Isolierung, Fixierung und Charakterisierung von juvenilen Leukozyten der Goldbrassenkopfniere mittels Durchflusszytometrie

Dieses Protokoll standardisiert die Isolierung, Fixierung und Viabilitätsbewertung von Leukozyten aus der Kopfniere von Dorade mittels Durchflusszytometrie und ermöglicht so eine Hochdurchsatz-Probenverarbeitung ohne Qualitätseinbußen.

Traditionelle Techniken wie die manuelle Zellzählung mit Neubauer-Kammern und gefärbte Blutausstriche sind in der Fischimmunologie üblich. Die Durchflusszytometrie wird immer beliebter, aber ihre Anwendung in Fischstudien ist nach wie vor begrenzt. Traditionelle Methoden der Fischimmunologie sind leberintensiv und fehleranfällig. Studien an jungen Tieren sind durch die Herausforderungen bei der Gewinnung reiner Leukozyten und die Notwendigkeit einer sofortigen Viabilitätsbewertung eingeschränkt, was den Probendurchsatz einschränkt.

Dieses Protokoll ermöglicht eine detaillierte Analyse von Immunzellen, indem es wichtige Leukozytenpopulationen identifiziert und lebende von toten Zellen unterscheidet. Die Fixierung erhält die Lebensfähigkeit für einen Monat und ermöglicht skalierbare, flexible und effiziente Arbeitsabläufe in der Durchflusszytometrie.

Unsere Ergebnisse bringen die Immunologie von Fischen voran, indem sie Immunmechanismen und Umwelteinflüsse auf die Lebensfähigkeit von Zellen aufdecken und die Entwicklung verbesserter Krankheitsmanagementstrategien in Aquakulturen unterstützen.

[Erzähler] Akklimatisieren Sie zunächst die junge Dorade, Sparus aurata, in rezirkulierenden Aquakultursystemen, in denen das Wasser kontinuierlich gefiltert und umgewälzt wird, um eine stabile Umgebung zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass das System mechanische und biologische Filtration, Belüftung und Temperaturregelung umfasst, um optimale abiotische Parameter aufrechtzuerhalten. Passen Sie Umgebungsfaktoren wie Photoperiode, Temperatur, Salzgehalt, pH-Wert und Gehalt an gelöstem Sauerstoff an die spezifischen Anforderungen der Studie an. Verwenden Sie ein Netz, um junge Doradenfische vorsichtig in einen mit Aquarienwasser gefüllten Auffangbehälter zu bringen. Nachdem Sie den Fisch eingeschläfert haben, legen Sie einen Fisch auf die Seite auf ein steriles Seziertablett. Machen Sie mit einem Skalpell einen vorsichtigen Schnitt entlang der ventralen Mittellinie des Fisches von der Öffnung zu den Kiemen. Verwenden Sie eine Präparierschere, um den Schnitt zu verlängern und die inneren Organe freizulegen. Lokalisieren Sie die Kopfniere, die sich direkt hinter den Kiemen in der Nähe des vorderen dorsalen Bereichs der Körperhöhle befindet und sich entlang der Oberseite unterhalb der Wirbelsäule erstreckt. Entfernen Sie mit einer Pinzette und einer Schere mit feiner Spitze vorsichtig das umgebende Gewebe, um die Kopfniere besser sichtbar zu machen. Heben Sie dann die Kopfniere an und machen Sie präzise Schnitte um sie herum, um sie vom umgebenden Gewebe zu befreien. Legen Sie die herausgeschnittene Kopfniere sofort in ein Zellsieb, das sich in einer sterilen Petrischale befindet. Pipettieren Sie zwei Milliliter Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) in einer sterilen Petrischale. Mazerieren Sie die herausgeschnittene Kopfniere auf dem Zellsieb mit dem Kolben einer Spritze, um die Zellen in die Lösung freizusetzen. Bereiten Sie als Nächstes eine Lösung mit Dichtegradientenmedium vor. Pipettieren Sie 600 Mikroliter der Dichtegradienten-Medium-Lösung in Fünf-Milliliter-Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden. Übertragen Sie langsam zwei Milliliter Zellsuspension aus der Petrischale in jedes Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 400 g für 45 Minuten bei vier Grad Celsius bei ausgeschalteter Bremse. Entfernen Sie nach der Zentrifugation das Röhrchen und beobachten Sie den Leukozytenring. Verwenden Sie dann eine sterile Pasteurpipette, um etwa 100 Mikroliter des Leukozytenrings vorsichtig in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Füllen Sie nun das Volumen mit HBSS auf zwei Milliliter auf und resuspendieren Sie die Zellen sanft. Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet am Boden des Röhrchens zu stören. Dann resuspendieren Sie das gereinigte Pellet in einem Milliliter HBSS, bis die endgültige Zellkonzentration zwischen 10.000 und einer Million Zellen pro Milliliter liegt. Geben Sie 50 Mikroliter Dimethylsulfoxid in eine Durchstechflasche, die den Reaktivfarbstoff enthält. Nachdem Sie die Zelldichte auf eine Million Zellen pro Milliliter eingestellt haben, wird ein Milliliter der Zellsuspension in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Bereiten Sie Viabilitätskontrollproben wie angegeben vor. Induzieren Sie den Zelltod in den Röhrchen drei und vier, indem Sie sie sieben Minuten lang in ein Wasserbad bei 70 Grad Celsius legen. Um die Zellen zu färben, pipettieren Sie einen Mikroliter des rekonstituierten Fluoreszenzfarbstoffs in die Röhrchen zwei und vier mit einem Milliliter Zellsuspension und mischen Sie es gut. Inkubieren Sie die gebeizten Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt. Waschen Sie anschließend die Zellen zweimal mit einem Milliliter HBSS und resuspendieren Sie das endgültige Pellet in 900 Mikrolitern desselben Puffers. Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter 37 % Formaldehyd, um die Zellen zu fixieren, und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter HBSS mit 1 % BSA gewaschen haben, resuspendieren Sie es in einem Milliliter derselben Lösung. Lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius im Kühlschrank bis zu einem Monat. Platzieren Sie das feste Probenröhrchen zur Analyse in den Probenanschluss des Durchflusszytometers. Zeichnen Sie mindestens 10.000 Ereignisse für jede Probe innerhalb des Singlelets-Gates auf. Speichern Sie alle Daten und sichern Sie sie auf externen Laufwerken oder Cloud-Speichern. Visualisieren Sie die Durchflusszytometriedaten, indem Sie die Vorwärtsstreufläche im Vergleich zur Seitenstreufläche darstellen, um die Zellgröße und Granularität zu beurteilen. Führen Sie das Gating von Singulettzellen durch und schließen Sie Multipletts aus, indem Sie den Streubereich nach vorne und die Streuhöhe nach vorne zeichnen. Identifizieren Sie die drei Leukozytenpopulationen anhand von Vorwärts- und Seitenstreuprofilen. Legen Sie den Schwellenwert für die Viabilitätsfärbung des Farbstoffs im entsprechenden Fluoreszenzkanal fest, um lebende und tote Zellen zu unterscheiden. Unter optimalen Bedingungen machten Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten 31 %, 38 % bzw. 31 % der Leukozytenpopulation aus, während die Lymphozyten unter thermischem Stress auf 21,3 %, die Monozyten auf 45,6 % und die Granulozyten stabil bei 33,1 % blieben. Die Probe, die optimalen Bedingungen ausgesetzt wurde, zeigte eine höhere Lebensfähigkeit, mit einer Dominanz lebender Zellen in allen Leukozytenpopulationen. Im Gegensatz dazu zeigte die thermisch belastete Probe einen signifikanten Anstieg des Zelltods.