Name: Entwicklung eines Kolloidales-Gold-basierten Immunchromatographischer Teststreifen zum Nachweis von Cetacean Myoglobin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines kolloidalen Gold-Immunchromatographie-Teststreifens zur Unterscheidung von Cetacean-Myoglobin von anderen Tieren. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Vor-Ort-Überprüfung von Wal- und Delfinfleisch mit hoher Spezifität.

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Wir danken den Kollegen von der Taiwan Cetacean Society, der Meeresbiologie und dem Cetacean Research Center der National Cheng Kung University, dem Farglory Ocean Park und dem Animal Disease Diagnostic Center der National Chiayi University für die Probenentnahme. Dieses Projekt wurde durch einen Zuschuss des Landwirtschaftsrates von Taiwan an WCY finanziert (100AS-02.1-FB99).

Ethik - Statement: Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den internationalen Richtlinien durchgeführt und genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) der Nationalen Chiayi University, Zulassung ID: 99022. Die cetacean Probe Verwendung durch den Rat für Landwirtschaft von Taiwan (Research Erlaubnis erlaubt wurde 100M-02.1-C-99). 1. Muskel-Probenvorbereitung und SDS-PAGE Hinweis: Muskelproben von 23 Arten , darunter 16 Arten von Meeressäugetieren, 5 Arten von Landsäugetieren, Thunfisch und Huhn wurden in dieser Studie (Tabelle 1). Die cetacean Muskelproben wurden aus gestrandeten Personen, Fischerei Beifang und die Einziehung erhalten. Kaninchen, Ratte, Hund und Huhn Muskelgewebe wurden von Animal Disease Diagnostic Center of National Chiayi Universität erhalten. Proben von Rind, Schwein, Lamm und Thunfisch wurden von einem lokalen Supermarkt gekauft. Die Muskelprobe der Seehund (Phoca vitulina </em&gt;) wurde von Farglory Ocean Park zur Verfügung gestellt. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde verwendet, um lösliche Proteine ​​mit unterschiedlichen Molekulargewichten in Muskelproben zu trennen. <ol><li> Speichern Sie alle Proben bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Pre-kühlen Mörtel bei -20 ° C. Dann legte 3 g gefrorene Muskelprobe hinein. </li><li> Homogenisieren der Probe mit 10 ml kaltem phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit einem Gewebe-Homogenisator. </li><li> Zentrifugieren Sie die homogenisierte Probe bei 10.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Sammeln Sie die Überstände und lagern Sie es bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten 5 ml 5% Sammelgel (3,07 ml destilliertes Wasser, 1,25 ml 4x oberen Gel Puffer von pH 6,8, 625 &amp; mgr; l 40% -iges Acrylamid, 50 ul 10% Ammoniumpersulfat (APS) und 5 ul Tetramethylethylendiamin ( TEMED)) und 10 ml 15% Trenngel (3,65 ml destilliertem Wasser, 2,5 ml 4-fach niedriger Gel Puffer von pH 8,8, 3,75 ml 40% Acrylamid, 100 &amp; mgr; l 10% APS,und 4 &amp; mgr; l TEMED). <ol><li> In der Elektrophorese-Zelle, gieße Sammelgel (5% Acrylamid) auf der Oberseite des Trenn Gel (15% Acrylamid), nachdem diese erstarrt ist. Legen Sie eine Gelkamm in Stapel Gel. </li></ol></li><li> Führen Sie PAGE gemäß den folgenden Bedingungen: Anfangslaufzustand: 100 Volt, 20 min und Endzustand: 120 Volt, 40 min. </li><li> Stain das Gel mit Coomassie-Brilliantblau bei Raumtemperatur für 30 Minuten, bis das Gel in der Farbe gleichmäßig blau ist. Anmerkung: Die Färbung abgeschlossen ist, wenn das Gel in der Farbstofflösung nicht mehr sichtbar ist. </li><li> Entfärben sie mit der Lösung Essigsäure (10%) bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Bands beginnen zu erscheinen. Weiter bei 4 ° C über Nacht Entfärben bis Hintergrund ist klar. </li></ol> 2. Peptid-Synthese und die Produktion monoklonaler Antikörper <ol><li> Rufen Sie die Aminosäuresequenzen von Mb von GenBank einschließlich Thunfisch, Huhn, Strauß, Haussäugetiere, Dichtung und 18 Artenvon Walen (Tabelle 2). </li><li> Richten Sie die Sequenzen unter Verwendung geeigneter Software 16: <ol><li> Starten Sie den Alignment Explorer , indem Sie das Ausrichten: Bearbeiten / Build Ausrichtung in der Startleiste; wählen Sie Neue Ausrichtung erstellen und klicken Sie auf OK. Es erscheint ein Dialog zu fragen: &quot;Sind Sie mit der Erstellung eines DNA-oder Protein-Ausrichtungs-Sequenz?&quot; </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Bezeichnung &quot;Protein&quot;; wählen Sie Daten: Open: Abrufen von Sequenzen aus Datei , und wählen Sie Sequenzdatei; Bearbeiten: Alles Menübefehl Alle Site wählen für jede Folge in den Daten für die Erstellung eines multiplen Sequenz - Alignment - Set auszuwählen. </li><li> Wählen Sie Ausrichtung: Richten von ClustalW aus dem Hauptmenü die ausgewählten Sequenzen Daten unter Verwendung des ClustalW Algorithmus auszurichten; wählen Sie &quot;BLOSUM&quot; als Protein Gewicht Matrix dann auf die Schaltfläche OK klicken. </li></ol></li><li> Analysieren Sie den Sequenzabgleich: <ol><li> Konzentrieren Sie sich auf 5 Antigen-reaktiven sites 17: Seite 1 (AKVEADVA, 15-22), Seite 2 (KASEDLK, 56-62), Seite 3 (ATKHKI, 94-99), Seite 4 (HVLHSRH, 113-119) und Site - 5 (KYKELGY, 145- 151) und das Fragment unter Walen konserviert finden. Ein * (Sternchen; Konsens-Symbol in der Ausrichtung (Protokoll 2.2.3)) gibt an Positionen, die einen einzigen, vollständig konservierten Rest haben. Die folgenden konservierte Fragmente in Walen wurden gefunden: Sequenz KASEDLKKHG und Sequenz HVLHSRHP (die Seite 2 enthält) (einschließlich Standort 4). </li></ol></li><li> Synthetisieren Kandidatensequenzfragmente nach der Sequenzanalyse und das Konjugat mit einem Protein Ovalbumin (OVA) als Trägerprotein unter Verwendung von kommerziellen Diensten. <ol><li> Hinzufügen hydrophoben Aminosäuren (zB Methionin) an das N-terminale antigener reaktiven Stelle zur Verhinderung der Zersetzung von Peptid (zB M-KASEDLKKHG). </li><li> Verlängerung der C-terminalen antigener reaktive Stelle für die Kernantigenstelle an die Immunozyten auszusetzen. Des Weiteren conjuGate das Peptid mit OVA durch einen Cystein - Zugabe (Cys, C) an die C-terminale (zB M-KASEDLKKHG-NTVL-C). </li></ol></li><li> Emulgieren komplettem Freund&#39;schem Adjuvans für Immunogen 1 oder unvollständiges Freund&#39;sches Adjuvans für Immunogen 2 mit einem gleichen Volumen jedes synthetische Peptid in PBS (3 ml, Endkonzentration von 30-50 &amp; mgr; g / 100 &amp; mgr; l). </li><li> Beimpfen von Immunogen 1 (0,1 mg) subkutan in die jeweils 5 weiblichen BALB / c Mäusen. </li><li> Führen Sie subkutanen Booster-Injektionen fünfmal unter Verwendung von Immunogen 2 in zweiwöchigen Intervallen und sammeln Testseren durch Schwanzclip Probenahme aus den Mäusen vor jedem Booster. </li><li> Bestimmen Sie sera Titer für das erste Screening. <ol><li> Man löst 100 &amp; mgr; g freies Peptid in 25 ml Reaktionspuffer und 50 &amp; mgr; l Aliquot der Lösung in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen. In 10 ul Kupplungsreagenz Lösung in jede Vertiefung und die Platte mischen. Inkubiere die Platte für 2 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Inhalt des Brunnens,Waschen jeder Vertiefung 3 mal mit destilliertem Wasser, und blockieren die Platte durch Zugabe von 200 ul Lösung blockiert. Inkubieren für 1 h bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Inhalt und waschen jeder Vertiefung 3 mal mit destilliertem Wasser. </li><li> Führen indirekte ELISA (Protokoll 5,1-5,7) für sera Titer für das erste Screening zu bestimmen. Wählen Sie die Maus mit dem höchsten Titer (höchste optische Dichte) für Milz Sammlung. </li></ol></li><li> Drei Tage vor der Milz Sammlung, impfen 0,1 mg Immunogen 1 subkutan in die Maus, um den höchsten Titer präsentiert. </li><li> Sammle die Milzzellen aus den immunisierten Mäusen ausgewählt und verschmelzen mit murinen Myelomzellen F0 (sp2 / 0-Ag14) Hybridom - Zellen für die Erzeugung mAb 18 zu erhalten. </li><li> 14 Tage nach der Fusion, wählen Sie die positiven Klone durch die Reaktivität von Hybridomaüberständen Screening gegenüber freien synthetisches Peptid mit der indirekten ELISA (Protokoll 5,1-5,7). </li><li> Verdünne die Zellen zu einer entsprechenden Anzahl pro Vertiefung für maximizing der Anteil an Vertiefungen, die nur einen einzigen Klon (Verdünnungsklonierung) enthalten. <ol><li> 100 l Zellkulturmedium zu allen Vertiefungen in der 96-Well-Platte mit Ausnahme gut A1, die leer gelassen wird. </li><li> In 200 ul der Zellsuspension zu gut A1. Dann Transfer schnell 100 ul von A1 bis B1 und mischen durch vorsichtiges Pipettieren. Wiederholen Sie diese 1: 2-Verdünnungen nach unten die gesamte Spalte, und dann wurden 100 &amp; mgr; l von H1 zu verwerfen, so dass es mit dem gleichen Volumen wie die Vertiefungen darüber endet. </li><li> Fügen Sie weitere 100 ul Medium zu Säule 1 mit einer 8-Kanal Mikropipette. Dann Transfer schnell 100 &amp; mgr; l aus jeder der Vertiefungen in Spalte 1 zu den in Spalte 2 die gleiche Pipette und mischen durch vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Mit den gleichen Spitzen, wiederholen Sie diese 1: 2-Verdünnungen über die gesamte Platte. Verwerfen 100 ul aus jeder der Vertiefungen in der letzten Spalte. </li><li> Bringt den Endvolumen von allen Vertiefungen zu 200 &amp; mgr; l durch Zugabe von 100 &amp; mgr; l Medium zu jeder Vertiefung. inkubieren plate ungestört bei 37 ° C in einem befeuchteten CO 2 -Inkubator. </li><li> Überprüfen Sie jede gut und markieren Sie alle Brunnen, die nur eine einzige Kolonie enthalten. Führen Sie zwei oder mehr Klonierungen bis&gt; 90% der Vertiefungen, die einzelne Klone positiv sind für die Antikörperproduktion. </li></ol></li><li> Bildschirm, um die Klone durch Western-Blot und Dot-Blot (Protokoll 3,1-4,6). Dann Subkultur Kolonien aus den Vertiefungen in größere Gefäße Zellen zur Gewinnung von mAb zu erweitern. Normalerweise jeder Klon in einem einzigen gut übertragen in einem 12- oder 24-Well-Platte. </li><li> Messen Sie die Affinität zwischen den mAb und den Muskelextrakten von Kuh, Ziege, Schwein, Hund, Kaninchen, Thunfisch, Huhn, Dichtung und vier repräsentative Walarten durch Western-Blot und Dot-Blot (Protokoll 3,1-4,6). </li><li> Beimpfen ausgewählten Hybridomzellen (bis zu 3 x 10 6) intraperitoneal in Mäuse - Aszites zu induzieren. Abdominal Schwellung ist in der Regel offensichtlich innerhalb von 7-10 Tagen Hybridom Injektion. Sammeln Flüssigkeit mit einer Injektionsnadel mit(Weniger als 20 gauge). </li><li> Zentrifuge Aszitesflüssigkeit (10.000 xg für 10 min) Zellen und Trümmer zu entfernen. Man filtriert durch ein 0,45 um-Filter. Hinzufügen von 1 zu 20 ml der Probe, 15 ml Bindungspuffer, und 3 bis 5 ml Elutionspuffer in das Protein G-Sepharose-Säule. Sammeln Sie die Elutionsfraktion enthält gereinigter Antikörper aus den Mäusen Ascites-Flüssigkeit. </li><li> Bestimmen Sie den Antikörperisotyp durch Antikörper Isotypisierungskits der Verwendung der Herstelleranweisungen. </li></ol> 3. Western Blot <ol><li> Bereiten 2x Beladungspuffer, enthaltend β-Mercaptoethanol (BME), indem sie mit 50 ul BME 950 ul 2x Laemmli Probenpuffer vermischt werden. Verdünnen Sie die Muskelüberstand (Protokoll 1,1-1,4) in Ladepuffer mit geeigneten Verhältnis zum Erhalt gute Signale: 1:50 (Walen und Dichtung) und 1: 5 (Haustieren und Thunfisch), wenn polyklonalen Kaninchen-Anti-Human-Mb Antikörper verwendet, und 1: 1 (Schwein, Kaninchen, Huhn und Thunfisch), 1: 5 (Kuh, Ziege und Hund) und 01.25 (Walen und Dichtung), wenn einntibody ist aus Hybridom-Überstand. </li><li> Wärme Probe bei 95 ° C für 5 min. Last Proben in die Vertiefungen von SDS-PAGE-Gel (4% Acrylamid Stapelung und 12% Acrylamid Trenn) zusammen mit Molekulargewichtsmarkern. Führen Sie das Gel für 5 min bei 50 V erhöhen Sie die Spannung bis 150 V, um den Lauf in etwa 1 Stunde zu beenden. </li><li> Legen Sie das Gel in 1x Transferpuffer für 15 min. Transfer des abgetrennten Protein auf Nitrocellulose (NC) -Membranen, nachdem sie durch PAGE getrennt. Transfer kann bei 100 V für 60 bis 90 min durchgeführt werden. </li><li> Bereiten Blockierungslösung: 1x PBS, enthaltend 0,1% Tween 20 mit 5% fettfreier Trockenmilch. Blockieren die NC-Membran in 25 ml für 1 Stunde Lösung bei Raumtemperatur blockiert. Waschen dreimal 5 min mit je 15 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (PBST). </li><li> Inkubieren der Membran und primärem Antikörper (Aszites-Flüssigkeit oder Hybridom-Überstand) in 10 ml Antikörperverdünnungspuffer über Nacht bei 4 ° C mit 5% Blockierungslösung verdünnt. </li><li> Waschen Sie die Membrane dreimal wieder mit PBST übermäßige Antikörper zu reinigen. </li><li> Inkubieren der Membran mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-anti-Maus IgG bei 1: 1250 in Blockierlösung unter leichtem Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen der Membran wieder und inkubieren es in der 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat / p-Nitroblautetrazoliumchlorid (BCIP / NBT) Phosphatase-Substratmischung für 10 bis 20 min, bis die Farbentwicklung. </li><li> Die Reaktion durch die Membran in mehrere Änderungen von destilliertem Wasser zu waschen. </li></ol> 4. Dot Blot <ol><li> Verdünnen Sie die Muskelüberstand (Protokoll 1,1-1,4) in 5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBST mit geeigneten Verhältnis zum Erhalt gute Signale: 1: 5 für Haustiere und Thunfisch und 01.25 für Walen und Dichtung. Spot 5 &amp; mgr; l Proben auf Membran. Minimieren Sie den Bereich, dass die Lösung (in der Regel 3-4 mm Durchmesser) dringt durch sie langsam Anwendung. </li><li> Trocknen der Membran bei Raumtemperatur (zB &lt;/ Em&gt; in einer laminaren Strömung für 30-60 min), blockieren Lösung in Petrischale für 1 Stunde bei Raumtemperatur, und waschen Sie es mit PBST mit blockieren. </li><li> Inkubieren der Membran mit primärem Antikörper (mAb aus Hybridom-Überstand bei 1: 10.000 oder Aszitesflüssigkeit bei 1: 100.000 in 5% Blockierungslösung verdünnt) für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Verwendung PBST die Membran dreimal 5 min jeweils zu waschen überschüssigen Antikörper zu entfernen, und dann (anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase-konjugiertem Ziege auf 1: 1.250 in 5% Blockierungslösung) mit sekundärem Antikörper inkubiert für 1 Stunde bei Raumtemperatur . </li><li> Waschen der Membran wieder und inkubiere in der BCIP / NBT-Phosphatase-Substratmischung innerhalb 10 bis 20 min, bis die Farbentwicklung. </li><li> Die Reaktion durch die Membran in mehrere Änderungen von destilliertem Wasser zu waschen. </li></ol> 5. Indirekte ELISA <ol><li> Bereiten Waschpuffer (0,002 M Imidazol-gepufferte Salzlösung mit 0,02% Tween 20). Waschen Sie die Platte 3-mal mit WaschPuffer zwischen jedem folgenden Schritt (Protokoll 5,2-5,5). </li><li> Bereiten 01.25 Verdünnung von Muskelüberstand (Protokoll 1,1-1,4) in Beschichtungspuffer. Mantel eine 96-Well-ELISA-Platte mit 100 &amp; mgr; l verdünnte Überstand bei 4 ° C über Nacht und Blockieren mit Blockierungspuffer (1% BSA in PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Sie 1: 2000 Verdünnung des gereinigten mAb mit verdünnter Puffer und fügen 100 ul verdünnt mAb in jede Vertiefung. Inkubieren der Platte für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Hinzufügen anti-Maus-Ziegen-IgG, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (1: 200-Verdünnung in Puffer verdünnt) für die weitere Inkubation. </li><li> In Peroxidase Substrat in jede Vertiefung (100 ul / Vertiefung) und Inkubation für 10-15 min. </li><li> Stoppen Sie die Enzymreaktion durch die Peroxidase-Stop-Lösung (100 ul / Vertiefung), wenn die Farbentwicklung zu beobachten ist. </li><li> Lesen Sie die optische Dichte bei 450 nm im Mikrotiterplatten-Spektralphotometer. </li></ol> 6. Herstellung von kolloidalem Gold markiertem mAb </p&gt; Hinweis: Die Farbe der kolloidalen Goldlösung, und die Mischung sollte immer rot sein. Der pH-Wert, Konzentration von mAb, Zentrifugengeschwindigkeit, wenn schwarzer Niederschlag bemerkt wird. Die Schritte 6.1 und 6.2 sind Optimierungsschritte. <ol><li> Hinzufügen gereinigter Erfassungs mAb (50 ug / ml, 3 &amp; mgr; l) zu 100 &amp; mgr; l von kolloidalen Goldlösung mit pH-Werten von 5 bis 9 variierende. Die minimale pH-Wert, die Farbe Rot zwei Stunden lang hält, ist als der optimale pH-Wert betrachtet. Hinweis: In dieser Studie wurden 0,1 M Kaliumcarbonat verwendet wurde Kolloidgold einzustellen (40 nm) Lösung pH 8.0 (pH-Optimum). </li><li> Fügen verschiedene Menge an gereinigtem mAb Erfassen (500 ug / ml, 1-20 ul) zu 100 ul von kolloidalen Goldlösung bei pH 8,0. Anmerkung: Die optimale Konzentration in dieser Studie beträgt 6 &amp; mgr; g / ml (kein schwarzer Niederschlag). </li><li> Nach den obigen Ergebnissen, mit 60 ug gereinigtem Nachweis mAb tropfenweise zu 10 ml Kolloid Goldlösung. Emulgieren der Mischung vorsichtig bei Raumtemperatur für 10 min. Anzeiged 2 ml 5% BSA-Lösung in PBS (pH 7,4) zu dem Gemisch gegeben und für 15 min bei Raumtemperatur leicht emulgieren, um Hintergrundstörungen zu reduzieren. </li><li> Zentrifugieren der Mischung bei 10.000 × g für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand mit nicht-konjugierten Antikörper sorgfältig und setzt die resultierenden Pellets in 4 ml PBST mit 1% BSA und 0,1% Tween 20, und wiederholen Zentrifugation und Suspension mehrere Male. </li><li> Suspend die letzten Niederschläge in 1 ml PBST und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 7. Konstruktion von Immun-Streifen Hinweis: Abbildung 1 zeigt die Immunstreifendesign. Bereiten Sie und die Streifen in einer feuchtigkeitsarmen Laborumgebungsbedingungen (&lt;20% relative Luftfeuchtigkeit) für eine längere Haltbarkeit (&gt; 1 Jahr) montieren. Die Abmessungen des Pads und Membran sind: Konjugat-Pad 300 mm x 10 mm, absorbierendes Kissen 300 mm x 24 mm, Probenkissen 300 mm x 24 mm, NC-Membran 300 mm x 25 mm, Pappe 300mm x 80 mm. <ol><li> Hinzufügen Kolloidgold-markiertem mAb-Lösung aus Schritt 6.6 mit einer Mikropipette, die das Konjugat-Pad zu sättigen und dann für 1 h bei 37 ° C Trocknen vor der Montage. </li><li> Verteilen das spezifische Antigen-Einfangen mAb (500 ug / ml) auf die Testzone und Kaninchen-anti-Maus-IgG (500 &amp; mgr; g / ml) auf der Steuerzone mAb auf der NC-Membran mit einer Pipette oder immunostrip Drucker zu erfassen. Pflegen Abstand (&gt; 5 mm) zwischen den beiden Zonen Interferenzen zu vermeiden. </li><li> Fügen Sie das konjugierte Polster, absorbierende Kissen und NC-Membran auf der Montagefläche mit doppelseitigem Klebeband. Hinweis: overlap die Pads auf jeder Seite der NC-Membran um ca. 2 mm. Unangemessen Streifen Konstruktion wird in einer unvollständigen Prüfung zur Folge haben. </li><li> Legen Sie das Probenkissen über das Konjugat-Pad (2 mm) und fügen Sie ihn auf der Montagefläche. </li><li> Erstellen Sie 6 mm breiten Streifen mit einem Papierschneider. Packen Sie die Streifen in der Aluminiumfolienbeutel mit Trockenmittel, und lagern Sie sie bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 8. Kreuzreaktivität-Test <ol><li> Homogenisieren 0,03 g der rohen Muskelprobe mit 1 ml PBS (enthaltend 0,1% BSA) in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen einen Bambusstab verwendet oder Stangenschleifen. </li><li> Halten Sie den Streifen am Ende gegenüber den Testbereichen und tauchen Sie das Probenkissen Teil in die Probe für 5-10 Minuten und das Ergebnis direkt zu beobachten. <ol><li> Optional: Sammeln Sie 500 ul Überstand und überträgt es auf ein neues Zentrifugenröhrchen. Anmerkung: Dieser Schritt wird vorgeschlagen, wenn das Signal nicht offensichtlich ist, wenn das Band direkt in den Überstand getränkt ist. </li></ol></li><li> Testen Sie verschiedene Muskelproben in dreifacher Ausfertigung. Hinweis: Hier haben wir getestet Thunfisch, Huhn, Siegel, 15 Arten von Walen und 5 Arten von Landsäugetieren. </li><li> Haben fünf unabhängige Inspektoren 8.3 für fünfmal wiederholen, das heißt, verwenden Sie 575 Streifen insgesamt. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

ein synthetisches Peptid zu Trägerprotein konjugiert unter Verwendung bemerkenswert effektiver im Vergleich zu sein verwandtes Protein. Für ein Sandwich-basierte Technik, weil der mAb unter Verwendung von Epitopen mit bekannten relativen Stellen entwickelt wird, die beiden mAbs in dieser Studie sind nicht geeignet, mit dem jeweils anderen Wechselwirkung mit dem Zielantigen-Epitop zu interferieren. Außerdem kann stärker als die Reaktivität zwischen dem nativen Protein sein , die Reaktivität zwischen dem nativen Protein u...

Historisch gesehen wurde Walfleisch in vielen Teilen der Welt konsumiert und dieser Verzehr setzt sich auch heute noch fort1. Aufgrund des trophischen Gehalts an Walen ist bekannt, dass ihr Fleisch einen hohen Gehalt an Quecksilber und anderen Giftstoffen aufweist2. Daher könnte der Verzehr von Walfleisch nicht nur für Hochrisikogruppen wie Schwangere, sondern auch für die Allgemeinbevölkerung zu einem gesundheitlichen Problem führen3. Darüber hinaus kann es auch während der Verarbeitung und Lagerung zu einer Kontamination von Walfleisch mit zoonotischen oder potenziell zoonotischen Erregern kommen4. Selbst für erfahrene Agenten ist es schwierig, Walfleisch allein anhand seines Aussehens zu identifizieren. Daher ist eine zuverlässige wissenschaftliche Identifizierungsmethode erforderlich, um Walfleisch von anderen Fleischsorten unterscheiden zu können. Dies würde dazu beitragen, den Verzehr von Walfleisch einzuschränken.
Derzeitige Methoden zur Speziesbestimmung umfassen molekulare Techniken und immunologische Methoden. Molekulare Techniken wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die DNA-Sequenzierung können verwendet werden, um Proben nicht nur von rohem Fleisch5 und zersetzten Proben6, sondern auch von verarbeiteten Lebensmitteln wie Kochwurst und Futtermitteln7,8 zu identifizieren. Immunologische Methoden, wie z. B. der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), werden in der Lebensmittelproduktion häufig eingesetzt, um den Fleischgehalt von z. B. Schweinefleisch9, Rindfleisch10 und Wels11 nachzuweisen. PCR-basierte DNA-Analysen zur Identifizierung von Walfleisch sind verfügbar12 und haben dazu beigetragen, den illegalen internationalen Handel mit Walfleisch in Japan, Südkorea, den Philippinen, Taiwan, Hongkong, Russland, Norwegen und den Vereinigten Staaten zu verhindern1. Diese Methoden sind effektiv und zuverlässig, aber sie können Stunden oder Tage in Anspruch nehmen und erfordern mühsame Schritte. Die Identifizierung von Walfleisch basiert in der Regel auf molekularen Techniken, und es gibt derzeit keine immunologische Methode. Für die Regulierungsbehörden ist es sehr wünschenswert, eine zuverlässige und schnelle Technik zu entwickeln, die vor Ort zur Identifizierung von Walfleisch eingesetzt werden kann. 
Immunchromatographische Streifen werden als Nachweiswerkzeuge verwendet, mit dem Vorteil, dass sie über ein einfaches Protokoll, das für den Einsatz im Feld geeignet ist, schnelle Ergebnisse liefern. Die Prinzipien des immunchromatographischen Streifens und des ELISA sind sehr ähnlich und umfassen Antikörper, Antigene und Markierungen. Viele verschiedene Markierungen wie kolloidales Gold, Kohlenstoff und Latex wurden bei der Entwicklung von immunchromatographischen Streifen verwendet. Gegenwärtig wird diese Methode häufig zum Nachweis von Antibiotika, Toxinen, Bakterien und Viren verwendet13, aber sie wird selten zur Identifizierung von Proteinen in Fleisch verwendet14,15. In dieser Arbeit schlagen wir einen Lateral-Flow-chromatographischen Enzymimmunoassay für den schnellen Nachweis von Walmyoglobin (Mb) vor.

<table><tbody><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>AMRESCO</td><td>J373</td><td></td></tr><tr><td>Protein G HP SpinTrap&nbsp;</td><td>GE&nbsp; Healthcare</td><td>28-9031-34</td><td>Spin-Säule mit Protein G Sepharose</td></tr><tr><td>IsoStrip Maus Monoklonaler Antikörper Isotypisierungskit</td><td>Roche</td><td>11493027001</td><td>Isotypisierungsstreifen, vorbeschichtet mit Subklassen- und Leichtketten-spezifischen Anti-Maus-Ig-Antikörpern</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3935</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulosemembran</td><td>Whatman</td><td>Z613630</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper Blocker-Lösung&nbsp;</td><td>LTK BioLaboratories</td><td></td><td>Zur Minimierung unspezifischer Bindungswechselwirkungen von unspezifischem IgG in den Proben</td></tr><tr><td>BCIP/NBT-Phosphatase-Substrat&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-81-00</td><td></td></tr><tr><td>Proteindetektor HRP Mikrotiterkit, Anti-Maus</td><td>KPL</td><td>54-62-18</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Immunplatte MaxiSorp ELISA-Platte</td><td>Thermo&nbsp; Fisher Scientific</td><td>EW-01928-08</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan EX ELISA Lesegerät&nbsp;</td><td>Thermo&nbsp; Elektron&nbsp; Corporation</td><td>51118170</td><td></td></tr><tr><td>Kolloid-Gold-Lösung (40 nm)</td><td>REGA Biotechnologie AG</td><td></td><td>40-50 nm ist geeignet für Immunstreifen</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Gibco</td><td>15561-020</td><td></td></tr><tr><td>Schnelltest immno-strip Drucker</td><td>REGA biotechnology Inc.</td><td>AGISMART RP-1000&nbsp;</td><td>Nur für die Produktion von Immunstreifen in kleinem Maßstab für Forschungs- und Entwicklungszwecke geeignet</td></tr><tr><td>Streifenkomponenten (NC-Membranen, Probenpads (#33 Glas, S& S), konjugierte Pads (#16S, S& S) und saugfähigen Einlagen (CF6, Whatman))</td><td>REGA biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freund' s adjuvans und unvollständiges Freund' s Adjuvans&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881, F5506</td><td>Zur Herstellung von Wasser-in-Öl-Emulsionen der Immunogene</td></tr><tr><td>Acrylamid, Gelpuffer, Ammoniumpersulfat (APS), Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>Protech</td><td></td><td>Gel Vorbereitung für SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Coomassie brillantblau R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610436</td><td>Proteinfärbung in SDS-PAGE Gelen</td></tr><tr><td>Laemmli Probenpuffer und &beta;-Mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737, 1610710</td><td>Proteinproben vor dem Laden auf SDS-PAGE Gele verdünnen</td></tr></tbody></table>

entwicklung eines kolloidales-gold-basierten immunchromatographischer teststreifen zum nachweis von cetacean myoglobin

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung eines kolloidalen immunchromatographischen Goldteststreifens auf der Grundlage des Sandwich-Formats, der zur Unterscheidung des Myoglobins (Mb) von Walen und Delfinen von dem von Robben und anderen Tieren verwendet werden kann. Der Streifen ermöglicht ein schnelles und sofortiges Screening auf Walfleisch und schränkt so den illegalen Handel und Verzehr ein. Es wurden zwei monoklonale Antikörper (mAbs) mit Reaktivität gegenüber dem Mb von Walen entwickelt. Die Aminosäuresequenzen von Mb-antigen-reaktiven Regionen aus verschiedenen Tieren wurden analysiert, um zwei synthetische Peptide (ein allgemeines Peptid und ein spezifisches Peptid) zu entwerfen und danach die mAbs (Unterklasse IgG1) zu erhöhen. Die mAbs wurden aus Hybridomen ausgewählt, die mittels indirektem ELISA, Western Blot und Dot Blot gescreent wurden. CGF5H9 war spezifisch für die Mbs von Kaninchen, Hunden, Schweinen, Kühen, Ziegen und Walen, während es eine schwache bis keine Affinität zu den Mbs von Hühnern, Thunfisch und Robben zeigte. CSF1H13 kann Robben und Wale mit starker Affinität binden, zeigte aber keine Affinität zu anderen Tieren. Walproben aus vier Familien (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae und Kogiidae) wurden in dieser Studie verwendet, und die Ergebnisse zeigten, dass diese beiden mAbs eine breite Bindungsfähigkeit an Mbs von verschiedenen Walen aufweisen. Diese mAbs wurden auf einen kolloidalen immunchromatographischen Goldteststreifen vom Sandwich-Typ aufgebracht. CGF5H9, das viele Spezies erkennt, wurde kolloidisiert mit Gold markiert und als Nachweisantikörper verwendet. CSF1H13, das auf der Testzone beschichtet war, wies das Vorhandensein von Walen und Robben Mbs nach. Muskelproben von Thunfisch, Huhn, Robben, fünf Arten von Landsäugetieren und 15 Arten von Walen wurden in dreifacher Ausfertigung untersucht. Alle Walproben zeigten positive Ergebnisse und alle anderen Proben zeigten negative Ergebnisse.

Monoklonaler Antikörper Merkmale Wir entwickelten zwei IgG - 1 - mAb (CGF5H9 und CSF1H13) die Anerkennung von zwei synthetischen Peptiden (MKASEDLKKHGNTVLC und AIIHVLHSRHPAEFGC) jeweils von cetacean Mb, und diese wurden verwendet , um ein Sandwich-Typ mit kolloidalem Gold immunochromatographic Teststreifen für die schnelle Detektion von Walen Mb zu konstruieren. 2 zeigt , dass CGF5H9 erkennt Walen und anderen Säugetieren als einzelne gefärbte Band...

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung von zwei monoklonalen Antikörpern (mAbs) der IgG-Klasse, die stark auf Myoglobin von Walen reagieren. Diese mAbs werden auf einen kolloidalen immunchromatographischen Goldteststreifen aufgebracht, der auf dem Sandwichformat basiert, um das Mb von Walen und Delfinen von Robben und anderen Tieren zu unterscheiden.

Entwicklung eines Kolloidales-Gold-basierten Immunchromatographischer Teststreifen zum Nachweis von Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

Das übergeordnete Ziel dieses immunochromatographischen Teststreifens mit kolloidalem Gold besteht darin, das Myoglobin von Cetaceen von dem von Robben und anderen Tieren zu unterscheiden. Diese Methode ermöglicht eine schnelle und vor-Ort-Untersuchung auf Cetaceenfleisch und trägt somit zur Eindämmung des illegalen Handels und Verbrauchs bei. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass ein erfolgreiches Ergebnis bereits fünf bis zehn Minuten nach der Homogenisierung von 0,3 Gramm Muskelgewebe direkt beobachtet werden kann, mit hervorragender Spezifität und Empfindlichkeit.Daher kann diese Methode einen schnellen Nachweis von Cetaceenfleisch im Feld ermöglichen. Sie kann auch auf anderes Fleisch wie Pferdefleisch oder Schweinefleisch angewendet werden. Um synthetische Peptide zur Erzeugung monoklonaler Antikörper mit Reaktivität gegenüber dem Myoglobin von Cetaceen zu entwerfen, werden die Aminosäuresequenzen antigenreaktiver Bereiche des Myoglobins aus verschiedenen Tieren analysiert.Holen Sie zunächst die Aminosäuresequenzen von Myoglobin aus Thunfisch, Huhn, Strauß, domestizierten Säugetieren, Robbe und 18 Arten von Cetaceen aus GenBank ab. Anschließend alignieren Sie die Sequenzen mithilfe der geeigneten Software. Starten Sie den Alignment Explorer, indem Sie im Startmenü die Option Align Edit/Build Alignment auswählen.Wählen Sie „Neue Ausrichtung erstellen“ und klicken Sie auf „OK“. Ein Dialogfeld erscheint mit der Frage, ob Sie eine Ausrichtung von DNA- oder Proteinsequenzen erstellen möchten. Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Bezeichnung „Protein“, wählen Sie „Daten öffnen – Sequenzen aus Datei abrufen“ und dann die Sequenzdatei aus. Wählen Sie den Menübefehl „Bearbeiten – Alles auswählen“, um alle Stellen jeder Sequenz im Datensatz zur Erstellung einer multiplen Sequenzalignierung auszuwählen.Wählen Sie im Hauptmenü die Option „Alignment“ und dann „Align by ClustalW“. Wählen Sie BLOSUM als Protein-Gewichtungsmatrix und klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche „OK“. Der dritte Schritt besteht darin, die Sequenzalignierung zu analysieren.Konzentrieren Sie sich auf fünf antigenreaktive Stellen und finden Sie das Fragment, das bei Cetaceen konserviert ist. Ein Sternsymbol steht im Alignement für Konsens und zeigt eine Position an, die einen einzelnen, vollständig konservierten Rest aufweist. Es wurden zwei konservierte Fragmente bei Cetaceen gefunden.Kandidaten-Sequenzfragmente werden anschließend synthetisiert und zur Herstellung monoklonaler Antikörper verwendet. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie den optimalen pH-Wert für die kolloidale Goldlösung bestimmen, definiert als der minimale pH-Wert, bei dem das Gemisch aus monoklonalem Antikörper und kolloidaler Goldlösung zwei Stunden lang rot bleibt. Geben Sie 0,15 Mikrogramm gereinigten detektierenden monoklonalen Antikörper zu 100 Mikrolitern kolloidaler Goldlösung mit pH-Werten im Bereich von fünf bis neun.Für die Zwecke dieser Demonstration werden pH 6 und pH 8 getestet. pH 8 galt nach diesem Optimierungsschritt als der optimale pH-Wert. Als Nächstes bestimmen Sie die optimale Konzentration des monoklonalen Antikörpers, indem Sie verschiedene Mengen des gereinigten detektierenden monoklonalen Antikörpers zu 100 Mikrolitern kolloidaler Goldlösung bei pH 8 hinzufügen.Die optimale Konzentration, die in dieser Studie sechs Mikrogramm pro Milliliter beträgt, bewahrt die rote Farbe des Gemischs ohne schwarzen Niederschlag. Basierend auf den Ergebnissen der Optimierungsschritte werden 60 Mikrogramm gereinigter detektierender monoklonaler Antikörper tropfenweise zu 10 mL kolloidaler Goldlösung gegeben. Das Gemisch wird zehn Minuten lang vorsichtig bei Raumtemperatur emulgiert.Geben Sie zwei Milliliter einer 5 %igen BSA-Lösung in PBS zu der Mischung hinzu und emulgieren Sie vorsichtig 15 Minuten bei Raumtemperatur, um Hintergrundinterferenzen zu reduzieren. Zentrifugieren Sie die Mischung 30 Minuten bei 10.000 × g und vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand mit dem nicht konjugierten Antikörper und suspendieren Sie das resultierende Pellet in 4 mL PBS-T, das 1 % BSA und 0,1 % Tween-20 enthält.Wiederholen Sie die Zentrifugation und Suspension ein- oder zweimal. Suspendieren Sie die endgültigen Präzipitate in 1 mL PBS-T und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Eine Grafik des Immundetektionsstreifendesigns ist hier dargestellt.Die Abmessungen des Kartons, der Pads und der Nitrocellulosemembran sind im Protokolltext aufgeführt. Um die Haltbarkeit zu verlängern, sollten die Immuno-Streifen in einer Umgebung mit niedriger Luftfeuchtigkeit hergestellt und zusammengesetzt werden. Geben Sie mit einer Mikropipette die kolloidales Gold-markierte monoklonale Antikörperlösung auf das Konjugatpad, um es zu sättigen, und trocknen Sie das Pad anschließend eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie es zusammenbauen.Nachdem das Konjugatpad trocken ist, verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um zunächst die Nitrocellulosemembran auf den Karton zu kleben. Verteilen Sie mit einem Immunstrip-Drucker den spezifischen, antigenerkennenden monoklonalen Antikörper und das schnelle Anti-Maus-IgG jeweils auf der Testzone und der Kontrollzone der Nitrocellulosemembran. Halten Sie einen Abstand von mehr als fünf Millimetern zwischen den beiden Zonen ein.Bringen Sie dann das Konjugatpad auf einer Seite der Nitrocellulosemembran und das Absorptionspad auf der anderen Seite an, wobei die Pads auf jeder Seite um etwa zwei Millimeter überlappen. Legen Sie das Probepad um zwei Millimeter über das Konjugatpad und kleben Sie es auf den Karton. Verwenden Sie einen Papiercutter, um Streifen mit einer Breite von sechs Millimetern herzustellen.Verpacken Sie die Streifen in einer Aluminiumfolientasche mit Trockenmittel und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius bis zur Verwendung. Um eine Probe für den Kreuzreaktivitätstest vorzubereiten, geben Sie 1 mL PBS mit 0,1 % BSA zu 0,03 Gramm rohem Muskelgewebe hinzu. Und homogenisieren Sie die Probe mit einem Bambusstäbchen oder einem Mörserstab.Halten Sie den Immunstreifen am Ende gegenüber dem Testbereich fest und tauchen Sie den Probepad-Teil fünf bis zehn Minuten lang in die Probe ein. Beobachten Sie das Ergebnis direkt. Testen Sie verschiedene Muskelproben im Dreifachansatz.Die T-Testlinie ist so konzipiert, dass sie ein positives Signal anzeigt, wenn beide monoklonalen Antikörper Cetaceen-Myoglobin nachweisen. Da das Myoglobin von nicht zu den Cetaceen gehörenden Tieren nur von einem der beiden monoklonalen Antikörper erkannt werden kann, zeigt die Testlinie ein negatives Ergebnis an, wenn Muskelproben von anderen Tierarten getestet werden. Die C-Kontrolllinie sollte stets ein positives Ergebnis anzeigen, da schnelles Anti-Maus-IGG den mit kolloidalem Gold markierten Detektionsantikörper bindet.Ein fehlgeschlagenes Ergebnis in der Kontrolllinie weist darauf hin, dass die Qualität der Materialien auf dem Teststreifen schlecht ist. Die Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Hybridom-Überständen zeigt, dass der monoklonale Antikörper CGF5H9 Wale und andere Säugetiere als einzelnes gefärbtes Band bei einem vorhergesagten molekularen Gewicht von etwa 17 kDa nachweist. Bei dem Gemeinen Zwergwal zeigt sich ein vergleichsweise schwächeres Band als bei anderen Walen. Für Thunfisch, Robbe und Huhn sind keine Banden vorhanden. Dagegen wird für Schwein ein Band bei etwa 50 kDa beobachtet. Identische Ergebnisse werden durch die Punktblutanalyse erhalten.Obwohl die Western-Blot-Analyse unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers CSF1H13 mehrere unspezifische Banden für Schwein und Thunfisch zeigt, ist CSF1H13 aufgrund seiner Reaktion ausschließlich mit Cetaceen hochspezifisch. Robben weisen eine Bande bei einem vorhergesagten molekularen Gewicht von etwa 17 kDa auf. Identische Ergebnisse werden durch die Dot-Blot-Analyse von Blut erzielt.Ergebnisse aus indirekten ELISA-Tests von Muskel-Extrakten verschiedener Arten unter Verwendung des gereinigten CGF5H9 zeigen positive Signale für Rind, Ziege, Hund, Kaninchen und Cetaceen, ein schwaches positives Signal für Schwein sowie negative Signale für Thunfisch, Huhn und Robbe. CSF1H13 zeigt eine hohe Affinität zu Cetaceen und Robben. Beide monoklonalen Antikörper können stark mit allen vier Cetaceen-Arten reagieren, die verschiedenen Familien angehören, was auf ihre breite Reaktivität gegenüber unterschiedlichen Cetaceen-Arten hinweist.Die Spezifität des immunologischen kolloidalen Goldstreifens wird durch diese repräsentativen Ergebnisse gezeigt. Bei Verwendung von Nicht-Wal-Muskelproben erscheint nur ein einzelnes Band an der Kontrolllinie. Wenn hingegen Wal-Muskelproben verwendet werden, sind die Signale an sowohl der Testlinie als auch der Kontrolllinie vorhanden.Wenn man die Herstellung markierter Antikörper und den Aufbau dieser Streifen einmal beherrscht, kann dies innerhalb von vier Stunden erfolgen, sofern es ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sorgfältig auf die Gestaltung des Peptids zu achten. Wenden Sie mehrere Methoden zur Auswahl geeigneter monoklonaler Antikörper an.Und verwenden Sie eine hochwertige kolloidale Goldlösung zur Herstellung markierter Antikörper. Nach Durchführung dieser Verfahren können weitere Methoden wie PCR-basierte DNA-Analysen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Art des Cetaceen und zu dessen Herkunft. Der monoklonale Antikörper CSF1H13, der stark ist und eine Affinität ausschließlich zu Meeressäugern aufweist, kann in verschiedenen ELISA-Formaten eingesetzt werden, die zahlreiche weitere Möglichkeiten zur Untersuchung der biologischen, physiologischen und chemischen Aspekte von Myoglobin bei Meeressäugern bieten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man spezifische monoklonale Antikörper entwickelt und sie anschließend auf einem Schnellteststreifen anwendet.

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Forschung

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Biologie

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Entwicklung eines Lateral Flow Immunochromatographic Strip für den schnellen und quantitativen Nachweis niedermolekularer Verbindungen

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Zellfreier Dot-Blot als praktische und anpassungsfähige Immunoassay-Plattform zum Nachweis der Antikörperantwort in humanen und tierischen Seren

Erfahren Sie die Entwicklung eines kolloidalen Gold-Immunchromatographie-Teststreifens zur Unterscheidung von Cetacean-Myoglobin von anderen Tieren. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Vor-Ort-Überprüfung von Wal- und Delfinfleisch mit hoher Spezifität.

Entwicklung eines Kolloidales-Gold-basierten Immunchromatographischer Teststreifen zum Nachweis von Cetacean Myoglobin

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