Visualisierung von retinalen Organoiden mit zellulärer Auflösung

Unsere Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung und Untersuchung von Netzhaut-Organoiden, die als humanes In-vitro-Modell dienen, um zu untersuchen, wie sich die menschliche Netzhaut bildet, wie sich Krankheiten auswirken und wie wir sie behandeln können.

Um die Forschung im Bereich der regenerativen Medizin voranzutreiben, verwenden wir 3D-Netzhaut-Organoide in Kombination mit optischem Clearing und Immunmarkierung, um ganze Strukturen sichtbar zu machen und die besondere Organisation von Netzhautzellen mit konfokaler Mikroskopie zu untersuchen.

Die Whole-Mount-Bildgebung steht vor Herausforderungen, wie z. B. einer ungleichmäßigen Antikörperpenetration in dichten Geweben und sphärischen Aberrationen in Organoiden, die zu Oberflächen-Bias-Markierung und Fokusverlust während der Gewebevisualisierung führen.

Unsere Methode deckt retinale Zellverbindungen und Zelltypen unter 3D-Organisation auf und liefert so entscheidende Einblicke in die zugrunde liegenden Ursachen von Netzhauterkrankungen.

[Dozent] Zu Beginn erhalten Sie die Fluorophor-Aliquote, die in wasserfreiem DMSO gelöst, dehydriert und eingefroren werden. Fügen Sie 1 bis 10 Mikroliter DMSO zu einem Aliquot hinzu. Kombinieren Sie nun 50 Mikroliter sekundäres Immunglobulin G oder primären Antikörper, sechs Mikroliter eines molaren Natriumbicarbonats und ein bis fünf Mikroliter Fluorophor und inkubieren Sie 40 Minuten lang bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. Während die Reaktion fortschreitet, entfernen Sie die Deckel der Ausschlusssäulen für die Reinigungsgröße und lassen Sie den Puffer passieren. Äquilibrieren Sie die Säule, indem Sie drei Runden von zwei bis drei Millilitern PBS durch die Säule laufen lassen. Wenn die letzte Äquilibrierung vor dem Ende der Inkubation abgeschlossen ist, setzen Sie die Deckel wieder auf, um ein Ziehen zu vermeiden, und warten Sie, bis die Reaktion beendet ist. Nach der Inkubation fügen Sie 140 Mikroliter PBS zur Markierungsreaktion hinzu, um das Volumen auf etwa 200 Mikroliter zu bringen, und wirbeln Sie es vortexen. Fügen Sie die Lösung in der Mitte der Spalte hinzu und lassen Sie sie in die Spalte eintreten. Nachdem der letzte Tropfen verschwunden ist, drücken Sie die Lösung mit 550 Mikrolitern PBS. Wenn die Flüssigkeit nicht mehr fällt, eluieren Sie mit 300 Mikrolitern PBS und sammeln Sie sie in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Messen Sie die Absorption der Probe bei 280 Nanometern und bei den fluorophorspezifischen Wellenlängen, um die Antikörperkonzentration und die Markierungsverhältnisse zu berechnen. Lagern Sie die markierten Antikörper bis zu sechs Monate bei vier Grad Celsius lichtgeschützt. Fixieren Sie die Netzhautorganoide mit 4% Paraformaldehyd für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie nach dem Fixieren eine Antigen-Retrieval-Lösung über die Organoide und inkubieren Sie die Schale bei 60 Grad Celsius und leichtem Schütteln bei 30 Umdrehungen pro Minute für eine Stunde. Als nächstes permeabilisieren Sie die Organoide mit PBS, das 1% Triton X-100 enthält. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln vier Stunden lang. Blockieren Sie nun die Organoide in 2% BSA mit 0,1% Triton X-100 bei Raumtemperatur über Nacht oder für mehr als einen Tag. Am nächsten Tag fügen Sie den Organoiden verdünnte Primärantikörper hinzu. Inkubieren Sie zwei Tage lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Waschen Sie die Organoide dreimal für je 15 Minuten in Waschlösung bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Fügen Sie nun die Verdünnungslösung, die Sekundärantikörper hinzu und inkubieren Sie zwei Tage lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Nach dem Waschen der Organoide, wie bereits gezeigt, inkubieren Sie die Organoide mit Fluoreszenzfarbstoffen, die in einer Waschlösung bei Raumtemperatur verdünnt sind, eine Stunde lang unter leichtem Schütteln. Dann erneut waschen. Bereiten Sie als Nächstes 1-Propanol-Lösungen in Reinstwasser in Konzentrationen von 15 %, 30 %, 45 %, 60 %, 75 % und 90 % vor und stellen Sie jede mit Trimethylamin auf pH 9,5 ein. Die Proben werden nacheinander in ansteigenden Gradienten von 1-Propanol-Lösungen für jeweils zwei Stunden bei 30 Grad Celsius unter leichtem Schütteln dehydriert. Übertragen Sie dann die Probe in eine 100%ige 1-Propanol-Lösung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 30 Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Bereiten Sie für die Probenreinigung eine Mischung aus Benzylalkohol und Benzylbenzoat im Verhältnis von eins bis zwei vor, um BABB-Lösung herzustellen. Tauchen Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur in BABB. Aktualisieren Sie die BABB-Lösung vor dem Imaging. Positionieren Sie das Organoid mit einer Glaspipette in einer Petrischale mit Glasboden und einem Tropfen BABB und stellen Sie sicher, dass es die Oberfläche des Deckglases berührt. Verwenden Sie jetzt ein inverses konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit Objektiven mit niedriger und hoher Vergrößerung, um Z-Stack-Bilder für die zelluläre 3D-Auflösung aufzunehmen. Kalibrieren Sie die Schrittweite der Z-Stapel-Erfassung neu, indem Sie die Brechungsindex-Diskrepanz zwischen Reinigungslösung und Immersionsmedium berücksichtigen. Starten Sie nun ImageJ, aktualisieren Sie die Voxeltiefe, indem Sie Bild auswählen und auf Eigenschaften klicken, um Bildprojektionen des Z-Stapels zu erstellen. Überprüfen Sie die Tiefe des Z-Stapels, indem Sie "Bild" und dann "Stapel" und dann "Orthogonale Ansichten" auswählen, um die XY-, XZ- und YZ-Ansichten des Netzhaut-Organoids anzuzeigen. Speichern Sie die gewünschten Regionen, indem Sie auf Datei klicken und Speichern unter auswählen. Erstellen Sie abschließend eine Animation des 3D-Renderings des Z-Stapels mit Hilfe einer Verarbeitungssoftware. Fruktoseglycerin-beseitigte retinale Organoide zeigten die geringste Verbesserung der Transparenz, was die Visualisierung des Organoidkerns behinderte. Das ECI-Clearing verbesserte die Visualisierung der Netzhautschichten, konnte den organoiden Kern jedoch aufgrund anhaltender Lichtstreuung immer noch nicht sichtbar machen. Fluoclear BABB-clearierte Organoide wiesen die höchste Transparenz auf und zeigten sowohl den Kortex als auch den Kern mit konsistenter Fluoreszenz. Sowohl ECI- als auch Fluoclear-BABB-Clearing-Organoide zeigten in Hellfeldbildern aufgrund von Dehydratisierungsschritten eine sichtbare Schrumpfung. Die BABB-induzierte Schrumpfung erhöhte die Kompaktheit der Probe und ermöglichte die Verwendung von Objektiven mit hoher Vergrößerung, um tiefere Strukturen abzubilden. Die TUJ1-Immunmarkierung nach 40 Tagen in vitro zeigte eine einzelne dünne neuronale Schicht ohne sichtbare Stratifizierung. Nach 90 Tagen besiedelten die Zellen die apikale Region dicht, und nach 170 Tagen zeigte das Organoid deutliche Anzeichen einer Schichtorganisation mit einer definierten apikalen Zone. Nach 200 Tagen erstreckten sich längliche Zellprojektionen von der Oberfläche nach innen in den Kern, und das Organoid entwickelte sich nach 250 Tagen zu drei verschiedenen Netzhautschichten. Neuronale Fasern dehnten sich während der Reifung vom organoiden Zentrum in Richtung Peripherie aus und wurden in vitro um 250 Tage dicker und komplexer. Zapfen-Photorezeptoren, die blaue und grün/rote Opsine exprimieren, traten in späten Stadien auf und zeigten längliche Morphologien mit hellen Spitzen. Stäbchen-Photorezeptoren, die Rhodopsin exprimieren, wurden anhand ihrer zentralen Kerne und der peripheren Opsinverteilung identifiziert. Chx10-positive Zellen waren zunächst weit verbreitet, später aber während der Organoidreifung spezifisch in der inneren Kernschicht lokalisiert. Die endogene GCaMP6s-Expression blieb nach BABB-Clearing erhalten, wobei das GFP-Signal in der neuralen Netzhaut nach langfristiger Fixierung nachweisbar war.