Entwicklung eines Kolloidales-Gold-basierten Immunchromatographischer Teststreifen zum Nachweis von Cetacean Myoglobin

Das übergeordnete Ziel dieses immunochromatographischen Teststreifens mit kolloidalem Gold besteht darin, das Myoglobin von Cetaceen von dem von Robben und anderen Tieren zu unterscheiden. Diese Methode ermöglicht eine schnelle und vor-Ort-Untersuchung auf Cetaceenfleisch und trägt somit zur Eindämmung des illegalen Handels und Verbrauchs bei. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass ein erfolgreiches Ergebnis bereits fünf bis zehn Minuten nach der Homogenisierung von 0,3 Gramm Muskelgewebe direkt beobachtet werden kann, mit hervorragender Spezifität und Empfindlichkeit.

Daher kann diese Methode einen schnellen Nachweis von Cetaceenfleisch im Feld ermöglichen. Sie kann auch auf anderes Fleisch wie Pferdefleisch oder Schweinefleisch angewendet werden. Um synthetische Peptide zur Erzeugung monoklonaler Antikörper mit Reaktivität gegenüber dem Myoglobin von Cetaceen zu entwerfen, werden die Aminosäuresequenzen antigenreaktiver Bereiche des Myoglobins aus verschiedenen Tieren analysiert.

Holen Sie zunächst die Aminosäuresequenzen von Myoglobin aus Thunfisch, Huhn, Strauß, domestizierten Säugetieren, Robbe und 18 Arten von Cetaceen aus GenBank ab. Anschließend alignieren Sie die Sequenzen mithilfe der geeigneten Software. Starten Sie den Alignment Explorer, indem Sie im Startmenü die Option Align Edit/Build Alignment auswählen.

Wählen Sie „Neue Ausrichtung erstellen“ und klicken Sie auf „OK“. Ein Dialogfeld erscheint mit der Frage, ob Sie eine Ausrichtung von DNA- oder Proteinsequenzen erstellen möchten. Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Bezeichnung „Protein“, wählen Sie „Daten öffnen – Sequenzen aus Datei abrufen“ und dann die Sequenzdatei aus. Wählen Sie den Menübefehl „Bearbeiten – Alles auswählen“, um alle Stellen jeder Sequenz im Datensatz zur Erstellung einer multiplen Sequenzalignierung auszuwählen.

Wählen Sie im Hauptmenü die Option „Alignment“ und dann „Align by ClustalW“. Wählen Sie BLOSUM als Protein-Gewichtungsmatrix und klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche „OK“. Der dritte Schritt besteht darin, die Sequenzalignierung zu analysieren.

Konzentrieren Sie sich auf fünf antigenreaktive Stellen und finden Sie das Fragment, das bei Cetaceen konserviert ist. Ein Sternsymbol steht im Alignement für Konsens und zeigt eine Position an, die einen einzelnen, vollständig konservierten Rest aufweist. Es wurden zwei konservierte Fragmente bei Cetaceen gefunden.

Kandidaten-Sequenzfragmente werden anschließend synthetisiert und zur Herstellung monoklonaler Antikörper verwendet. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie den optimalen pH-Wert für die kolloidale Goldlösung bestimmen, definiert als der minimale pH-Wert, bei dem das Gemisch aus monoklonalem Antikörper und kolloidaler Goldlösung zwei Stunden lang rot bleibt. Geben Sie 0,15 Mikrogramm gereinigten detektierenden monoklonalen Antikörper zu 100 Mikrolitern kolloidaler Goldlösung mit pH-Werten im Bereich von fünf bis neun.

Für die Zwecke dieser Demonstration werden pH 6 und pH 8 getestet. pH 8 galt nach diesem Optimierungsschritt als der optimale pH-Wert. Als Nächstes bestimmen Sie die optimale Konzentration des monoklonalen Antikörpers, indem Sie verschiedene Mengen des gereinigten detektierenden monoklonalen Antikörpers zu 100 Mikrolitern kolloidaler Goldlösung bei pH 8 hinzufügen.

Die optimale Konzentration, die in dieser Studie sechs Mikrogramm pro Milliliter beträgt, bewahrt die rote Farbe des Gemischs ohne schwarzen Niederschlag. Basierend auf den Ergebnissen der Optimierungsschritte werden 60 Mikrogramm gereinigter detektierender monoklonaler Antikörper tropfenweise zu 10 mL kolloidaler Goldlösung gegeben. Das Gemisch wird zehn Minuten lang vorsichtig bei Raumtemperatur emulgiert.

Geben Sie zwei Milliliter einer 5 %igen BSA-Lösung in PBS zu der Mischung hinzu und emulgieren Sie vorsichtig 15 Minuten bei Raumtemperatur, um Hintergrundinterferenzen zu reduzieren. Zentrifugieren Sie die Mischung 30 Minuten bei 10.000 × g und vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand mit dem nicht konjugierten Antikörper und suspendieren Sie das resultierende Pellet in 4 mL PBS-T, das 1 % BSA und 0,1 % Tween-20 enthält.

Wiederholen Sie die Zentrifugation und Suspension ein- oder zweimal. Suspendieren Sie die endgültigen Präzipitate in 1 mL PBS-T und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Eine Grafik des Immundetektionsstreifendesigns ist hier dargestellt.

Die Abmessungen des Kartons, der Pads und der Nitrocellulosemembran sind im Protokolltext aufgeführt. Um die Haltbarkeit zu verlängern, sollten die Immuno-Streifen in einer Umgebung mit niedriger Luftfeuchtigkeit hergestellt und zusammengesetzt werden. Geben Sie mit einer Mikropipette die kolloidales Gold-markierte monoklonale Antikörperlösung auf das Konjugatpad, um es zu sättigen, und trocknen Sie das Pad anschließend eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie es zusammenbauen.

Nachdem das Konjugatpad trocken ist, verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um zunächst die Nitrocellulosemembran auf den Karton zu kleben. Verteilen Sie mit einem Immunstrip-Drucker den spezifischen, antigenerkennenden monoklonalen Antikörper und das schnelle Anti-Maus-IgG jeweils auf der Testzone und der Kontrollzone der Nitrocellulosemembran. Halten Sie einen Abstand von mehr als fünf Millimetern zwischen den beiden Zonen ein.

Bringen Sie dann das Konjugatpad auf einer Seite der Nitrocellulosemembran und das Absorptionspad auf der anderen Seite an, wobei die Pads auf jeder Seite um etwa zwei Millimeter überlappen. Legen Sie das Probepad um zwei Millimeter über das Konjugatpad und kleben Sie es auf den Karton. Verwenden Sie einen Papiercutter, um Streifen mit einer Breite von sechs Millimetern herzustellen.

Verpacken Sie die Streifen in einer Aluminiumfolientasche mit Trockenmittel und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius bis zur Verwendung. Um eine Probe für den Kreuzreaktivitätstest vorzubereiten, geben Sie 1 mL PBS mit 0,1 % BSA zu 0,03 Gramm rohem Muskelgewebe hinzu. Und homogenisieren Sie die Probe mit einem Bambusstäbchen oder einem Mörserstab.

Halten Sie den Immunstreifen am Ende gegenüber dem Testbereich fest und tauchen Sie den Probepad-Teil fünf bis zehn Minuten lang in die Probe ein. Beobachten Sie das Ergebnis direkt. Testen Sie verschiedene Muskelproben im Dreifachansatz.

Die T-Testlinie ist so konzipiert, dass sie ein positives Signal anzeigt, wenn beide monoklonalen Antikörper Cetaceen-Myoglobin nachweisen. Da das Myoglobin von nicht zu den Cetaceen gehörenden Tieren nur von einem der beiden monoklonalen Antikörper erkannt werden kann, zeigt die Testlinie ein negatives Ergebnis an, wenn Muskelproben von anderen Tierarten getestet werden. Die C-Kontrolllinie sollte stets ein positives Ergebnis anzeigen, da schnelles Anti-Maus-IGG den mit kolloidalem Gold markierten Detektionsantikörper bindet.

Ein fehlgeschlagenes Ergebnis in der Kontrolllinie weist darauf hin, dass die Qualität der Materialien auf dem Teststreifen schlecht ist. Die Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Hybridom-Überständen zeigt, dass der monoklonale Antikörper CGF5H9 Wale und andere Säugetiere als einzelnes gefärbtes Band bei einem vorhergesagten molekularen Gewicht von etwa 17 kDa nachweist. Bei dem Gemeinen Zwergwal zeigt sich ein vergleichsweise schwächeres Band als bei anderen Walen.

Für Thunfisch, Robbe und Huhn sind keine Banden vorhanden. Dagegen wird für Schwein ein Band bei etwa 50 kDa beobachtet. Identische Ergebnisse werden durch die Punktblutanalyse erhalten.

Obwohl die Western-Blot-Analyse unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers CSF1H13 mehrere unspezifische Banden für Schwein und Thunfisch zeigt, ist CSF1H13 aufgrund seiner Reaktion ausschließlich mit Cetaceen hochspezifisch. Robben weisen eine Bande bei einem vorhergesagten molekularen Gewicht von etwa 17 kDa auf. Identische Ergebnisse werden durch die Dot-Blot-Analyse von Blut erzielt.

Ergebnisse aus indirekten ELISA-Tests von Muskel-Extrakten verschiedener Arten unter Verwendung des gereinigten CGF5H9 zeigen positive Signale für Rind, Ziege, Hund, Kaninchen und Cetaceen, ein schwaches positives Signal für Schwein sowie negative Signale für Thunfisch, Huhn und Robbe. CSF1H13 zeigt eine hohe Affinität zu Cetaceen und Robben. Beide monoklonalen Antikörper können stark mit allen vier Cetaceen-Arten reagieren, die verschiedenen Familien angehören, was auf ihre breite Reaktivität gegenüber unterschiedlichen Cetaceen-Arten hinweist.

Die Spezifität des immunologischen kolloidalen Goldstreifens wird durch diese repräsentativen Ergebnisse gezeigt. Bei Verwendung von Nicht-Wal-Muskelproben erscheint nur ein einzelnes Band an der Kontrolllinie. Wenn hingegen Wal-Muskelproben verwendet werden, sind die Signale an sowohl der Testlinie als auch der Kontrolllinie vorhanden.

Wenn man die Herstellung markierter Antikörper und den Aufbau dieser Streifen einmal beherrscht, kann dies innerhalb von vier Stunden erfolgen, sofern es ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sorgfältig auf die Gestaltung des Peptids zu achten. Wenden Sie mehrere Methoden zur Auswahl geeigneter monoklonaler Antikörper an.

Und verwenden Sie eine hochwertige kolloidale Goldlösung zur Herstellung markierter Antikörper. Nach Durchführung dieser Verfahren können weitere Methoden wie PCR-basierte DNA-Analysen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Art des Cetaceen und zu dessen Herkunft. Der monoklonale Antikörper CSF1H13, der stark ist und eine Affinität ausschließlich zu Meeressäugern aufweist, kann in verschiedenen ELISA-Formaten eingesetzt werden, die zahlreiche weitere Möglichkeiten zur Untersuchung der biologischen, physiologischen und chemischen Aspekte von Myoglobin bei Meeressäugern bieten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man spezifische monoklonale Antikörper entwickelt und sie anschließend auf einem Schnellteststreifen anwendet.