Experimentelle Screening-Protokolle, Immunzytochemie und mikroskopiebasierte Bildgebungsverfahren für Penium margaritaceum

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Rolle der Zellwand bei der Aufrechterhaltung der Zellform und der Reaktion auf äußeren Stress. Wir verwenden eine Reihe von lichtmikroskopischen und konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie-Techniken zur Abbildung der Zellwandstruktur in lebenden Zellen und Elektronenmikroskopie zur hochauflösenden Abbildung von Zellwänden.

Der derzeitige Mangel an transformierten Zelllinien für Streptophytenalgen, die spezifische subzelluläre Proteine exprimieren, um die Zellwanddynamik hervorzuheben, fehlt. Dazu müssen dann Antikörper und andere Fluoreszenzsonden für die Untersuchung verwendet werden. Die Zellwand von Penium reagiert auf verschiedene Formen von abiotischem und biotischem Stress, was zu einer phänotypischen Plastizität führt. Wir haben festgestellt, dass Zellwandpektine ein wichtiger Teil dieses Prozesses sind. Der einzellige Phänotyp und die Möglichkeit, die Markierung lebender Zellen mit Penium durchzuführen, bieten Pflanzenbiologen die Möglichkeit, sich mit der Struktur und Entwicklung der Zellwand zu befassen.

[Dozent] Entnehmen Sie zunächst fünf Milliliter aktiv wachsender flüssiger Zellkulturen von Penium margaritaceum. In ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff umfüllen, dann zentrifugieren. Nach dem Ausgießen des Überstands das Pellet in fünf Millilitern frischem WHM resuspendieren. Befestigen Sie den Röhrchendeckel fest und schütteln Sie das Röhrchen 10 Sekunden lang kräftig, um das Pellet wieder zu resuspendieren und extrazelluläre polymere Substanzen von der Zellwandoberfläche zu entfernen. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem WHM und überführen Sie dann 200 Mikroliter-Aliquots der Zellsuspension in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Deckelröhrchen in der Mikrozentrifuge bei 1000 g für eine Minute, saugen Sie dann den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in 400 Mikrolitern frischem WHM. Geben Sie anschließend 20 Mikroliter verdünnten monoklonalen Antikörper in die Zellsuspension und die Vertiefung des Vortexs. Wickeln Sie das Röhrchen dann in Alufolie ein und inkubieren Sie es 90 Minuten lang auf einem Laborrotator. Zentrifugieren Sie die Suspension, saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern frischem WHM, bevor Sie es 10 Sekunden lang vortexen. Nach der abschließenden Zentrifugation resuspendieren Sie das Pellet in 400 Mikrolitern WHM und fügen Sie acht Mikroliter Ziegen-Anti-Ratten-TRITC oder FITC hinzu. Zum Schluss resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Wachstumsmedium. Verschließen Sie die Tube und wickeln Sie sie in Aluminiumfolie ein, bis sie für die Bildgebung bereit ist. Verdünnen Sie die mit JIM5-Antikörpern markierten Zellen in WHM um das Zehnfache. Geben Sie einen 50-Mikroliter-Tropfen der verdünnten Zellsuspension auf einen Deckglas. Inkubieren Sie die Zellen zwei Minuten lang im Dunkeln, um die Zelladhärenz zu ermöglichen, und pipettieren Sie dann vorsichtig einen Milliliter WHM tropfenweise, um nicht anhaftende Zellen wegzuspülen. Geben Sie 30 Mikroliter WHM auf die angehängten Zellen. Überziehen Sie das Tröpfchen mit 30 Mikrolitern warmer 4%iger Agarose in BGM und lassen Sie es festigen. Für Proben in einer Petrischale fügen Sie so viel WHM hinzu, dass die in Agarose eingebetteten Zellen vollständig bedeckt sind. Bei Zellen auf einem Deckglas drehen Sie den Deckglas um und legen Sie ihn vorsichtig über einen mit WHM gefüllten Vertiefungsobjektträger. Montieren Sie die vorbereiteten Zellen auf ein Fluoreszenzmikroskop. Stellen Sie eine externe Lampe auf oder nutzen Sie die eingebaute Beleuchtung des Mikroskops, um das Zellwachstum und die Zellbewegung zu unterstützen. Nehmen Sie alle 10 bis 30 Minuten Bilder mit dem TRITC-Filtersatz auf, um die Zellwandausdehnung zu verfolgen. Bereiten Sie ein Röhrchen mit fünf Millilitern gewaschener 10 bis 14 Tage alter Zellkulturen vor. Geben Sie als Nächstes etwa 100 Mikroliter 0,75 Mikrometer fluoreszierende Kügelchen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie einen Milliliter WHM in das Röhrchen und schütteln Sie es kräftig, um die Kügelchen wieder zu suspendieren. Zentrifugieren Sie das Röhrchen drei Minuten lang bei 10.000 g. Das fertige Pellet in 500 Mikrolitern WHM resuspendieren. Pipettieren Sie anschließend einen Milliliter WHM-Medium in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte. Fügen Sie Inhibitoren oder Wachstumsregulatoren hinzu, um die gewünschte Konzentration zu erreichen, und schwenken Sie die Platte vorsichtig. Fügen Sie 10 Mikroliter der Bead-Lösung hinzu und schwenken Sie sie erneut vorsichtig, um zu mischen, und geben Sie dann vor dem Mischen 10 Mikroliter gewaschene Zellen in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang im Licht. Stellen Sie die Platte, ohne sie zu beschädigen, auf ein inverses Fluoreszenzmikroskop, das mit einem FITC-Filter ausgestattet ist. Pipettieren Sie einen Milliliter einer Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aus. Zentrifugieren Sie das Röhrchen eine Minute lang bei 4.000 g. Nach dem Entsorgen des Überstands das Rohr mit dem Pellet in flüssigen Stickstoff tauchen oder bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Suspendieren Sie das aufgetaute Pellet in 20 Mikrolitern WHM. Geben Sie einen Tropfen der dichten Zellsuspension auf einen Deckglas mit den Maßen 45 x 50 Millimeter. Lege einen zweiten Deckzettel auf den Tropfen, um ein Sandwich zu machen. Drücken Sie das Sandwich 30 Sekunden lang kontinuierlich nach unten, um die Zellen aufzubrechen. Trennen Sie die Deckgläser vorsichtig. Geben Sie WHM über die Deckgläser, um die geplatzten Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und eine Zentrifuge zu waschen. Untersuchen Sie das weiße oder leicht grüne Pellet, nachdem Sie den Überstand entsorgt haben. Suspendieren Sie das Pellet mit den Zellwänden in entionisiertem Wasser. Nach dem Zellbruch und der Zentrifugation wird das Pellet in 100 Mikrolitern entionisiertem Wasser resuspendiert, bevor es in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt wird. Befestigen Sie als Nächstes Kohleband an der Oberfläche eines Cambridge-Stummels. Pipettieren Sie fünf Mikroliter der resuspendierten Zellwandsuspension auf das Carbonband. Verwenden Sie ein Palladiumtarget, um den Stummel 50 Sekunden lang zu sputtern, nachdem Sie ihn über Nacht trocknen gelassen haben. Beobachten Sie die Zellen bei fünf Kilovolt, mit einer geeigneten Punktgröße, die 10 Zentimeter vom Sekundärelektronendetektor entfernt positioniert ist. Die Markierung der Zellwand von P. margaritaceum mit monoklonalen Anti-Pektin-Antikörpern zeigte ein Netzwerk von Calciumkomplexfasern, die ein unregelmäßiges Gittermuster bilden. Das Pektin lagerte sich im Zellzentrum oder Isthmus ab und drückte älteres Pektin in Richtung der Pole. Die JIM7-Markierung zeigte, dass hochgradig methylverestertes Pektin zunächst in einer schmalen Bande am Isthmus sezerniert wurde. Andere Polymere in der Zellwand, wie z. B. das Arabinogalactan-Protein, wurden mit dem monoklonalen Antikörper JIM13 nachgewiesen. Große Mengen extrazellulärer polymerer Substanzen wurden außerhalb der Zellwand sezerniert, was das Gleiten und die Zellaggregation ermöglichte. Markierungstechniken ermöglichten quantitative Zellwand- und Expansionsstudien unter Einbeziehung entwicklungsbezogener Bildgebungsansätze. Korrelative Strukturstudien zeigten, dass das typische Pektingitter aus einem Netz von Fasern bestand, die nach außen in deutlichen Vorsprüngen endeten. Die Behandlung mit hohen Konzentrationen von Kalzium verwandelte das Pektingitter in unregelmäßige Ablagerungen, wie sie in JIM5-markierten Zellen beobachtet wurden. Bei der Untersuchung von mit Kalzium behandelten Zellwänden unter Rasterelektronenmikroskopie konnte die ungeordnete Pektinstruktur im Detail beobachtet werden.