Entwicklung eines Kolloidales-Gold-basierten Immunchromatographischer Teststreifen zum Nachweis von Cetacean Myoglobin

Das übergeordnete Ziel dieses kolloidalen immunchromatographischen Goldteststreifens ist es, das Myoglobin von Walen von dem von Robben und anderen Tieren zu unterscheiden. Mit dieser Methode kann ein schnelles und sofortiges Screening auf Walfleisch ermöglicht werden, wodurch der illegale Handel und Konsum von Walfleisch eingedämmt wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass ein erfolgreiches Ergebnis direkt in fünf bis zehn Minuten nach der Homogenisierung von 03 Gramm Muskel beobachtet werden kann, mit hervorragender Spezifität und Sensitivität.

Diese Methode kann also einen schnellen Nachweis von Walfleisch im Feld ermöglichen. Es kann auch auf anderes Fleisch wie Pferdefleisch oder Schweinefleisch aufgetragen werden. Um synthetische Peptide für die Aufzucht monoklonaler Antikörper mit Reaktivität gegenüber dem Myoglobin von Walen zu entwickeln, werden die Aminosäuresequenzen von Myoglobin-antigenen reaktiven Regionen verschiedener Tiere analysiert.

Beginnen Sie damit, die Aminosäuresequenzen von Myoglobin von Thunfisch, Huhn, Strauß, Haustiersäugetieren, Robben und 18 Walarten aus der GenBank abzurufen. Richten Sie anschließend die Sequenzen mit der richtigen Software aus. Starten Sie den Achs-Explorer, indem Sie in der Startleiste die Option Ausrichtung bearbeiten/erstellen auswählen.

Wählen Sie Neue Achse erstellen aus, und klicken Sie auf OK. Es erscheint ein Dialogfeld, in dem Sie gefragt werden, ob Sie eine DNA- oder Proteinsequenz-Ausrichtung erstellen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Protein, wählen Sie Data Open Retrieve sequences from File (Daten öffnen, Sequenzen aus Datei abrufen) und wählen Sie Sequenzdatei (Sequenzdatei) aus. Wählen Sie den Menübefehl Alles auswählen bearbeiten, um alle Standorte für jede Sequenz im Datensatz auszuwählen und eine Mehrfachsequenzausrichtung zu erstellen.

Wählen Sie Alignment Align by ClustalW aus dem Hauptmenü. Wählen Sie BLOSUM als Proteingewichtsmatrix aus und klicken Sie dann auf die Schaltfläche OK. Der dritte Schritt besteht darin, die Sequenzausrichtung zu analysieren.

Konzentrieren Sie sich auf fünf antigene reaktive Stellen und finden Sie das Fragment, das bei Walen konserviert ist. Ein Sternchen symbolisiert den Konsens in der Ausrichtung und zeigt eine Position an, die einen einzelnen, vollständig konservierten Rest aufweist. Es wurden zwei konservierte Fragmente von Walen gefunden.

Kandidatensequenzfragmente werden dann synthetisiert und zur Aufzucht monoklonaler Antikörper verwendet. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie den optimalen pH-Wert für die kolloidale Goldlösung bestimmen, der als minimaler pH-Wert definiert ist, der die Mischung aus monoklonalem Antikörper und kolloidaler Goldlösung zwei Stunden lang rot hält. Geben Sie 0,15 Mikrogramm gereinigten, detektiven monoklonalen Antikörper zu 100 Mikrolitern kolloidaler Goldlösung mit pH-Werten zwischen fünf und neun.

Für die Zwecke dieser Demonstration werden pH sechs und pH acht getestet, wobei pH acht in diesem Optimierungsschritt als optimaler pH-Wert angesehen wurde. Bestimmen Sie als Nächstes die optimale Konzentration des monoklonalen Antikörpers, indem Sie verschiedene Mengen des gereinigten, detektiven monoklonalen Antikörpers zu 100 Mikrolitern kolloidaler Goldlösung bei einem pH-Wert von acht hinzufügen.

Die optimale Konzentration, die in dieser Studie sechs Mikrogramm pro Milliliter beträgt, behält die Farbe der Mischung rot und keinen schwarzen Niederschlag. Basierend auf den Ergebnissen der Optimierungsschritte fügen Sie 60 Mikrogramm gereinigten, detektierenden monoklonalen Antikörpern tropfenweise zu 10 ml kolloidaler Goldlösung hinzu. Emulgieren Sie die Mischung vorsichtig bei Raumtemperatur für zehn Minuten.

Fügen Sie der Mischung zwei Milliliter einer 5%igen BSA-Lösung in PBS hinzu und emulgieren Sie sie 15 Minuten lang sanft bei Raumtemperatur, um Hintergrundstörungen zu reduzieren. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 10.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand mit dem unkonjugierten Antikörper und suspendieren Sie das resultierende Pellet in 4 ml PBS-T, das 1 % BSA und 0,1 % Tween-20 enthält.

Wiederholen Sie die Zentrifugation und die Suspension ein- bis zweimal. Suspendieren Sie die endgültigen Ausfällungen in 1 ml PBS-T und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Eine Grafik des Immunstreifen-Designs ist hier zu sehen.

Die Abmessungen der Pappe, der Pads und der Nitrozellulosemembran sind im Protokolltext aufgeführt. Um die Haltbarkeit zu verlängern, sollten die Immunstreifen unter niedrigen Luftfeuchtigkeitsbedingungen im Labor vorbereitet und montiert werden. Verwenden Sie eine Mikropipette, um die kolloidale, goldmarkierte monoklonale Antikörperlösung zum Konjugatpad hinzuzufügen, um es zu sättigen, und trocknen Sie das Pad dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie es zusammensetzen.

Sobald das Konjugatpad trocken ist, klebe die Nitrozellulosemembran zuerst mit doppelseitigem Klebeband auf den Karton. Verteilen Sie mit einem Immunstreifendrucker den spezifischen monoklonalen Antikörper, der das Antigen einfängt, und das schnelle Anti-Maus-IGG auf der Testzone bzw. der Kontrollzone auf der Nitrozellulosemembran. Halten Sie einen Abstand von mehr als fünf Millimetern zwischen den beiden Zonen ein.

Kleben Sie dann das konjugierte Pad auf eine Seite der Nitrozellulosemembran und das saugfähige Pad auf die andere Seite, wobei Sie die Pads auf jeder Seite um etwa zwei Millimeter überlappen. Legen Sie das Probenpad zwei Millimeter über das Konjugatkissen und kleben Sie es auf den Karton. Verwenden Sie einen Papierschneider, um sechs Millimeter breite Streifen zu erstellen.

Verpacken Sie die Streifen in einen Alufolienbeutel mit Trockenmittel und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Um eine Probe für den Kreuzreaktivitätstest vorzubereiten, fügen Sie 1 ml PBS mit 0,1 % BSA zu 0,03 Gramm roher Muskelmasse hinzu. Und verwenden Sie einen Bambusstab oder einen Mahlstab, um die Probe zu homogenisieren.

Halten Sie den Immunstreifen mit dem Ende gegenüber dem Testbereich und tauchen Sie das Probenpadteil fünf bis zehn Minuten lang in die Probe. Beobachten Sie das Ergebnis direkt. Testen Sie verschiedene Muskelproben in dreifacher Ausfertigung.

Die T-Testlinie ist so konzipiert, dass sie ein positives Signal anzeigt, wenn beide monoklonalen Antikörper Walmyoglobin nachweisen. Da das Myoglobin von Nicht-Waltieren nur mit einem dieser beiden monoklonalen Antikörper nachgewiesen werden kann, zeigt die Testlinie ein negatives Ergebnis, wenn Muskelproben von anderen Tieren getestet werden. Die C-Kontrolllinie sollte immer ein positives Ergebnis zeigen, da ein schnelles Anti-Maus-IGG den kolloidalen, goldmarkierten Nachweisantikörper bindet.

Ein fehlerhaftes Ergebnis in der Kontrolllinie weist darauf hin, dass die Qualität der Materialien auf dem Band schlecht ist. Die westliche Blutanalyse mit Hybridom-Überständen zeigt, dass der monoklonale Antikörper CGF5H9 Wale und andere Säugetiere als einzelne gefärbte Bande bei einem vorhergesagten Molekulargewicht von etwa 17 kDa nachweist. Der gemeine Zwergwal zeigt ein verhältnismäßig schwächeres Band als die Bänder anderer Wale.

Bei Thunfisch, Robben und Hühnchen gibt es keine Banden. Während eine Bande bei etwa 50 kDa für Schweine beobachtet wird. Identische Ergebnisse erhält die Punktblutanalyse.

Obwohl die westliche Blutanalyse mit dem monoklonalen Antikörper CSF1H13 mehrere unspezifische Banden für Schwein und Thunfisch zeigt, ist CSF1H13 hochspezifisch, da er nur mit Walen reagiert. Und die Robbe hat eine Bande mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von etwa 17 kDa. Identische Ergebnisse erhält die Punktblutanalyse.

Die Ergebnisse des indirekten ELISA von Muskelextrakten verschiedener Spezies unter Verwendung von gereinigtem CGF5H9 zeigen positive Signale für Kühe, Ziegen, Hunde, Kaninchen und Wale, ein schwaches positives Signal für Schweine und negative Signale für Thunfisch, Huhn und Robben. CSF1H13 zeigt eine hohe Affinität zu Walen und Robben. Beide monoklonalen Antikörper können mit allen vier Walarten, die aus verschiedenen Familien stammen, stark reagieren, was auf eine breite Reaktivität gegenüber verschiedenen Walarten hinweist.

Die Spezifität des immunen kolloidalen Goldstreifens wird durch diese repräsentativen Ergebnisse gezeigt. Die Verwendung von Muskelproben, die nicht von Walen stammen, führt zu nur einer einzigen Bande an der Kontrolllinie. Bei der Verwendung von Walmuskelproben sind die Signalbanden jedoch sowohl an der Testlinie als auch an der Kontrolllinie vorhanden.

Sobald sie gemeistert sind, kann die Vorbereitung der markierten Antikörper und diese Konstruktion der Streifen in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Peptid sorgfältig zu gestalten. Verwenden Sie verschiedene Methoden zum Screening geeigneter monoklonaler Antikörper.

Und verwenden Sie eine hohe Qualität an kolloidalem Gold, um markierte Antikörper herzustellen. Im Anschluss an diese Verfahren können weitere Methoden wie die PCR-basierte DNA-Analyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Walart und woher sie stammt. Der CSF1H13 monoklonale Antikörper, der stark ist und eine Affinität nur zu Meeressäugern aufweist, kann in verschiedenen ELISA-Formaten eingesetzt werden, die viele weitere Möglichkeiten bieten, die biologischen, physiologischen und chemischen Aspekte von Myoglobin bei Meeressäugern zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man spezifische monoklonale Antikörper entwickelt und diese anschließend auf einen Schnellteststreifen aufträgt.