Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gebärmutter zur Analyse mittels Durchflusszytometrie

Unsere Methode ermöglicht die Beurteilung der Zusammensetzung und funktionellen Eigenschaften verschiedener Lymphozyten-Subpopulationen, die im Gebärmuttergewebe von trächtigen und nicht trächtigen Tieren vorhanden sind. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung von Uteruslymphozyten unter Beibehaltung der Oberflächenexpression von Protein, Zelllebensfähigkeit und Funktionalität. Daher eignet es sich für eine Reihe von nachfolgenden Anwendungen.

Die Entfernung des Fötus zu Beginn des Experiments und die Leukozytenentnahme sind technisch anspruchsvolle Schritte. Da es sich um ein langwieriges Experiment handelt, sind besondere Aufmerksamkeit und Konzentration erforderlich, sobald Sie die Schritte zur Antikörperfärbung erreicht haben. Übertragen Sie zunächst das Gebärmuttergewebe, das von einer schwangeren C57 Black Six Female Mouse entnommen wurde, in eine sterile Petrischale und entfernen Sie dann mit sterilen Instrumenten vorsichtig das das Gewebe umgebende Fett und achten Sie darauf, das Gewebe nicht trocknen zu lassen.

Entfernen Sie die Föten, indem Sie jede Implantationsstelle mit sterilen Instrumenten sezieren, und bringen Sie die Gebärmutter dann zu ihrem ursprünglichen Fünf-Milliliter-Sammelröhrchen zurück, das einen Milliliter Sammelmedium enthält. Zerkleinern Sie das Gewebe mit einer Schere im Auffangröhrchen und legen Sie das Röhrchen dann in ein 37 Grad celsius warmes Wasserbad. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter vorgewärmte enzymatische Verdauungsmischung in die Röhre hinzu.

Inkubieren Sie die Tube für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius mit Rühren, um die enzymatische Verdauungsaktivität zu verbessern. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, wirbeln Sie die Röhre und halten Sie sie auf Eis, um die enzymatische Aktivität zu hemmen, und übertragen Sie dann das Verdauungsgewebe in ein ordnungsgemäß markiertes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie das Fünf-Milliliter-Auffangröhrchen mit insgesamt 10 Milliliter eiskalter fünf Millimolarer EDTA PBS-Lösung ab, um das gesamte verbleibende Gewebe zu sammeln und in das 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu übertragen.

Zentrifugieren Sie die verdaute Gewebeprobe für 10 Minuten bei 400 mal G.Verwerfen Sie den Überstand, streichen Sie vorsichtig das Pellet und resuspenieren Sie dann in 10 Milliliter vorgewärmter fünf Millimol-EDTA-PBS-Lösung. Um die Zellverklumpung zu reduzieren, inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius unter Rühren, gefolgt von einem Wirbel auf Hoher für 10 Sekunden. Um Zellklumpen in unassoziiertem Gewebe zu entfernen, legen Sie ein 70-Mikrometer-Sieb auf ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und drücken Sie dann mit dem Kolben einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze das verdaute Gewebe durch das Sieb in das Röhrchen.

Waschen Sie das Sieb mehrmals mit insgesamt 10 Milliliter kaltem PBS, um alle Zellen zu sammeln, und geben Sie dann das 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen für 10 Minuten bei 400 mal G aus.Nach dem Verwerfen des Überstands können die angeborenen lymphatischen Zellen entweder mit Option A oder Option B isoliert werden.Für Option A resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern 80% isotonisch pro Anruf mit einer Pipettenvoy. Dann mit der Pipette voy bei langsamer Geschwindigkeit vorsichtig acht Milliliter, 40% pro Call-Lösung, auf das resuspendierte Pellet in einem 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen legen. Langsam und kontinuierlich pipettieren und die 15 Milliliter bis zu einem Winkel von etwa 45 Grad halten.

Ohne die Überlagerung zu stören, zentrifugieren Sie das Rohr für 20 Minuten bei 850 mal G mit mittlerer Beschleunigung und minimalen Pausen bei Raumtemperatur. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge, ohne die Pro-Call-Schichten zu stören. Als nächstes, ohne den Ring der Leukozyten an der Schnittstelle der beiden Pro-Call-Lösungen zu stören, verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette, um alle außer 0,5 bis einem Milliliter der oberen Pro-Call-Schicht zu verwerfen.

Während Sie versuchen, die Menge der pro Call-Lösung, die in die Pipette gesaugt wird, auf ein Minimum zu reduzieren, sammeln Sie vorsichtig den Ring der Leukozyten und übertragen Sie die Zellen in ein neu markiertes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie den Zellen 10 Milliliter steriles RPMI-Medium hinzu, ergänzt mit 10% Hitze und aktiviertem FBS, und zentrifugieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei 500 mal G und vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand und fahren Sie mit der Lyse der roten Blutkörperchen fort.

Um die Zellen mit Option B zu isolieren, nachdem das verdaute Gewebe durch das Zellsieb geleitet und das Ergebnis in Zellsuspension zentrifugiert wurde, wie zuvor gezeigt, das Pellet mit acht Millilitern 35% isotonisch pro Aufruf und RPMI-Medium resuspendieren und die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 940 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit mittlerer Beschleunigung und minimalen Pausen. Dann mit einem Sauger oder Pipettenvoy den Überstand vorsichtig absaugen, bevor Sie das Pellet in 14 Milliliter RPMI-Medium wiederverwenden, ergänzt mit 10% Hitze und aktiviertem FBS.

Zentrifugieren Sie die Probe erneut für fünf Minuten bei 500 mal G und vier Grad Celsius, verwerfen Sie dann den Überstand durch Aspiration und fahren Sie mit der Lyse der roten Blutkörperchen fort. Um die roten Blutkörperchen zu lysieren, resuspendieren Sie die Probe in drei Milliliter einer X-Erythrozyten-Lysing-Lösung und inkubieren Sie für drei Minuten bei Raumtemperatur, dann fügen Sie 10 Milliliter PBS in die Probe, um die Reaktion zu stoppen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 mal G für fünf Minuten, nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie weitere 10 Milliliter PBS hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation.

Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter RPMI-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, und leiten Sie dann die In-Zell-Suspension durch ein steriles 70-Mikrometer-Zellsieb. Nach dem Zählen der Zellen stellen Sie die Konzentration der Zellsuspension auf eine bis 2 Millionen Zellen in 100 Mikroliter PBS ein und fahren mit der Färbung und Facs-Analyse fort. Uteringruppe eins ILCs umfassen konventionelle NK-Zellen, geweberesidente NK-Zellen und ILCs der Gruppe eins, deren Prozentsätze während des Lebens und der Schwangerschaft variieren.

Diese Untergruppen können mit Hilfe der Durchflusszytometrie unterschieden werden, indem zellen zuerst auf ihre Fähigkeit, Licht zu streuen, giert werden, dann einzelne kaufbare CD 45 positive CD drei negative CD 19 negative Zellen isoliert werden und dann ILCs der Gruppe eins identifiziert werden, die NK 1,1 und NKP 46 positiv sind. Innerhalb der ILCs der Gruppe eins sind CD49A-negative EMs, die positiv sind, konventionelle NK-Zellen. CD49A-positive Ems-positive Zellen sind geweberesidente NK-Zellen.

Und CD49-positive Ems-negative Zellen sind Uterin-ILCs der Gruppe eins. Die Färbung von Milz- und Uteruslymphozyten mit Anti-NK-P46- und Anti-NK-1.1-Antikörpern zeigt, dass die Milzlymphozyten auf ihrer Oberfläche höhere Mengen an NKP 46 exprimieren als ihr Uterus-Gegenstück. Bei der enzymatischen Gewebedissoziation können Oberflächenepitope in Abhängigkeit von den im Verdauungsmedium verwendeten Enzymen verändert werden.

Zum Beispiel ist die Färbung für den MHC CD49 NKG2A-Rezeptor schlecht, wenn Liberase TM verwendet wird. Die Verdauung mit Liberase DH bewahrt jedoch die NKG2A-Erkennung durch den 1611-Antikörper-Klon. Etwa 6,5% der ILCs der Gruppe eins, die am Schwangerschaftstag 8,5 in Gebärmuttergewebeproben vorhanden sind, stammen aus Blut.

Blutverunreinigungen können durch intravitale Färbung mit Anti-CD45-Antikörpern, die mit einem Fluorochrom konjugiert sind, ausgeschlossen werden. Bei der Einrichtung von Zeitbesprechungen müssen Sie berücksichtigen, dass Mäuse nachtaktiv sind. Daher sollten sie so spät wie möglich am Nachmittag aufgestellt werden, da die Paarung in der Nacht stattfindet.

Auch bei der Auswahl von Weibchen müssen Sie sicherstellen, dass sie kein Vaginalseptum haben. Wir führen typischerweise durchflusszytometrische Analysen durch, um viele Proteine an der Außenseite der Zellen und innerhalb der Zellen zu betrachten. Wir führen auch Nukleinsäureextraktion durch, um die Genexpression zu untersuchen, einschließlich der RNA-Sequenzierung.

Und wir schaffen es auch, funktionelle Assays zu umrunden, um die Reaktionen von angeborenen lymphatischen Zellen der Gebärmutter zu untersuchen.