Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Rab10-Phosphorylierung durch LRRK2 unter Verwendung von SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindungs-Tag nachzuweisen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Parkinson-Forschung zu beantworten, z. B. wie sich Krankheitsmutationen in LRRK2 auf die Rab10-Phosphorylierung auswirken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass man mit einem einfachen Western Blot eine grobe Abschätzung der Stöchiometrie der Rab10-Phosphorylierung vornehmen kann.

Viele der Schritte dieses Protokolls sind ziemlich standardisiert und werden im Textprotokoll, das diesem Video beiliegt, ausreichend detailliert beschrieben. Hier möchten wir Ihnen die Schritte zeigen, die am meisten von einer visuellen Anleitung profitieren. Bereiten Sie Platten mit transfizierten HEK293-Zellen vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Wenn die Platten auf Eis liegen, saugen Sie das Medium an und entsorgen Sie es. Geben Sie als Nächstes vorsichtig zwei Milliliter DPBS in die Ecke jeder Platte und schütteln Sie die Platten, um die Lösung zu verteilen. Entfernen und entsorgen Sie dann den DPBS.

Geben Sie anschließend 100 Mikroliter Lysepuffer auf jede Platte. Kippen Sie die Platte und verwenden Sie einen Schaber, um den Puffer zu verteilen und das Zelllysat freizusetzen. Dann aspirieren Sie die Lysate und geben Sie sie in auf Eis vorgekühlte Mikrofugenröhrchen und warten Sie 10 Minuten.

Sammeln Sie als Nächstes trümmerfreie Zelllysate, indem Sie die Röhrchen zentrifugieren und die Überstände in neue Röhrchen auf Eis übertragen. Messen Sie dann die Proteinkonzentrationen der geklärten Lysate mit dem Bradford-Assay. Für die Konzentrationsdaten bereiten Sie 100 Mikroliter Proben der Lysate für die Gelanalyse vor.

Bereiten Sie dichtere Lysate vor, um endogenes Rab10 im Vergleich zu überexprimiertem Hämagglutinin Rab10 zu messen. Beenden Sie die Vorbereitung der Proben, indem Sie sie fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius inkubieren. Lagern Sie die Proben dann bis zu sechs Monate oder länger unter minus 20 Grad Celsius, bis sie benötigt werden.

Bereiten Sie zunächst die SDS-PAGE-Zellen gemäß dem Textprotokoll vor. Laden Sie dann das Gel in den Tank und sichern Sie es mit Bindeklammern. Füllen Sie anschließend den Tank mit Laufpuffer und entfernen Sie die Luftblasen in den Vertiefungen und unter dem Gel mit einer Nadel, die an einer Spritze befestigt ist.

Geben Sie nun Manganchlorid zu den Proben und schleudern Sie sie herunter, um die Ausfällungen zu entfernen. Laden Sie dann das Gel mit gleichen Probenmengen, 10 Mikrogramm Protein zur Analyse von überexprimiertem Hämagglutinin Rab10 oder 30 Mikrogramm Protein zur Analyse von endogenem Rab10. Beladen Sie die leeren Bahnen mit Probenpuffer, der Manganchlorid enthält.

Ergänzen Sie auch den Molekulargewichtsmarker mit Puffer und Manganchlorid, um das gleiche Volumen wie die Proben zu erhalten. Beginnen Sie nun, das Gel mit 50 Volt laufen zu lassen. Erhöhen Sie nach dem Probenstapel die Spannung auf 120, um eine Trennung zu erreichen.

Wenn die Farbstofffront den Boden der Gele erreicht, töte die Spannung. Waschen Sie das Gel anschließend dreimal wie folgt. Laden Sie das Trenngel in ein Bad mit sauberem Transferpuffer mit zugesetztem EDTA und SDS.

Anschließend auf einem Shaker 10 Minuten bei Zimmertemperatur schaukeln lassen. Führen Sie nach drei Wäschen eine weitere Wäsche mit Transferpuffer mit zugesetztem SDS, aber ohne EDTA durch. Übertragen Sie dann das Gel mit einem nassen Tank.

Laden Sie den Tank in eine mit eiskaltem Wasser gefüllte Schaumstoffbox, schließen Sie den Tank an eine Stromversorgung an und starten Sie den Transfer. Ein langer Transfer mit effizienter Kühlung ist für das Verfahren unerlässlich. Überprüfen Sie nach dem Transfer den Transfer, indem Sie die Membran mit Ponceau S färben, gefolgt von einer Wäsche in TBST gemäß dem Textprotokoll.

Wenden Sie als Nächstes einen Block an. Tauchen Sie den Blot in milchiges TBST und wiegen Sie den Blot eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Shaker. Entfernen und verwerfen Sie dann die Blockierungslösung und tragen Sie die primäre Antikörperlösung auf.

Schütteln Sie nun die Membran über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie am nächsten Tag die primäre Antikörperlösung. Waschen Sie die Membran dann wie bisher dreimal mit frischem TBST.

Tauchen Sie den Blot nach dem Waschen in eine sekundäre Antikörperlösung und inkubieren Sie die Membran etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Waschen Sie die Membran nach der Inkubation noch einmal dreimal mit TBST. Entwickeln Sie nun die Membran.

Geben Sie einen Milliliter ECL-Lösung auf ein großes Blatt Plastikfolie. Legen Sie dann die Membran in das ECL und drehen Sie sie schnell um, um beide Seiten zu benetzen. Heben Sie dann die Membran an und lassen Sie sie abtropfen.

Lassen Sie eine Kante nach dem Abtropfen etwa fünf Sekunden lang ein Papiertuch berühren, um überschüssige Lösung abzuleiten. Wickeln Sie die Membran dann in eine steife, klare Folie ohne Falten und übertragen Sie sie zur Bildgebung auf ein schwarzes Tablett. HEK293-Zellen wurden mit Hämagglutinin Rab10 Wildtyp und 3xFLAG-LRRK2 transfiziert.

Es wurden Wildtyp-Kinase, die bei familiären Parkinson-Mutationen von LRRK2 inaktiv ist, getestet. Die Co-Überexpression von LRRK2 und Rab10 führte zu einer starken Bandenverschiebung im P-Tag-Gel. Im Gegensatz dazu führte die Co-Expression mit einer inaktiven Kinase-Mutante zu keiner Veränderung der Rab10-Mobilität, was auf die Kinase als Ursache für die Bandenverschiebung hindeutet.

Wie erwartet, verstärkten die familiären Parkinson-Mutationen die Bandenverschiebung. Das P-Tag-Gel-System wurde auch zur Analyse von embryonalen 3T3-Albino-Fibroblastenzellen der Maus verwendet, die mit einem LRRK2-Inhibitor behandelt wurden. Die Bandenverschiebung, die dem phosphorylierten endogenen Rab10 entspricht, verschwand, wenn die Zellen mit GSK2578215A behandelt wurden.

Der gleiche Test wurde auch mit menschlichen A549-Zellen durchgeführt. In diesen Experimenten wurde die Wirksamkeit des LRRK2-Inhibitors mit dem anti-p Serin 935 LRRK2-Antikörper validiert, der ein gut etablierter Marker für die LRRK2-Hemmung ist. Einmal gemeistert, benötigt diese Technik nur zusätzliche 14 Minuten im Vergleich zu einem normalen Western-Blotting-Verfahren, bei dem Gele vor dem Transfer gewaschen werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Massenspektrometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob FPD-Mutanten den gleichen Rest von Rab10 phosphorylieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Parkinson-Forschung, um die endogenen Niveaus der Rab10-Phosphorylierung sowohl in kultivierten Zellen als auch in Geweben zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Microcystin, das dem Lysepuffer zugesetzt wird, äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Vorbereitung von Zelllysaten immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.