Multiplexed Fluorometric Immunoassay Testing Methodology und Fehlerbehebung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Antikörper gegen zufällig vorkommende infektiöse Agentien in Laboratoriumstieren nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem man Testserum mit antigenbeschichteten Mikrokügelchen inkubiert. Anschließend wird das Serum mit einer biotinylierten, artspezifischen Antikörper-IgG-Detektionsreagenz inkubiert, das antigen-antikörperbasierte Immunkomplexe erkennt.

Danach wird eine mit Streptavidin markierte FICO eryn Fluor force-Lösung hinzugefügt, um jegliche biotinylierte Immunglobuline nachzuweisen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen den positiven oder negativen Antikörperstatus für verbreitete Erreger bei Laborrodentien basierend auf multiplexer Fluoreszenz, dem immunoassay-Nettoscore und den fluoreszierenden Probenwerten. Der Hauptvorteil der Verwendung dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie ELISA ist, dass MFIA ein multiplexer Assay ist. Dies ermöglicht es einem Forscher, bis zu hundert verschiedene Assays in einem einzigen Test durchzuführen.

Nun, diese Technik verringert die Menge an verwendeten Serumproben und Einwegabfällen im Vergleich zu bestehenden Methoden, während gleichzeitig die Informationsmenge, die aus einem einzigen Test gewonnen wird, erhöht wird. Die Idee, diese Methode anzuwenden, kam uns erstmals, als wir eine große Anzahl von Serumproben auf mehrere Erreger testeten und sowohl den Arbeitsaufwand als auch die Testdauer reduzieren wollten. Die Durchführung des Verfahrens wird Donna Cohen demonstrieren, eine erfahrene Technologin aus unserem Labor. Zunächst bereiten Sie die beiden Puffer vor, die für das multiplexe Fluoreszenz-Immunoassay-Verfahren (MFIA) benötigt werden.

Das erste ist ein primärer Verdünnungspuffer, der von Charles River erhältlich ist und proprietäre Blockierstoffe enthält, um unspezifische Wechselwirkungen im Waschpuffer für den Assay zu verringern. Bereiten Sie eine Lösung von PBS mit 1 % BSA, pH 7,4, zu, um Partikel zu entfernen. Filtern Sie den Puffer mithilfe eines 0,2-Mikron-Flaschentopf-Filters in sterile, beschriftete Behälter unter Verwendung des Waschpuffers für den Assay.

Bereiten Sie zwei x-Konzentrationen biotinylierter Antispezies, IGG oder BAG sowie Streptavidin und Ficollin oder SPE vor, die verwendet werden, um die während des Inkubationsschritts mit Testserum gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe zu markieren, um Proben der folgenden Materialien und Einwegartikel vorzubereiten: mehrkanalige und einkanalige Mikropipetten sowie Spitzen und 96-Loch-Mikrotiterplatten mit geringer Proteinbindung für die Proteindilution. Nach der Sammlung von Blutproben und der Isolierung des Serums vortexen Sie das Serum kurz, bevor Sie die Proben in einem 96-Loch-Mikrotiterplattenformat in primärem Verdünnungspuffer verdünnen, um eine ordnungsgemäße und gleichmäßige Entleerung der Vertiefungen sicherzustellen. Benetzen Sie jede Vertiefung der 96-Loch-Testplatte vorab mit Waschpuffer für den Assay und aspirieren Sie die Lösung langsam während des gesamten Assays.

Die Absaugung sollte fünf bis zehn Sekunden dauern, um eine Aggregation der Kügelchen und deren Verdichtung in der Filtermembran zu verhindern, da beides die Messdauer am Ende des Assays verlängern kann. Überprüfen Sie, dass die Flüssigkeitsabtrennung gestoppt hat, indem Sie die Unterseite der Testplatte mit Papiertüchern abtupfen. Es ist wichtig, die Testplatte nach jedem Waschschritt abzutupfen, um ein Nachlaufen der Flüssigkeit aus den Vertiefungen während der Inkubation zu verhindern.

Um die Kügelchen vorzubereiten, beginnen Sie damit, die gelagerte gekoppelte Kügelchensuspension zu wirbeln. Anschließend werden sie kurz in einem Wasserbad beschallt. Es ist entscheidend, die Kügelchen ordnungsgemäß wieder aufzuschwemmen, um aggregierte Kügelchenansammlungen zu vermeiden, die zu längeren Messzeiten führen können.

Als Nächstes pipettieren Sie die 20×-Stammsuspension in den Primärdiluenten, um eine 2×-Arbeitssuspension der Perlen herzustellen. Danach geben Sie 50 Mikroliter der 2×-Perlensuspension in jedes Testloch der vorbenetzten Testplatte. Pipettieren Sie basierend auf einem vordefinierten Plattenlayout jeweils 50 Mikroliter der 2×-Test- und Kontrollseren in die Testplatte.

Befestigen Sie den Deckel auf der Platte. Bedecken Sie sie mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie die Testplatte 60 Minuten lang auf einem horizontal schwingenden Schüttler bei Raumtemperatur, um eine Verdunstung der Lösungen zu vermeiden, die den Erfolg des Assays beeinträchtigen könnte. Halten Sie die Testplatte während aller Inkubationsschritte mit dem Plattendekel bedeckt.

Zusätzlich sollte die Schüttelgeschwindigkeit über 400, aber unter 700 U/min liegen, damit die Kügelchen in Suspension bleiben und die Serumantikörper Zugang zu allen Oberflächen der gekoppelten Antigene erhalten. Nach dem Waschen der Platte in sequenziellen Inkubationen der Kügelchen mit BAG und SPE die Proben erneut waschen. Anschließend die Kügelchen durch Zugabe von 125 µL Assay-Waschpuffer resuspendieren und zwei Minuten lang schütteln, um die Platte auszulesen.

Bringen Sie es innerhalb von 10 Minuten nach der Resuspension der Perlen in das Analysengerät ein, wobei die Perlen nacheinander einen Detektor passieren, in dem sie zwei Lasern ausgesetzt werden. Ein Laser regt die internen Farbstoffe an, die den Farbsatz der Perlen identifizieren, und der andere regt den FICO-Erything-Reporterfarbstoff an. Die Intensität der FICO-Erything-Fluoreszenz für eine vorbestimmte Anzahl von Perlen wird als FM-FI-Wert gemeldet. Lesen Sie die erste Vertiefung ab, um zu überprüfen, ob das ausgewählte Perlenpanel mit dem Perlenprofil in den Testvertiefungen übereinstimmt.

Wenn Perlen außerhalb ihres vorgesehenen Perlenbereichs auf der Protokollanzeige fallen, wurde eine falsche Profilauswahl getroffen. Richtig resuspendierte Perlen füllen ihre spezifizierten Bereiche gemäß der Angaben in der Assay-Reader-Software aus. Wenn die Perlen aggregiert sind, füllen sie ihre Bereiche langsam aus.

Sie können die Testplatte aus dem Reader nehmen und die Vertiefungen manuell resuspendieren, um die Beads zu trennen. Entfernen Sie die Testplatte aus dem Reader und pipettieren Sie jede Vertiefung mit einem Mehrkanalpipettiergerät drei bis vier Mal um. Danach stellen Sie die Testplatte wieder in den Reader und setzen Sie die Ergebnisprüfung fort.

Berichten Sie über Fehler wie unzureichende Bead-Zahlen oder abfallende IgG anti IgG Bead-Scores und wiederholen Sie den Assay für diese Proben. Nach dem Export der Daten in Excel und der Berechnung der netto MFI ermitteln Sie, ob eines der Testspiel-Assay-Kontrollen ausgeschlossen werden muss, mit Ausnahme des hochwertigen Immunserums. Alle fehlgeschlagenen Kontrollen sind inakzeptabel, und der Assay muss wiederholt werden.

Diese Tabelle zeigt Daten für Testserum und Assay-Kontrollen von einer typischen Assay-Platte. Wurden alle IgG-Kontrollen bestanden? Die Testergebnisse für diese Platte zeigen, dass zahlreiche gewebereaktive Proben und IgG-Kontrollproben nicht bestanden haben, wie die orangefarbenen Vertiefungen zeigen.

A1C eins und F1 zeigen einen TC-Gewebereaktivitätsausfall an, wobei die TC-Wertung in Klammern angegeben ist; Wells B eins und E eins veranschaulichen die beiden Arten von IgG-Interna-Kontrollausfällen, unzureichendes Testantikörper- oder Testreagenz, BAG bzw. SPE. Die Testplattenergebnisse werden nur interpretiert, wenn die Systemtauglichkeitskontrolle und die Serumkontrolle die hier gezeigten Akzeptanzkriterien erfüllen. Mikrokügelchen, beschichtet mit artenspezifischen Antikörpern gegen Testserum-Immunglobuline, können aufgrund unzureichender Probenmenge, zu hoher Probenverdünnung, falscher Art oder der Verwendung von Serum eines immundefizienten Wirts ungenügende Werte aufweisen.

Wenn die Ergebnisse der Testspiel-Assay-Kontrolle zufriedenstellend sind, werden die individuellen Assay-Werte wie folgt klassifiziert. Nach diesem Verfahren sollten wir zusätzliche Methoden wie ELISA, IFA und/oder Western Blot verwenden, um unerwartete oder positive Befunde zu bestätigen. Es ist entscheidend, diese Ergebnisse zu verifizieren, bevor Entscheidungen über die Tierhaltung getroffen werden.

Dies kann durch die Anwendung unterschiedlicher Methoden am selben Probenmaterial oder an zusätzlichen Proben derselben Kolonie erfolgen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den multiplexen fluoro­metrischen Immunoassay durchführt und die an Ihrer Einrichtung gewonnenen Ergebnisse interpretiert. Dies ermöglicht es Ihnen, den Arbeitsaufwand zu verringern und gleichzeitig mehr Informationen aus jeder Probenmulde zu gewinnen.