Umfassendes räumliches Profiling von spezies-agnostischen Transkriptomen mittels Stereo-Seq

Unsere Forschung konzentriert sich darauf, die Mikroumgebung des Ovarialtumors im Detail zu charakterisieren, um prädiktive und therapeutische Biomarker zu identifizieren. Zum Beispiel möchten wir Marker finden, die Chemo-Reaktion und Chemoresistenz vorhersagen, oder neuartige therapeutische Ziele für Zweitlinienbehandlungen. Zu den experimentellen Herausforderungen gehören die Probenhandhabung, die Qualitätsbewertung der Probe und die Dauer der Probenbearbeitung.

Im Bereich der Datenanalyse gehören Herausforderungen zum Beispiel die Sparsamkeit der Daten, ähnlich wie bei anderen Einzelzellprozessen, sowie die Kartierung von Gebieten, insbesondere wiederholender Regionen. Nachdem der Stereo-Sequenzierungs-N-Chip aus der Verpackung entfernt wurde, notieren Sie die Chip-Identifikationsnummer. Ohne die N-Chip-Oberfläche zu berühren, reinigen Sie den Glasschlitten mit 100 % Ethanol.

Mit einer Mikropipette werden vorsichtig 10 Mikroliter ultraviolett-aushärtbares Keramikharz um den Rand des stereo-sequenzierenden N-Chips aufgetragen. Verwenden Sie einen versiegelten Schaumstoffwbe, um überschüssiges Harz zu entfernen, sodass nur eine dünne Linie um die Abspänerkante bleibt. Setzen Sie den Schlitten in das ultraviolette Aushärtungsgerät und stellen Sie sicher, dass die Chipoberfläche nicht berührt wird.

Legen Sie nun den mit Harz aufgetragenen Chip auf eine undurchsichtige Maske auf die 405-Nanometer-Ultraviolett-Lichtquelle, um die Rückseite des Objektträgers zu beleuchten, und härten Sie fünf Minuten lang aus. Nach dem Aushärten verwenden Sie versiegelte Schaumstoffabströcher, die in 100 % molekularhaltigem Ethanol, dann 70 % Ethanol und schließlich nukleasefreies Wasser eingeweicht sind, um die harzhaltige Kante zu reinigen. Tauchen Sie den Chip dreimal mit einem 50-Milliliter-konischen Rohr in frisches, nukleasefreies Wasser.

Mit Druckluft trocknen Sie den Chip mit voller Luftkraft in einem Winkel von etwa 60 bis 80 Grad, der diagonal über die Oberfläche aus etwa fünf Zentimetern Entfernung bewegt wird. Anschließend werden 150 Mikroliter Poly-L-Lysin-Lösung gleichmäßig über die gesamte Chipoberfläche aufgetragen und der Chip 10 Minuten lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Entferne dann die Poly-L-Lysin-Lösung aus dem Chip.

Nach der zweiten Wäsche trocknen Sie die Ränder des Schlittens sorgfältig, ohne die Chip-Oberfläche zu berühren. Trocknen Sie den Chip fest mit Druckluft, wie zuvor gezeigt. Beim Segmentieren des FFPE-Gewebes sollte man den Chip nicht direkt berühren und nur 80 % des Chips mit Gewebe bedecken.

Um zwei Mikroliter einzelsträngige DNA-Färbungslösung im SSC-Puffer herzustellen, verdünnen Sie das Qubit-Einzelstrang-DNA-Reagenz mit einem 5-fachen SSC-Puffer. Erstellen Sie eine Hauptmischung aus Färbelösung mit einer Verdünnung von ein bis 20 Ribonukleaseinhibitoren, einer Verdünnung von ein bis 200 der einsträngigen DNA-Lösung und dem restlichen Volumen mit einem 5-fachen SSC-Puffer. Gib jedem Chip 150 Mikroliter Färbelösung hinzu und brüte fünf Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie dann vorsichtig die Flecklösung an der Ecke jedes Chips mit einer Pipette. Nach zweimaligem Waschen des Chips mit 0,1-fachem SSC-Puffer für 10 bis 15 Sekunden trocknen Sie die Kanten des Objektträgers sorgfältig. Gib etwa drei bis fünf Mikroliter Glycerol auf den Objektträger, um ihn zu montieren.

Lassen Sie einen Abdeckzettel etwa einen Zentimeter über dem Schlitten platzieren, halten Sie ihn waagerecht und achten Sie darauf, dass er die Chipoberfläche nicht berührt. Erfassen Sie fluoreszierende Bilder von einzelsträngigem, DNA-gefärbtem Gewebe mit einem Weitfeldmikroskop, um eine Überlappung von 10 % zwischen den Bildkacheln sicherzustellen. Fügen Sie die aufgenommenen Bilder in Bildverarbeitungssoftware wie ImageJ zusammen, indem zunächst theoretische Überlappungen genutzt werden, um ungefähre Kachelpositionen zu erzeugen, und anschließend Pixel-Matching Rechenüberlappung anwendet, um die Tiling feinabzustimmen.

Verarbeiten Sie die zusammengefügten Bilder in der StereoMap-Software und überprüfen Sie, dass die Bildqualitätskontrolle bestanden ist, bevor Sie fortfahren. Tauchen Sie den Stereo-Sequenzierungsschlitten in 30 Milliliter 0,1-fachen SSC-Puffer, bis sich der Deckmantel löst. Stellen Sie sicher, dass das FFPE-Decrosslinking-Reagenz Raumtemperatur erreicht und auf Partikel untersucht wird.

Schalten Sie den Thermocycler ein und stellen Sie ihn auf 30 Grad Celsius für das Gleichgewicht, 95 Grad Celsius für eine 30-minütige Inkubation und unendliche Haltung bei vier Grad Celsius ein. Setze die Kassettendichtung zusammen und setze den Stereo-Sequenzierungschip-Schlitten in die Kassette. Gib dann ein FFPE-Decrosslinking-Reagenz in den Schacht der Stereo-Sequenzierungskassette, klebt Dichtband auf die Kassette und prüfe, dass sie fest versiegelt ist.

Starte die 30-minütige Brutzeit bei 95 Grad Celsius. Nach 10 Minuten geben Sie 25 Milliliter Methanol in einen 50-Milliliter-Behälter in einem Gefrierschrank bei 20 Grad Celsius und bereiten Sie etwa einen Milliliter pro Objektträger für die spätere Verwendung vor. Nachdem der Chip aus dem Thermocycler entfernt wurde, übertrage die Schlittenkassette auf die Werkbank und ziehe das Dichtungsband ab.

Mit einer Pipette entferne und entsorge das FFPE-Decrosslinking-Reagenz von der Kassette. Sobald das Reagenz vollständig entfernt ist, lösen Sie die Kassette und die Dichtung ab und entsorgen Sie sie. Unter einer sterilen Dampfhaube trocknen Sie den Rand des Schlittens und legen Sie bei Bedarf eine neue Silikonkammer an.

Fügen Sie 500 Mikroliter gekühltes Methanol aus dem 20-Grad-Gefrierschrank hinzu, sodass der gesamte Abschnitt untergetaucht ist. Vorwärme die PR-Lösung auf einem 37-Grad-Trockenblock für 10 Minuten vor der Verwendung. Nach der Fixierung wischen Sie in einer Abzugshaube überschüssiges Methanol vom Schlitten ab und warten Sie, bis das restliche Methanol auf dem Chip verdunstet ist.

Bauen Sie eine neue Kassettenenddichtung zusammen. Nach Abschluss der Verdunstung wird der Stereo-Sequenzierungschip-Schlitter in die Kassette eingefügt. Fügen Sie dem Chip 200 Mikroliter vorgewärmtes Permeablisierungsreagenz hinzu.

Tragen Sie Dichtungsband auf die Stereo-Sequenzierkassette an und stellen Sie sicher, dass sie fest versiegelt ist. Führen Sie eine umgekehrte Transkription durch und dann die CDNA-Freisetzung und -Reinigung gemäß den hier gezeigten Schritten. Nukleasefreies Wasser auf 37 Grad Celsius vorerwärmen.

Entferne die Dichtung vom Chip. Pipettiere kräftig in jede Ecke und in der Mitte des Chips über das Gewebe, ohne es abzukratzen oder zu berühren. Sammeln Sie alle kostenlosen DNA-Freisetzungsmischungen vom Chip und übertragen Sie sie in ein 1,5- oder 2,0-Milliliter-Zentrifugenrohr.

Geben Sie 350 Mikroliter vorgewärmtes, nukleasefreies Wasser direkt auf die Chipoberfläche. Pipette kräftig mit einer kleineren Pipette und die Spitze so schräg, dass sie Kraft ausübt, ohne das Gewebe zu berühren oder den Chip abzukratzen. Kombinieren Sie das Wash mit den 400 Mikrolitern kostenlosen DNA-Freisetzungsmischung, die zuvor gesammelt wurden, sodass nur Material aus einem einzelnen Chip kombiniert wird.

Geben Sie 100 Mikroliter nukleasefreies Wasser auf den Chip. Versiegeln Sie den Stereo-Sequenzierungsträger und bewahren Sie ihn bis zum Ende des Protokolls im Kühlschrank auf. Die Einzelzellsegmentierung mittels der SAW-Pipeline wurde auf FFPE-Abschnitten erreicht, was die Kartierung auf nicht-polyadenylierte RNAs wie tRNA (TRDMT1) ermöglichte.

Interaktive räumliche Visualisierung zeigte mutmaßliche Zelltypen mit der proprietären Software StereoMap, wobei Cluster in verschiedenen Farben über einen herangezoomten Bereich des Gewebes dargestellt wurden. Die vollständige Gewebeexpression der nicht-polyadenylierten RNA TRDMT1 wurde mit StereoPi visualisiert. Die Anpassungen des Protokolls lösen Probleme, die wir bei der vollständigen Transkriptomik, räumlicher Profilierung von fetten und fragilen Geweben hatten, indem sie die Gewebeadhäsion, die RNA-Zugänglichkeit und die Handhabung von Stereo-Seqs bei diesen schwierigen Gewebetypen verbesserten.

Stereo-Seq bietet derzeit eine höhere Auflösung als andere räumliche Transkriptomikmethoden mit einer Auflösung von 500 Nanometern im Vergleich zu zwei Mikrometern. Sie bietet außerdem eine unvoreingenommene Erfassung, die für die Untersuchung der Mikrobiom-, viralen und nicht-polyadenylierten Transkripte erforderlich ist.