und die Serumkontrolle die hier gezeigten Akzeptanzkriterien erfüllen. Mikrokügelchen, beschichtet mit artenspezifischen Anti-Testserum-Immunglobulinen, können aufgrund unzureichender Probenmenge, zu hoher Probenverdünnung, falscher Art oder der Verwendung von Serum eines immundefizienten Wirts ungenügende Werte aufweisen.Wenn die Ergebnisse der Testspiel-Assay-Kontrolle zufriedenstellend sind, werden die individuellen Assay-Ergebnisse gemäß dem Folgenden klassifiziert. Nach diesem Verfahren sollten wir zusätzliche Methoden wie ELISA, IFA und/oder Western Blot verwenden, um unerwartete oder positive Befunde zu bestätigen. Es ist entscheidend, diese Ergebnisse zu verifizieren, bevor Entscheidungen über die Tierhaltung getroffen werden.Dies kann durch die Anwendung unterschiedlicher Methoden auf derselben Probe oder auf zusätzlichen Proben derselben Kolonie erfolgen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den multiplexen fluorimetrischen Immunoassay durchführt und die in Ihrer Einrichtung gewonnenen Ergebnisse interpretiert. Dies ermöglicht es Ihnen, den Arbeitsaufwand zu reduzieren und gleichzeitig mehr Informationen aus jedem Testprobengefäß zu gewinnen.

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Forschung

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Biologie

Dieses Video demonstriert den quantitativen Multiplex-Bakteriennachweis mit carboxylierten magnetischen Polystyrol-Mikrosphären, die in unterschiedliche Sätze eingefärbt sind. Das Verfahren umfasst die Bildung von Kügelchen-Bakterien-Komplexen, die magnetische Trennung und die flussbasierte Analyse, die eine präzise und gleichzeitige Quantifizierung mehrerer Bakterien in derselben Reaktionsvertiefung ermöglicht.

Quantitativer Multiplex-Bakteriennachweis mit Farbstoff-markierten magnetischen Mikrosphären

Im aktuellen Klima knapper Ressourcen entstehen neue Technologien, die es Forschern ermöglichen, Studien billiger, schneller und präziser durchzuführen. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines bead-basierten Speichel-Antikörper-Multiplex-Immunoassays zur gleichzeitigen Messung der Exposition des Menschen gegenüber mehreren Umweltpathogenen.

eine Speichel- Antikörper Multiplex-Immunoassay Entwicklung der Humanexposition Umwelt Pathogens zu messen

Aktuellen Multiplex Diagnostik Zika, Chikungunya und Dengue-Viren erfordern komplexe Probenvorbereitung und teure Instrumentierung, und sind in geringen Ressourcen Umgebungen geeignet zu erkennen. Wir zeigen eine Diagnose, mit denen Isotherme Verstärkung mit zielgruppenspezifischer Strang verschieblich Sonden zu erkennen und diese Viren mit hoher Sensitivität und Spezifität zu unterscheiden.

Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

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Multiplexed Fluorometric Immunoassay Testing Methodology und Fehlerbehebung

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