3' Ende Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung mit A-seq2

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Zuordnung Pre-mRNA 3' End-Verarbeitung Websites.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, mRNA mit drei Primzahlen zu erfassen und zu sequenzieren, wodurch Untersuchungen der mRNA-Prozessierung, insbesondere der Spaltung und Polyadenylierung mit drei Primzahlen, sowie die Quantifizierung der Genexpression ermöglicht werden. Das A-seq2-Protokoll und das hier vorgestellte Datenanalysepaket können dazu beitragen, Schlüsselfragen zur Erzeugung und Funktion von Transkript-Isoformen in verschiedenen Zelltypen und Geweben zu beantworten. Die Hauptvorteile der A-seq2-Methode bestehen darin, dass sie eine Sequenzierung durch lange Poly(A)dehnungen vermeidet und keine Adapterdimere erzeugt.

Für dieses Verfahren werden Zellen verwendet, die auf 80% Konfluenz gezüchtet werden. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Lysieren Sie die Zellen direkt auf der Platte, indem Sie einen Milliliter Lysepuffer pro Vertiefung hinzufügen und mit einem Gummispatel das Zellmaterial vollständig von der Plattenoberfläche lösen.

Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um das viskose Lysat aus jeder Vertiefung in ein 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen zu übertragen. Teilen Sie die DNA mit einer Ein-Milliliter-Spritze, die an einer 23-Gauge-Injektionsnadel befestigt ist. Führen Sie mehrere kräftige Auf- und Abbewegungen des Kolbens aus, bis das Lysat nicht mehr viskos ist.

Übertragen Sie das Lysat in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Schleudern Sie fünf Minuten lang bei 20.000 g und vier Grad Celsius, um den Schmutz zu entfernen. Sammle den klaren Überstand aus dem Lysat.

Fügen Sie den magnetischen Kügelchen Oligo d(T)25 hinzu und resuspendieren Sie die Mischung. Legen Sie die Schläuche für 10 Minuten auf ein rotierendes Rad. Legen Sie die Röhrchen anschließend für zwei Minuten auf ein Magnetgestell.

Entfernen Sie die klare Flüssigkeit. Geben Sie 0,8 Milliliter Puffer A in jedes Röhrchen und drehen Sie das Röhrchen zwei- bis dreimal um 180 Grad. Entfernen Sie Puffer A aus der zweiten Wäsche.

Geben Sie 0,8 Milliliter Puffer B in jedes Röhrchen und lassen Sie es zwei Minuten lang auf dem Rost. Um die gebundene mRNA aus den Kügelchen zu eluieren, entfernen Sie Puffer B, geben Sie 33 Mikroliter Wasser in jedes Röhrchen und resuspendieren Sie die Kügelchen. Erhitzen Sie fünf Minuten lang auf einem Herzblock auf 75 Grad Celsius.

Drehen Sie die Röhren sofort eine Sekunde lang und legen Sie sie auf das Magnetgestell. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen. Geben Sie 66 Mikroliter alkalischen Hydrolysepuffer in jedes Röhrchen, mischen Sie es und erhitzen Sie es genau fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius auf einem Heizblock.

Kühlen Sie die Röhren sofort auf Eis. Führen Sie anschließend die RNA-Isolierung mit einem RNA-Cleanup-Kit durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Um dieses Verfahren zu starten, fügen Sie jeder RNA-Probe 14 Mikroliter eines Polynukleotidkinase-Mastermixes hinzu.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Nach 30 Minuten laden Sie die Kinasereaktionen auf vorbereitete Spin-Säulen. Drehe die Spalten zwei Minuten lang mit dem 735-fachen g.

Entsorgen Sie die Säulen und legen Sie die Röhrchen mit den gesammelten Reaktionen auf Eis. Um die drei Primzahlen der RNA-Fragmente zu blockieren und ihre Verkettung in nachfolgenden Ligationsreaktionen zu vermeiden, fügen Sie jeder Probe 17,5 Mikroliter eines Poly(A)polymerase-Mastermixes hinzu. Eine Sekunde lang mixen und schleudern.

Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie nach 30 Minuten jeder Reaktion 32,5 Mikroliter Wasser hinzu und reinigen Sie die RNA, wie im Textprotokoll beschrieben. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Reaktionen für 10 Minuten in einen Vakuumkonzentrator geben, um das Volumen auf sechs Mikroliter zu reduzieren.

Dann fügen Sie zu jeder Reaktion 24 Mikroliter eines RNA-Ligase-Mastermixes hinzu. Inkubieren Sie die Reaktionen auf einem beheizten Mischer 16 Stunden lang bei 24 Grad Celsius, wobei das intermittierende Mischen bei eintausend Umdrehungen pro Minute erfolgt. Am nächsten Tag fügen Sie 17 Mikroliter Wasser zu jeder Reaktion hinzu und mischen Sie.

Reinigen Sie die RNA, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie die Eluiten für drei Minuten in einen Vakuumkonzentrator, um das Volumen auf 11 Mikroliter zu reduzieren. Übertragen Sie die Reaktionen auf 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen für die reverse Transkriptionsreaktion.

Fügen Sie einen Mikroliter Grundierung hinzu. In einem PCR-Cycler fünf Minuten lang auf 70 Grad Celsius erhitzen und dann fünf Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen. Geben Sie acht Mikroliter eines Reverse-Transkriptions-Mastermixes in jedes Röhrchen und mischen Sie.

Legen Sie die Röhrchen in einen PCR-Cycler. 10 Minuten auf 55 Grad Celsius und weitere 10 Minuten auf 80 Grad Celsius erhitzen. Bleiben Sie auf Eis.

Bereiten Sie Streptavidin-Kügelchen vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie die reverse Transkriptionsreaktion in die Bead-Lösung und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad. Waschen Sie die Kügelchen mit einem Magnetgestell zweimal mit Biotin-Bindungspuffer und zweimal mit TEN-Puffer.

Resuspendieren Sie die Kügelchen in 50 Mikrolitern TEN-Puffer. Geben Sie zwei Mikroliter Uracil-DNA-Glykosylase-Enzymmischung hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem Mixer mit intermittierendem Mischen. Fügen Sie jeder Reaktion 50 Mikroliter Wasser, 11 Mikroliter RNase H-Puffer und einen Mikroliter Rnase H hinzu.

Inkubieren Sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Legen Sie die Röhrchen auf das Magnetgestell und füllen Sie die Flüssigkeit mit der gespaltenen cDNA in ein neues Röhrchen um. Aufreinigung der gespaltenen cDNA mit einem PCR-Aufreinigungskit, wie im Textprotokoll beschrieben.

Legen Sie die gereinigte cDNA für acht Minuten in einen Vakuumkonzentrator, um sie auf ein Volumen von sieben Mikrolitern zu konzentrieren. Um fünf Prime-Adapter an die fünf Primzahlenden der isolierten cDNA zu ligieren, fügen Sie jeder Probe 23 Mikroliter eines RNA-Ligase-Mastermixes hinzu und inkubieren Sie sie 20 Stunden lang bei 24 Grad Celsius. Zum Schluss fügst du jeder Reaktion 70 Mikroliter Wasser hinzu.

Eine Pilot-PCR wird durchgeführt, um die optimale Anzahl von PCR-Zyklen zu bestimmen, um eine Bibliotheksamplifikation innerhalb der exponentiellen Phase zu erreichen. Pipettieren Sie Folgendes in ein 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen: 25 Mikroliter DNA-Polymerase-Mix, 20 Mikroliter Ligationsreaktion, zwei Mikroliter Wasser, 1,5 Mikroliter Forward-PCR-Primer und 1,5 Mikroliter Reverse-PCR-Index-Primer. Lassen Sie den Cycler mit folgendem Programm laufen: drei Minuten bei 95 Grad Celsius, gefolgt von 20 Zyklen à 20 Sekunden bei 98 Grad Celsius, 20 Sekunden bei 67 Grad Celsius und 30 Sekunden bei 72 Grad Celsius.

Sammeln Sie sieben Mikroliter Aliquote direkt aus dem Cycler nach den angegebenen Zyklen. Trennen Sie die Produkte auf einem 2%Agarose-Gel und visualisieren Sie die Migration der PCR-Produkte. Bestimmen Sie die Anzahl der Zyklen zu Beginn der exponentiellen Amplifikation, in diesem Beispiel 12 Zyklen, und verwenden Sie diese Anzahl von Zyklen für eine PCR-Reaktion in großem Maßstab.

Trennen Sie die Produkte von der großmaßstäblichen PCR-Reaktion auf einem 2%Agarose-Gel und schneiden Sie die Gelscheiben mit 200 bis 350 Nukleotid-DNA-Produkten aus. Extrahieren Sie anschließend die DNA aus den Gelscheiben mit dem Gelextraktionskit, wie im Textprotokoll beschrieben. In diesem Video werden nur die wichtigsten Rechenschritte gezeigt.

Näheres dazu finden Sie im Textprotokoll. Beginnen Sie damit, das Git-Repository zu klonen und in das neu erstellte Verzeichnis zu wechseln. Erstellen Sie eine Umgebung, die die Software enthält, und aktivieren Sie diese Umgebung.

Laden Sie die Genomsequenz des Organismus herunter, von der A-seq2-Daten erhalten wurden. Öffnen Sie die Konfigurationsdatei und stellen Sie die Eingabeparameter ein, wie im Textprotokoll angegeben. Starten Sie die Analyse.

Die Reaktion eines spezifischen Gens, NUP214, auf den Knockdown des HNRNPC-Proteins wurde durch die Analyse von a-seq2-Reads aus zwei Proben von HEK-293-Zellen untersucht, die entweder mit einer kleinen interferierenden Kontroll-RNA oder mit einer kleinen interferierenden HNRNPC-RNA behandelt wurden. Die Lesevorgänge, die Poly(A)Stellen dokumentierten, die von der Analysepipeline annotiert wurden, wurden im BAM-Format gespeichert, das als Eingabe für den IGD-Genombrowser verwendet wurde. Die drei Primzahlen der gelesenen Peaks, abgebildet bei mMRNA sind drei Primzahlen, die im Ensemble annotiert sind.

Die Profile deuten auf eine verstärkte Verwendung der langen UTR-Isoform mit drei Primzahlen beim HNRNCR-Knockdown hin. Sobald das A-seq-Protokoll gemeistert ist, dauert es acht Stunden oder etwa zwei bis drei Tage, wobei die Zeit für die Zellkultur und die Ligaturen über Nacht nicht mitgerechnet wird. Wenn Sie das Protokoll ausprobieren, ist es wichtig, zunächst ein Ur-Set zu entwerfen, das der an Ihrem Standort verwendeten Sequenzierungsplattform entspricht.

Sobald Sie mMRA mit drei Prime-Enden erhalten haben, können andere Methoden, wie Vernetzung und Immunpräzipitation, durchgeführt werden, um Regulatoren der Prä-mRNA-Verarbeitung mit drei Prime-Enden zu identifizieren. A-seq2 ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der RNA-Prozessierung, um die Regulation und die Folgen der alternativen Polyadenlylierung in einzelnen Zelltypen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Bibliotheken von mRNA mit drei Primzahlen generieren, Ihre Sequenzierungsdaten analysieren, neue Poly(A)stellen identifizieren und Ihre Nutzung quantifizieren.

Wir hoffen, dass A-seq2 Ihnen die Arbeit beim Start der Regulation der mRNA-Prozessierung erleichtern und zu vielen neuen Erkenntnissen führen wird.