Name: Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Detektion von Rab10-Phosphorylierung durch LRRK2 mittels SDS-PAGE mit Phosphat-Bindungstag. Diese Methode ermöglicht die Schätzung der Phosphorylierungs-Stöchiometrie in Parkinson-Forschung.

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Wir danken Dr. Takeshi Iwatsubo (Universität von Tokyo, Japan) freundlicherweise dafür die Plasmiden Codierung 3xFLAG LRRK2 WT und Mutanten. Wir danken auch Dr. Dario Alessi (Universität von Dundee, UK) freundlicherweise zur MLi-2 und das Plasmid Codierung HA-Rab10. Diese Arbeit wurde von der Japan Society für Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Anzahl JP17K08265 (G.I) unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschreiben wir eine einfache und robuste Methode zum Nachweis Rab10 Phosphorylierung von LRRK2 auf endogene Ebenen basierend auf der P-Tag-Methode. Da die derzeit verfügbaren Antikörper gegen phosphorylierten Rab10 nur mit überexprimieren Proteine15arbeitet, ist das vorliegende Verfahren unter Verwendung von P-Tag SDS-PAGE die einzige Möglichkeit, endogene Ebenen der Rab10 Phosphorylierung zu beurteilen. Darüber hinaus erlaubt das vorliegende Verfahren die Schätzung der Stöchiometrie der Rab...

PD gehört zu den häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen, überwiegend dopaminergen Neuronen im Mittelhirn, beeinflussen, was zu Funktionsstörungen des motorischen Systems in Senioren1. Während die meisten Patienten PD auf sporadische Weise entwickeln, gibt es Familien, die Krankheit zu erben. Mutationen in verschiedenen Genen wurden gefunden, mit FPD2verknüpft werden. Die verursachenden Gene für FPD gehört LRRK2, in denen acht Missense-Mutationen (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S und I2020T) verbunden mit einer dominant vererbten FPD genannt PARK8 bisher gemeldeten3,4,5gewesen sein. Mehreren genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) sporadische PD-Patienten haben auch genomische Variationen bei den LRRK2-Locus als Risikofaktor für PD, darauf hindeutet, dass die Anomalie in der Funktion von LRRK2 ist eine häufige Ursache für Neurodegeneration in beiden sporadisch identifiziert und PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 ist ein großes Protein (2.527 Aminosäuren) bestehend aus einer Leucin-reiche wiederholen Sie Domäne, ein GTP-Bindung Ras komplexe Proteine (ROC) Domäne, eine C-terminale ROC (ADR) Domäne, eine Serin/Threonin Protein Kinase-Domäne und einer WD40 wiederholen Domäne9. Die acht FPD-Mutationen finden in diesen funktionellen Domänen; N1437H und R1441C/G/H/S in der ROC-Domäne, Y1699C im Bereich ADR, G2019S und I2020T in der Kinase-Domäne. Da G2019S Mutation, die am häufigsten in PD Patienten10,11,12Mutation gefunden wird, die Kinase-Aktivität von LRRK2 2-3 Fach in-vitro-13erhöht, wird es vermutet. dass die abnorme Zunahme der Phosphorylierung von LRRK2 Substrate giftig für Neuronen. Es war jedoch unmöglich zu prüfen, ob die Phosphorylierung von physiologisch relevanten LRRK2 Substraten in familiären/sporadische PD-Patienten aufgrund der fehlenden Methoden in abgeleiteten Patientenstichproben Bewertung geändert wird.
Protein-Phosphorylierung wird in der Regel durch Immunoblotting oder Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) mit Antikörpern, die spezifisch erkennen des phosphorylierten Zustands Proteine oder durch massenspektrometrische Analyse erkannt. Die ehemalige Strategie kann jedoch manchmal wegen der Schwierigkeiten bei der Schaffung von Phosphorylierung-spezifische Antikörper angewendet werden. Metabolische Kennzeichnung von Zellen mit radioaktivem Phosphat ist eine weitere Option, physiologische Ebenen der Phosphorylierung zu untersuchen, wenn Phosphorylierung-spezifischen Antikörper nicht leicht verfügbar sind. Aber es erfordert eine große Menge radioaktiver Stoffe und daher beinhaltet einige spezielle Ausrüstung für Strahlenschutz14. Massenspektrometrische Analyse ist empfindlicher gegenüber diesen immunchemische Methoden und populär bei der Analyse von Protein-Phosphorylierung. Jedoch die Probenvorbereitung ist zeitaufwändig und teuer Instrumente sind für die Analyse erforderlich.
Eine Teilmenge der Rab GTPase Familie einschließlich Rab10 und Rab8 wurde kürzlich berichtet, wie das Ergebnis eines umfangreichen Phosphoproteomic Analyse15direkte physiologische Substrate für LRRK2 zugrunde. Wir zeigten dann, dass Rab10 Phosphorylierung von FPD Mutationen im embryonalen Fibroblasten der Maus und in den Lungen von Profi Mäuse16erhöht wurde. In diesem Bericht, wir entschieden uns für eine Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) beschäftigen-basierte Methode, bei der ein P-Tag-Molekül Co polymerisierten in SDS-PAGE Gelen (P-Tag SDS-PAGE) zur Erfassung der endogenen Ebenen der Rab10 Phosphorylierung denn ein hochempfindlicher Antikörper spezifisch für phosphorylierten Rab10 noch fehlte. Wir haben versäumt, die Phosphorylierung des endogenen Rab8 aufgrund der schlechten Selektivität der derzeit verfügbaren Antikörper für insgesamt Rab8 erkennen. Daher entschieden wir uns konzentrieren auf die Rab10 Phosphorylierung. LRRK2 phosphorylates Rab10 bei Thr73 Ortung in der Mitte der Region hoch konservierte "Schalter II". Hohe Erhaltung der Phosphorylierung Websites unter Rab-Proteine möglicherweise einer der Gründe, warum Phosphospecific Antikörper erkennen unterschiedliche Rab-Proteine schwer sind zu machen.
Die Phosphorylierung des Rab8A von LRRK2 hemmt die Bindung von Rabin8, ein Guanin-Nukleotid Austausch Faktor (GEF) die Rab8A aktiviert, durch den Austausch der gebundenen BIP mit GTP15. Phosphorylierung von Rab10 und Rab8A von LRRK2 hemmt auch die Bindung von BIP-Dissoziation-Inhibitoren (GDIs), die wesentlich für die Aktivierung des Rab-Proteine durch die Gewinnung von BIP-gebundenen Rab-Proteine von Membranen15. Gemeinsam wird es vermutet, dass die Phosphorylierung des Rab-Proteine von LRRK2 sie Aktivierung daran hindert, obwohl die genauen molekularen Mechanismus und physiologischen Folgen der Phosphorylierung unklar bleiben.
P-Tag SDS-PAGE wurde erfunden von Kinoshita Et Al. 2006: bei dieser Methode wurde Acrylamid kovalent verbunden mit P-Tag, ein Molekül Erfassung Phosphate mit hoher Affinität, die in SDS-PAGE copolymerisiert Gele17. Da die P-Tag-Moleküle in einem SDS-PAGE Gel selektiv elektrophoretische Mobilität der phosphorylierten Proteine verzögern, kann P-Tag SDS-PAGE phosphorylierten Proteine von nicht phosphoryliert zu trennen (Abbildung 1). Wenn das Protein des Interesses auf mehrere Reste phosphoryliert wird, wird eine Leiter Bands differentiell phosphorylierten Formen entsprechend beobachtet werden. Im Falle von Rab10 beobachten wir nur eine verschobene Band darauf hinweist, dass Rab10 nur bei Thr73 phosphoryliert wird. Der große Vorteil der P-Tag SDS-PAGE über Immunoblotting mit Phosphorylierung-spezifischen Antikörpern ist, dass phosphorylierten Rab10 durch Immunoblotting mit Phosphorylierung-unspezifische Antikörper (d.h.erkennen total Rab10) nachgewiesen werden können nach auf Membranen übertragen wird, ist die in der Regel bestimmten, sensiblen und verfügbar aus kommerziellen/akademische Quellen. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von P-Tag SDS-PAGE ist eine ungefähre Schätzung der Stöchiometrie der Phosphorylierung, erhalten kann, das ist unmöglich, durch Immunoblotting mit Phosphorylierung-spezifische Antikörper oder durch metabolische Kennzeichnung von Zellen mit radioaktiven Phosphate.
Abgesehen von der Verwendung von preiswerten P-Tag Acrylamid und einige geringfügigen Änderungen mit sich bringen folgt das vorliegende Verfahren zur Erkennung von Rab10 Phosphorylierung von LRRK2 ein allgemeines Protokolls Immunoblotting.Daher sollte es unkompliziert und leicht ausführbare in jedem Labor sein, wo Immunoblotting eine übliche Praxis, mit allen Arten von Proben ist, einschließlich der gereinigten Proteine, Zelle Lysates und Gewebe Homogenates.

<table><tbody><tr><td>ReagenzienDulbecco's</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>hausgemachte</td><td></td><td>150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 in MilliQ-Wasser und sterilisiert durch Autoklavieren</td></tr> von <tr><td>Natriumchlorid</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-34</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-Dinatriumhydrogenphosphat 12-Wasser</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Wako</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>Wako</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Trypsin (10X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td>10-fach mit sterilem DPBS verdünnen zur Herstellung der Arbeitslösung</td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertes Eagle medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>BioWest</td><td>S1560</td><td>Hitzeinaktiviert bei 56 μd; C für 30 min</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin HCl MAX, Linear, Mw 40.000 (PEI MAX 40000)</td><td>PolySciences, Inc.</td><td>24765-1</td><td>Die Stammlösung wurde in 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,0 bei 1 mg/ml hergestellt, und der pH-Wert wurde dann auf 7,0 eingestellt: mit NaOH</td></tr>, <tr><td>Dimethylsulfoxid</td>, <td>Wako</td><td>045-28335</td><td></td></tr>, <tr><td>Tris</td><td>STAR</td><td>, RSP-THA500G</td>, Salzsäure, <td></td></tr><tr><td></td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr>, <tr><td>Polyoxyethylen(10)-Octylphenylether</td>, <td>Wako</td><td>160-24751</td>, <td>entspricht Triton X-100</td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA)</td><td>Wako</td><td>346-01312</td><td></td></tr><tr><td>Natriumorthovanadat(V)</td><td>Wako</td><td>198-09752</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluorid</td><td>Kanto Chemical</td><td>37174-20</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerophosphorsäure Dinatriumsalz Pentahydrat</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17103-82</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Pyrophosphat-Decahydrat</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2113899</td><td></td></tr><tr><td>Microcystin-LR</td><td>Wako</td><td>136-12241</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Vollständiger EDTA-freier Proteasehemmer-Cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Lösen Sie eine Tablette in 1 ml Wasser auf, das bei -20 & deg gelagert werden kann; C für einen Monat. Verwenden Sie es in einer Verdünnung von 1:50 für die Zelllyse</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31607-65</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Wako</td><td>075-00616</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Wako</td><td>021-02911</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Kanto Chemical</td><td>25099-00</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Wako</td><td>056-06967</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Wako</td><td>136-01837</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat-bindendes Tag Acrylamid</td><td>Wako</td><td>AAL-107</td><td>P-Tag Acrylamid</td></tr><tr><td>40% (w/v) Acrylamidlösung</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06119-45</td><td>Acrylamid:Bis = 29:1</td></tr><tr><td>Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Wako</td><td>016-08021</td><td>10%ige (w/v) Lösung wurde durch Auflösen des Ammoniumpersulfatpulvers in MilliQ Wasser</td></tr><tr><td>hergestellt 2-Propanol</td><td>Wako</td><td>166-04831</td><td></td></tr><tr><td>Manganchlorid-Tetrahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Prestained Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374, 1610373, 1610377</td><td>Molekulargewichtsmarker, der im Protokoll verwendet wird</td></tr><tr><td>: WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III</td>, <td>Wako</td><td>230-02461</td><td></td></tr>, <tr><td>Glycin</td><td>, Nacalai Tesque</td><td>, 17109-64</td><td></td></tr>, <tr><td>Amersham, Protran, NC 0,45</td>, <td>GE Healthcare</td> 10600007 <td>Nitrocellulose-Membran</td>, <td></td></tr><tr><td>Durapore-Membranfilter,</td><td>EMD-Millipore</td><td>, GVHP00010</td><td>PVDF-Membran</td></tr>, <tr><td>Filterpapiere Nr. 1</td><td>Advantec</td><td>00013600</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28322-72</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Wako</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>Polyoxyethylenorbitanmonolaurat</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Wako</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Magermilchpulver</td><td>Difco Laboratories</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Immunostar</td><td>Wako</td><td>291-55203</td><td>ECL-Lösung (normale Empfindlichkeit)</td></tr><tr><td>Immunostar LD</td><td>Wako</td><td>290-69904</td><td>ECL-Lösung (hohe Empfindlichkeit)</td></tr><tr><td>CBB-Färbelösung</td><td>hausgemacht</td><td></td><td>1 g CBB R-250, 50% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Essigsäure in 1 L MilliQ Wasser</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td></td></tr><tr><td>CBB-Entfärbung hausgemachte</td><td></td><td></td> Lösung <td>12% (v/v) Methanol, 7% (v/v) Essigsäure in 1 L MilliQ Wasser</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</strong</td><td>>Kommentare</td></tr><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-HA Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11583816001</td><td>Verwendet bei 0,2 μ; g/ml für Immunblotting.</td></tr><tr><td>anti-Rab10-Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#8127</td><td>Wird bei 1:1000 für das Immunblotting verwendet. Die Spezifität wurde durch CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016, bestätigt.</td></tr><tr><td>anti-pSer935 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab133450</td><td>Verwendet bei 1 &mu; g/ml für Immunblotting.</td></tr><tr><td>Anti-LRRK2-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab133518</td><td>Verwendet bei 1 &mu; g/ml für Immunblotting.</td></tr><tr><td>anti-&alpha;-Tubulin-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>Verwendet bei 1 &mu; g/ml für Immunblotting.</td></tr><tr><td>anti-GAPDH-Antikörper</td><td>Santa-Cruz</td><td>sc-32233</td><td>Verwendet bei 0,02 &mu; g/ml für Immunblotting.</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Schaf Anti-Maus IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td>Verwendet bei 0,16 &mu; g/ml für Immunblotting.</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniReine Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-003</td><td>Verwendet bei 0,16 &mu; g/ml für Immunblotting.</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>InhibitorsGSK2578215A</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MedChem Express</td><td>HY-13237</td><td>Stammlösung wurde in DMSO bei 10 mM hergestellt und bei -80 & Grad gelagert. C</td></tr><tr><td>MLi-2</td><td>zur Verfügung gestellt von Dr. Dario Alessi (University of Dundee)</td><td></td><td>Die Stammlösung wurde in DMSO bei 10 mM hergestellt und bei -80 μg gelagert; C</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</td><td><>Katalognummer<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Plasmide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rab10/pcDNA5 FRT TO HA</td><td>Bereitgestellt von Dr. Dario Alessi (University of Dundee)</td><td></td><td>Dieses Plasmid exprimiert aminoterminales HA-markiertes humanes Rab10.</td></tr><tr><td>LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td><td></td><td>Ito et al., Biochemistry, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). Dieses Plasmid exprimiert aminoterminales 3xFLAG-markiertes humanes Wildtyp-LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td><td></td><td>Ito et al., Biochemistry, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte K1906M-Kinase-inaktive Mutante von humanem LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>Dieses Papier. Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte N1437H FPD-Mutante von humanem LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (Universität Tokio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte R1441C FPD-Mutante von humanem LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (Universität Tokio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte R1441G FPD-Mutante von humanem LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (Universität Tokio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte R1441H FPD-Mutante von humanem LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>Dieses Papier. Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte R1441S FPD-Mutante von humanem LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (Universität Tokio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte Y1699C FPD-Mutante von humanem LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (Universität Tokio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemie, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte G2019S FPD-Mutante von humanem LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (Universität Tokio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemie, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte I2020T FPD-Mutante von humanem LRRK2.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific Forma Series II 3110 Wassermantel-Autopipette</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Drummond</td><td>Pipet-Aid PA-400</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette P10</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-10</td><td>0.5&ndash; 10 &mu; L</td></tr><tr><td>Mikropipette P200</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-200</td><td>20&ndash; 200 &mu; L</td></tr><tr><td>Mikropipette P1000</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-1000</td><td>100&ndash; 1000 &mu; L</td></tr><tr><td>Spitzen für Mikropipette P10</td><td>STAR</td><td>RST-481LCRST</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Spitzen für Mikropipette P200</td><td>FUKAEKASEI</td><td>1201-705YS</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Spitzen für Mikropipette P1000</td><td>STAR</td><td>RST-4810BRST</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>5 mL Einwegpipette</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>10 mL Einwegpipette</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>25-ml-Einwegpipette</td><td>Falcon</td><td>357535</td><td>Steriles</td></tr><tr><td>Hämatozytometer</td><td>Sunlead Glass</td><td>A126</td><td>Verbessertes Neubeuer-Mikroskop</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>10-cm-Schalen</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>Für Gewebekulturen</td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>AGC Techno Glass</td><td>3810-006</td><td>Für Gewebekulturen</td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Zellenschaber</td><td>Sumitomo Bakelit</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td>STAR</td><td>RSV-MTT1.5</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>AGC Techno Glass</td><td>2323-015</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td>AGC Techno Glass</td><td>2343-050</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugen</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Greiner</td><td>655061</td><td>Nicht für Gewebekulturen</td></tr><tr><td>geeignet Platten-Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M2e</td><td></td></tr><tr><td>SDS&ndash; PAGE Tanks</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1010</td><td></td></tr><tr><td>Transfertanks</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1510B</td><td></td></tr><tr><td>Gelplatten (gekerbt)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Gel Platten (blank)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-2</td><td></td></tr><tr><td>Silikon Abstandshalter</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>17-Well-Kämme</td><td>Nihon Eido</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>Bindeklammern</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-15</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Spritze</td><td>Terumo</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>21G</td><td>Terumo</td><td>NN-2138R</td><td></td></tr><tr><td>Power Station 1000 VC</td><td>ATTO</td><td>AE-8450</td><td>Netzteil für SDS&ndash; PAGE und Transfer</td></tr><tr><td>Große Wägeschiffchen</td><td>Ina Optika</td><td>AS-DL</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffbehälter</td><td>AS ONE</td><td>PS CASE Nr.4</td><td>10 x 80 x 50 mm</td></tr><tr><td>Schaukelschüttler</td><td>Titech</td><td>NR-10</td><td></td></tr><tr><td>Styrolschaumbox</td><td>generisch</td><td></td><td>Die Innenmaße sollten für einen Übergabebehälter (200 x 250 x 250 mm) geeignet sein.</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4000</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Ein Imager, der mit einer gekühlten CCD-Kamera zur Erkennung von ECL ausgestattet</td></tr></tbody></table> ist

rab10 phosphorylierung erkennung von lrrk2 aktivität mit sds-page mit einem phosphat-bindung

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutationen im Leucin-reiche wiederholen Kinase 2 (LRRK2) haben gezeigt, mit familiären Parkinson-Erkrankung (FPD) verknüpft werden. Da abnormale Aktivierung der Kinase-Aktivität von LRRK2 in der Pathogenese von Morbus Parkinson in Verbindung gebracht hat, ist es wichtig, eine Methode zur Evaluierung der physiologischen Ebenen die Kinase-Aktivität von LRRK2 zu etablieren. Neuere Studien gezeigt, dass LRRK2 Rab GTPase Familienmitglieder, einschließlich Rab10, unter physiologischen Bedingungen phosphorylates. Obwohl die Phosphorylierung des endogenen Rab10 von LRRK2 in kultivierten Zellen durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden konnte, ist es schwierig zu erkennen durch Immunoblotting aufgrund der schlechten Empfindlichkeit der derzeit verfügbaren Phosphorylierung-spezifische Antikörper für gewesen. Rab10. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zum Nachweis der endogenen Ebenen der Rab10 Phosphorylierung von LRRK2 basierend auf Immunoblotting Verwendung von Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) kombiniert mit einem Phosphat-Bindung-Tag (P-Tag), die ist N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- Tris (Pyridin-2-Yl-Methyl) - 1,3 - Diaminopropan-2-Ol. Dieses Protokoll nicht nur liefert ein Beispiel für die Methode, die Nutzung im P-Tags, sondern ermöglicht auch die Bewertung von Mutationen sowie Inhibitor Behandlung/Verwaltung oder andere Faktoren, wie alter der nachgeschalteten Signalisierung von LRRK2 in Zellen und Geweben .

Überexpression System: Phosphorylierung des HA-Rab10 von 3 Zellen × Fahne-LRRK2 in HEK293:
HEK293 Zellen wurden mit 0,266 µg von HA-Rab10 Wildtyp und 1.066 µg von 3 × Flagge LRRK2 (Wildtyp, Kinase-inaktive Mutant (K1906M) oder FPD Mutanten) transfiziert. Rab10 Phosphorylierung wurde geprüft durch P-Tag SDS-PAGE gefolgt von Immunoblotting mit einem Anti-HA Antikörper (Abbildung 2). 10 µg Proteine wurden...

Die vorliegende Studie beschreibt eine einfache Methode zur Erkennung von endogenen Ebenen der Rab10 Phosphorylierung von Leucin-reiche wiederholen Kinase 2.

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Rab10-Phosphorylierung durch LRRK2 unter Verwendung von SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindungs-Tag nachzuweisen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Parkinson-Forschung zu beantworten, z. B. wie sich Krankheitsmutationen in LRRK2 auf die Rab10-Phosphorylierung auswirken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass man mit einem einfachen Western Blot eine grobe Abschätzung der Stöchiometrie der Rab10-Phosphorylierung vornehmen kann.Viele der Schritte dieses Protokolls sind ziemlich standardisiert und werden im Textprotokoll, das diesem Video beiliegt, ausreichend detailliert beschrieben. Hier möchten wir Ihnen die Schritte zeigen, die am meisten von einer visuellen Anleitung profitieren. Bereiten Sie Platten mit transfizierten HEK293-Zellen vor, wie im Textprotokoll beschrieben.Wenn die Platten auf Eis liegen, saugen Sie das Medium an und entsorgen Sie es. Geben Sie als Nächstes vorsichtig zwei Milliliter DPBS in die Ecke jeder Platte und schütteln Sie die Platten, um die Lösung zu verteilen. Entfernen und entsorgen Sie dann den DPBS.Geben Sie anschließend 100 Mikroliter Lysepuffer auf jede Platte. Kippen Sie die Platte und verwenden Sie einen Schaber, um den Puffer zu verteilen und das Zelllysat freizusetzen. Dann aspirieren Sie die Lysate und geben Sie sie in auf Eis vorgekühlte Mikrofugenröhrchen und warten Sie 10 Minuten.Sammeln Sie als Nächstes trümmerfreie Zelllysate, indem Sie die Röhrchen zentrifugieren und die Überstände in neue Röhrchen auf Eis übertragen. Messen Sie dann die Proteinkonzentrationen der geklärten Lysate mit dem Bradford-Assay. Für die Konzentrationsdaten bereiten Sie 100 Mikroliter Proben der Lysate für die Gelanalyse vor.Bereiten Sie dichtere Lysate vor, um endogenes Rab10 im Vergleich zu überexprimiertem Hämagglutinin Rab10 zu messen. Beenden Sie die Vorbereitung der Proben, indem Sie sie fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius inkubieren. Lagern Sie die Proben dann bis zu sechs Monate oder länger unter minus 20 Grad Celsius, bis sie benötigt werden.Bereiten Sie zunächst die SDS-PAGE-Zellen gemäß dem Textprotokoll vor. Laden Sie dann das Gel in den Tank und sichern Sie es mit Bindeklammern. Füllen Sie anschließend den Tank mit Laufpuffer und entfernen Sie die Luftblasen in den Vertiefungen und unter dem Gel mit einer Nadel, die an einer Spritze befestigt ist.Geben Sie nun Manganchlorid zu den Proben und schleudern Sie sie herunter, um die Ausfällungen zu entfernen. Laden Sie dann das Gel mit gleichen Probenmengen, 10 Mikrogramm Protein zur Analyse von überexprimiertem Hämagglutinin Rab10 oder 30 Mikrogramm Protein zur Analyse von endogenem Rab10. Beladen Sie die leeren Bahnen mit Probenpuffer, der Manganchlorid enthält.Ergänzen Sie auch den Molekulargewichtsmarker mit Puffer und Manganchlorid, um das gleiche Volumen wie die Proben zu erhalten. Beginnen Sie nun, das Gel mit 50 Volt laufen zu lassen. Erhöhen Sie nach dem Probenstapel die Spannung auf 120, um eine Trennung zu erreichen.Wenn die Farbstofffront den Boden der Gele erreicht, töte die Spannung. Waschen Sie das Gel anschließend dreimal wie folgt. Laden Sie das Trenngel in ein Bad mit sauberem Transferpuffer mit zugesetztem EDTA und SDS.Anschließend auf einem Shaker 10 Minuten bei Zimmertemperatur schaukeln lassen. Führen Sie nach drei Wäschen eine weitere Wäsche mit Transferpuffer mit zugesetztem SDS, aber ohne EDTA durch. Übertragen Sie dann das Gel mit einem nassen Tank.Laden Sie den Tank in eine mit eiskaltem Wasser gefüllte Schaumstoffbox, schließen Sie den Tank an eine Stromversorgung an und starten Sie den Transfer. Ein langer Transfer mit effizienter Kühlung ist für das Verfahren unerlässlich. Überprüfen Sie nach dem Transfer den Transfer, indem Sie die Membran mit Ponceau S färben, gefolgt von einer Wäsche in TBST gemäß dem Textprotokoll.Wenden Sie als Nächstes einen Block an. Tauchen Sie den Blot in milchiges TBST und wiegen Sie den Blot eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Shaker. Entfernen und verwerfen Sie dann die Blockierungslösung und tragen Sie die primäre Antikörperlösung auf.Schütteln Sie nun die Membran über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie am nächsten Tag die primäre Antikörperlösung. Waschen Sie die Membran dann wie bisher dreimal mit frischem TBST.Tauchen Sie den Blot nach dem Waschen in eine sekundäre Antikörperlösung und inkubieren Sie die Membran etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Waschen Sie die Membran nach der Inkubation noch einmal dreimal mit TBST. Entwickeln Sie nun die Membran.Geben Sie einen Milliliter ECL-Lösung auf ein großes Blatt Plastikfolie. Legen Sie dann die Membran in das ECL und drehen Sie sie schnell um, um beide Seiten zu benetzen. Heben Sie dann die Membran an und lassen Sie sie abtropfen.Lassen Sie eine Kante nach dem Abtropfen etwa fünf Sekunden lang ein Papiertuch berühren, um überschüssige Lösung abzuleiten. Wickeln Sie die Membran dann in eine steife, klare Folie ohne Falten und übertragen Sie sie zur Bildgebung auf ein schwarzes Tablett. HEK293-Zellen wurden mit Hämagglutinin Rab10 Wildtyp und 3xFLAG-LRRK2 transfiziert.Es wurden Wildtyp-Kinase, die bei familiären Parkinson-Mutationen von LRRK2 inaktiv ist, getestet. Die Co-Überexpression von LRRK2 und Rab10 führte zu einer starken Bandenverschiebung im P-Tag-Gel. Im Gegensatz dazu führte die Co-Expression mit einer inaktiven Kinase-Mutante zu keiner Veränderung der Rab10-Mobilität, was auf die Kinase als Ursache für die Bandenverschiebung hindeutet.Wie erwartet, verstärkten die familiären Parkinson-Mutationen die Bandenverschiebung. Das P-Tag-Gel-System wurde auch zur Analyse von embryonalen 3T3-Albino-Fibroblastenzellen der Maus verwendet, die mit einem LRRK2-Inhibitor behandelt wurden. Die Bandenverschiebung, die dem phosphorylierten endogenen Rab10 entspricht, verschwand, wenn die Zellen mit GSK2578215A behandelt wurden.Der gleiche Test wurde auch mit menschlichen A549-Zellen durchgeführt. In diesen Experimenten wurde die Wirksamkeit des LRRK2-Inhibitors mit dem anti-p Serin 935 LRRK2-Antikörper validiert, der ein gut etablierter Marker für die LRRK2-Hemmung ist. Einmal gemeistert, benötigt diese Technik nur zusätzliche 14 Minuten im Vergleich zu einem normalen Western-Blotting-Verfahren, bei dem Gele vor dem Transfer gewaschen werden.Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Massenspektrometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob FPD-Mutanten den gleichen Rest von Rab10 phosphorylieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Parkinson-Forschung, um die endogenen Niveaus der Rab10-Phosphorylierung sowohl in kultivierten Zellen als auch in Geweben zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Microcystin, das dem Lysepuffer zugesetzt wird, äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Vorbereitung von Zelllysaten immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Leucin rich repeat kinase 2 ist ein großes Multidomain-Kinase, Mutationen, bei denen sind die häufigste genetische Ursache der Parkinson-Krankheit. Die Analyse der Kinase-Aktivität dieses Proteins hat sich als wichtiges Instrument für das Verständnis der Biologie und Dysfunktion des Proteins werden. In diesem...

Untersuchen der Kinase-Aktivität von LRRK2 In-vitro-</em

Dieses Video demonstriert eine empfindliche Quantifizierungstechnik der Proteinphosphorylierung mit einem Einzelmolekül-Pull-Down-Assay. Die Funktionalisierung von Polyethylenglykol-Biotin und die Verwendung von markierten Antikörpern erhöht den Nachweis von phosphoryliertem Tyrosin mit Spezifität.

Einzelmolekül-Pull-Down-Assay für die Proteinphosphorylierungsanalyse: Eine Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung in Zelllysat

Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Proteine, die sowohl GTPase und Kinase-Domänen kodieren, und die in Zellen phosphoryliert sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur LRRK1 und LRRK2 in Zellen mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um ihre Gesamtzell Phosphorylierung zu messen bietet.

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das eine detaillierte Analyse der phosphorylierungsabhängigen Aktivierung des IRF3-Transkriptionsfaktors ermöglicht. Dies wird durch die Kombination einer hochauflösenden SDS-PAGE und einer nativen PAGE erreicht, die mit Immunoblots unter Verwendung mehrerer phosphospezifischer Antikörper gekoppelt ist.

Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen

Peptid-Konkurrenz-Assays sind weit verbreitet in einer Vielzahl von molekularen und immunologischen Experimenten verwendet. Dieses Papier beschreibt eine detaillierte Methode für einen in vitro- Oligopeptid-konkurrierenden Kinase-Assay und die damit verbundenen Validierungsverfahren, die nützlich sein können, um spezifische Phosphorylierungsstellen zu finden.

Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Mutationen im Leucin-reichen Repeatkinase-2-Gen (LRRK2) verursachen eine erbliche Parkinson-Krankheit. Wir haben eine einfache und robuste Methode zur Beurteilung der LRRK2-kontrollierten Phosphorylierung von Rab10 bei menschlichen peripheren Blutneutrophilen entwickelt. Dies kann helfen, Personen mit erhöhter LRRK2-Kinase-Signalweg-Aktivität zu identifizieren.

Human periphere Blut Neutrophil Isolation für die Verhör der Parkinson-assoziierten LRRK2 Kinase Weg durch Bewertung Rab10 Phosphorylierung

Das Ziel dieses Protokolls ist zu beschriften, zu bereichern und Substrate der Proteinkinase CK2 aus einer komplexen biologischen Probe z. B. eine Zelle lysate oder Gewebe Homogenat zu identifizieren. Diese Methode nutzt die einzigartigen Aspekte der CK2 Biologie für diesen Zweck.

Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

Wir charakterisierten ein neues Kinase-Protein mit robusten biochemischen Ansätzen: Western Blot-Analyse mit einem speziellen Antikörper an verschiedenen Zelllinien und Geweben, Wechselwirkungen durch Coimmunozipitungsexperimente, Kinase-Aktivität, die von Western Blot mit einem phosphospezifischen Antikörper und durch die ATP-Kennzeichnung von32P.

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Dieses Protokoll beschreibt die schnelle und hochempfindliche Quantifizierung von Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Daten Sensor eine maßgeschneiderte portable FRET-Analyzer. Das Gerät wurde verwendet, Maltose innerhalb eines kritischen Temperaturbereich zu erkennen, die Detektionsempfindlichkeit maximiert, wodurch praktische und effiziente Beurteilung der Zuckergehalt.

Hochempfindliche und schnelle Fluoreszenzdetektion mit einem tragbaren FRET Analyzer

Diese Studie beschreibt biophysikalischen, biochemischen und molekularen Techniken , um die Chaperon - Aktivität von Escherichia coli HdeB unter sauren pH - Bedingungen zu charakterisieren. Diese Verfahren wurden für andere Säureschutz Chaperone wie HdeA erfolgreich angewendet und kann modifiziert werden, um andere Chaperone und Belastungsbedingungen zu arbeiten.

Nachweis des pH-abhängige Aktivität von<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; und<em&gt; In Vivo</em

Erfahren Sie die Detektion von Rab10-Phosphorylierung durch LRRK2 mittels SDS-PAGE mit Phosphat-Bindungstag. Diese Methode ermöglicht die Schätzung der Phosphorylierungs-Stöchiometrie in Parkinson-Forschung.

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

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