Amplikon-Sequenzierung mit den Long-Read-Sequenzierungstechnologien

Ich untersuche, ob tragbare Long-Read-Sequenzierung TB-resistente Anfälligkeitsergebnisse in ressourcenbegrenzten Umgebungen liefern kann, mit einer Genauigkeit, die mit der Goldstandard-Methode vergleichbar ist, und so zugängliche, hochwertige Tuberkulosediagnostik voranbringt. Einsatz gezielter Next-Generation-Sequenzierung als diagnostisches Werkzeug für medikamentenresistente Tuberkulose, indem ein umfassendes Resistenzprofil direkt aus klinischer Probe ohne bioinformatische Erfahrung angeboten wird. Unser Protokoll mit Long-Read Sequencing hat das Potenzial, schnellere Bearbeitungszeiten zu bieten, einen einfacheren Arbeitsablauf als die Echtzeit-Resistenzerkennung zu ermöglichen, umfassende TB-Diagnostik zu ermöglichen und die Ausbruchsverfolgung in ressourcenbegrenzten Umgebungen mit minimaler Infrastruktur zu verbessern.

Zu Beginn berechnen Sie 100 Nanogramm jeder Ampliconprobe basierend auf der Konzentration und übergeben Sie das erforderliche Volumen in ein sauberes PCR-Rohr. Um die Gesamtmasse der Ampliconen in der Probe zu bestimmen, verwenden Sie die gegebene Formel. Stellen Sie das Gesamtvolumen jeder Probe mit nukleasefreiem Wasser auf 12,5 Mikroliter an.

Mischen Sie die Proben vorsichtig, indem Sie zehnmal auf und ab pipettieren und sie kurz in einer Mikrozentrifuge drehen. Als Nächstes fügen Sie jeder Probe 1,75 Mikroliter Endreparatur- und Adenylierungsreaktionspuffer hinzu, gefolgt von 0,75 Mikrolitern Endreparatur- und Adenylierungsenzymmischung. Nach dem Mischen und Drehen der Proben werden die Röhren für 30 Minuten in einen Thermocycler bei 25 Grad Celsius gesetzt, gefolgt von 65 Grad Celsius für 30 Minuten.

Für die native Barcode-Ligation fügen Sie die auf dem Bildschirm gezeigten Komponenten in neue PCR-Tuben hinzu. Mischen Sie die Reaktionen sanft durch Pipetten und drehen Sie sie kurz mit einer Mikrozentrifuge. Gib als Nächstes einen Mikroliter EDTA in jede Tube.

Dann gründlich mischen und kurz drehen, wie zuvor gezeigt. Ziehen Sie die mit dem Barcode versehenen Proben in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Wirbeln die DNA-Reinigungsperlen vor, um sie vollständig wieder aufzuhängen, und fügen ein Volumen hinzu, das 0,7-fach dem gesammelten Probenvolumen entspricht.

Mische die Perlenprobenlösung und befruchte sie 10 Minuten lang auf einem HulaMixer bei Zimmertemperatur. Als Nächstes, um zwei Milliliter 80%-Ethanol herzustellen, mischen Sie 1.600 Mikroliter reines Ethanol mit 400 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Stellen Sie das Rohr fünf Minuten lang auf ein magnetisches Gestell, bis das Eluat klar und farblos erscheint.

Dann entferne und entsorge das Überlagermittel, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie die Perlen mit 700 Mikrolitern frisch zubereitetem 80%-Ethanol und zentrifugieren Sie das Rohr kurz. Nachdem Sie das Rohr auf das magnetische Gestell gelegt haben, entfernen Sie das restliche Ethanol.

Jetzt entferne das Rohr vom Magnetrack. Lassen Sie die Perlen in 35 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser durch sanftes Schnippen wieder suspendieren und bei 37 Grad Celsius 10 Minuten lang inkubieren. Setzen Sie das Rohr zurück in das magnetische Rack, bis das Eluat klar und farblos ist.

Anschließend werden 35 Mikroliter des Eluats in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr für die weitere Verwendung übertragen. Für die Adapterligatur mischen Sie die gegebenen Komponenten in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit niedriger Bindung. Zentrifugieren Sie das Rohr kurz und inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Im Vortex wird die DNA-Reinigung geperlt, um sie vollständig wieder zu suspendieren. Gib 20 Mikroliter Perlen in die Tube und vermische vorsichtig. Tränke sie 10 Minuten lang auf einem HulaMixer bei Zimmertemperatur.

Dann wird das Rohr auf ein magnetisches Gitter gelegt, um die Perlen zu pelletieren und das Supernatant zu aspirieren, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie 125 Mikroliter Kurzfragmentpuffer hinzu und schnippen Sie vorsichtig mit dem Rohr, um die Perlen wieder aufzuhängen. Zentrifugiere kurz und setze das Rohr zurück ins Magnetrack.

Aspiratiere das Überstandsmittel erneut, nachdem die Perlen gepelletiert sind. Entferne nun das Rohr vom magnetischen Rack und spanne die Perlen durch sanftes Pipettern oder Fliegen in 15 Mikrolitern Elutionspuffer wieder auf. Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz, um den Inhalt zu sammeln, und inkubieren Sie es dann bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten, um die DNA zu elutieren.

Stellen Sie das Rohr auf ein magnetisches Regal, bis das Eluat klar und farblos ist. Anschließend werden 15 Mikroliter Eluat aspiriert und in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen. Um die Durchflusszellen-Priminglösung vorzubereiten, mischen Sie die gegebenen Komponenten gründlich.

Öffnen Sie den Priming-Port der Durchflusszelle, saugen Sie etwa 20 Mikroliter Puffer an, um Luftblasen zu entfernen, und laden Sie 800 Mikroliter des Priming-Gemisch in den Anschluss, ohne Luftblasen einzubringen. Um die DNA-Bibliothek vorzubereiten, mischen Sie die auf dem Bildschirm gezeigten Komponenten gründlich. Heben Sie vorsichtig die Kappe des Probeports der Durchflusszelle an, laden Sie 200 Mikroliter Priming-Mix in den Priming-Port ein, ohne Luftblasen einzubringen.

Nach dem Mischen der vorbereiteten DNA-Bibliothek werden 75 Mikroliter der Bibliothek dropwise in den Sequenzierungs-Flow-Cell-Probenport geladen. Schließen Sie die Abdeckung des Flusszellen-Probenports, damit der Stopfen sicher in den Probenport eindringt, und schließen Sie dann den Priming-Port fest. Die Gelelektrophorese bestätigte die Integrität der Amplicons in fast allen Proben, aber die Spuren zu Proben 89 und 136 zeigten schwache oder fehlende Bänder.

Die Proben 89 und 136 wiesen unzureichende Ampliconkonzentrationen auf, was dazu führte, dass sie von der Long-Read-Sequenzierung ausgeschlossen wurden. Über alle zielgerichteten Gene hinweg erreichten die Long-Read- und Short-Read-Plattformen hohe Abdeckungstiefen, wobei das EIS-Gen die höchsten Durchschnittswerte zeigte und das RRS-Gen die niedrigsten Abdeckungstiefen aufwies. Trotz der unterschiedlichen Abdeckungstiefe behielten beide Plattformen eine hohe Abdeckungsbreite von 99,9 % über alle resistenzassoziierten Gene hinweg.

Arzneimittelresistenzvarianten für Ethambutol, Fluorchinolone, Kanamycin, Amikacin und Capreomycin wurden mit 100%iger Übereinstimmung über Kurz- und Langlese-Sequenzierungsplattformen nachgewiesen. Bei Linezolid, Bedaquilin und Clofazimin wurden bei beiden Sequenzierungsmethoden keine resistenzassoziierten Mutationen gefunden. Die Detektion der Streptomycin-Resistenzresistenz zeigte eine geringere Konkordanz zwischen den Plattformen, mit nur 71,43 % Übereinstimmung

Die Detektionssensitivität für Schlüsselgene wie rpoB, katG/fabG1/ahpC/inhA, fabG1/inhA und pncA lag zwischen den Plattformen zwischen 89,47 % und 96,77 %.