Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik und Wechselwirkungen mit Synapsen in erkrankter Maus-Netzhaut

Der Forschungsbereich unseres Labors ist es, die zugrunde liegenden Mechanismen von Glaukom und Mikroglia bei der Synapsenumbildung während der Entwicklung zu untersuchen. Die aktuellen experimentellen Herausforderungen drehen sich darum, ob Mikroglia aktiv retinale Ganglienzell-Synapsen zerlegen oder ob sie nur passiv Trümmer entfernen. Beginnen Sie mit der Mausnetzhaut auf einem Filterpapier und trocknen Sie sie mit einem Labortuch.

Invertiere die Netzhaut auf eine MatTek-Petrischale. Belasten Sie die Netzhaut entweder mit Metallperlen oder einem Ring. Dann geben Sie drei bis fünf Tropfen künstliche Rückenmarksflüssigkeit hinzu.

Legen Sie die Probe unter ein rotierendes Scheibenkonfokalmikroskop und passen Sie die Einstellungen an, um die Netzhaut vorzuschauen. Sammeln Sie Bilder entlang der Z-Achse in einer Gesamttiefe von 10 bis 20 Mikrometern mit einer Schrittweite von 0,3 Mikrometern. Halten Sie das Zeitintervall zwischen den Frames bei 20 bis 30 Sekunden, um eine zuverlässige Zellverfolgung zu ermöglichen.

Um die Oberflächendarstellung der Mikroglia durchzuführen, konvertiert man die Zeitrafferdatei mit der Dateikonverter-Software in das IMS-Format. Geben Sie die Voxelgrößen basierend auf den zuvor erfassten Bildeigenschaften ein. Im Bereich der Analysesoftware klicken Sie auf den Ordner Beobachten, um die konvertierte Datei zu öffnen und sicherzustellen, dass das Bild in 3D-Ansicht ist.

Um einzelne Mikroglia zu erkennen, klicken Sie auf das Symbol "neue Oberfläche hinzufügen" in der Objekt-Symbolleiste. Wählen Sie nur ein Segment eines Interessensgebiets aus, verfolgen Sie Oberflächen über die Zeit, klassifizieren Sie Flächen und Objekt und Objekt-Objekt-Statistiken unter Algorithmuseinstellungen. Dann klicke auf den blauen Play-Button, um fortzufahren.

Wählen Sie den Kanal für das Oberflächenrendering. Optional aktivieren Sie Glatt, um die Oberflächenerschaffung zu glätten und die Oberflächendetails einzufügen. Bei der Schwellenwertung wählen Sie maschinelle Lernsegmentierung zur Zellerkennung.

Verwenden Sie unter dem Training die Werkzeuge für Hintergrund- und Vordergrund-Pinsel. Zeichnen Sie Pinselstriche, indem Sie den gewünschten Pinsel auswählen und Shift plus Linksklick verwenden. Stellen Sie sicher, dass die Interpolationsanzeige aktiviert ist, und wählen Sie dann Train und Predict aus.

Benutze den gelben Zeiger in der Mitte, um über die Z-Achse zu navigieren. Zeichne mehrere Striche über die X-, Y- und Z-Ebenen und über einige Zeitrahmen. Verwenden Sie drei bis fünf kurze Striche pro Eingang und passen Sie iterativ an, bis eine genaue Oberfläche entsteht.

Verwenden Sie das gelbe Rechteck, um als letzte Kontrolle zwischen der Trainingsanzeige und der tatsächlich erstellten Oberfläche zu wechseln. Überprüfen Sie außerdem im Zeitraffer, ob die Oberfläche mit der Zellmorphologie übereinstimmt. Wenn du fertig bist, deaktiviere Split-Objekte.

Passen Sie die Schwelle des Voxel-Histogramms an, um kleine, nicht verbundene Objekte zu entfernen, die nicht Teil der Hauptoberfläche sind. Dann bearbeite ich die Oberfläche manuell, um überflüssige Objekte zu entfernen oder Kanten mit dem Scherenwerkzeug zu schneiden. Falls gewünscht, setzen Sie eine Schwelle der für das Objekt erlaubten Lücken und wählen Sie den Tracking-Algorithmus für die bewegte Zelle aus.

Filter-Track-Objekte, die nicht mit der Hauptoberfläche verbunden sind. Nach Abschluss stellen Sie das Bildschirm der bewegten Zellen auf ein transparentes Profil ein, um die Puncta für die nächsten Schritte zu visualisieren. Um einzelne PSD95-Puncta zu erkennen, klicken Sie auf das blaue Oberflächensymbol in der Objekt-Symbolleiste.

Dann wählst du Streckenplätze über die Zeit aus, klassifiziere Spots und Objekt-Objekt-Statistiken und drückst auf Play. Wählen Sie den Quellkanal für den synaptischen Marker aus. Schalte den Slicer und andere Kanäle aus, um nur PSD95 zu visualisieren.

Verwenden Sie die Steuertaste und das Zeiger-Auswahlwerkzeug, um den XY-Durchmesser der Puncta abzuschätzen. Wähle ein paar helle Punkte, die über die Bilder hinweg bestehen, und schalte die Hintergrundsubtraktion aus. Als Nächstes fügen Sie einen Filter basierend auf der Punktqualität hinzu.

Passen Sie das Histogramm so an, dass es genaue PSD95-Punkte über alle Zeiträume hinweg enthält. Entfernen Sie die falsch-positiven Stellen per Edit. Wechsle zwischen dem Würfel oder dem Kreiscursor, um Stellen zu löschen, die nur ein oder zwei Frames dauern.

Wenn gewünscht, setzen Sie eine Schwelle der erlaubten Lücken und wählen Sie den Tracking-Algorithmus für synaptische Flecken. Filtere Spotspuren, die nicht mit echten Puncta verknüpft sind, indem sie eine Histogramm-Schwelle verwenden, um kleine Objektspuren auszuschließen. Definiere Klassifikationen mit der Klassifikation mit der kürzesten Entfernung zur Oberfläche.

Eingeschlossen als jede Puncta unter null Mikrometern, ungefähr zwischen null und 0,5 Mikrometern von der Oberfläche entfernt und unkontaktiert als 0,5 oder mehr Mikrometer. Weisen Sie Ereignissen Labels anhand der oben genannten Klassifikationen zu. Sobald die Oberflächen und Flecken Mikroglia und Punkta entsprechend repräsentieren, exportiere alle Statistiken unter dem Statistik-Reiter.

Mikroglia zeigten eine erhöhte Prozessverschiebung nach laserinduzierter okulärer Hypertonie im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Mikroglialgeschwindigkeit war bei laserbehandelten Augen signifikant höher als bei Kontrollen. Die Anzahl der Kontaktereignisse zwischen Mikroglia und PSD95-Puncta nahm nach der Laserbehandlung zu.

Zeitrafferaufnahmen zeigten, dass laserbehandelte Netzhauten eine höhere Mikroglialbeweglichkeit und erhöhte Interaktionen mit PSD95-Puncta im Vergleich zu Kontrollnetzhauten aufwiesen. Unsere bedeutenden Erkenntnisse haben gezeigt, dass die Anzahl der Mikroglia, die Komplexität und die Beweglichkeit sowie die synaptische Kolokalisierung nach vorübergehender intraokularer Druckerhöhung bei Mäusen erhöht sind. Unser Protokoll bietet Ex-vivo-Bildgebung, die hilft, Katarakt- und Hornhautopazitätsprobleme zu vermeiden und so die Einrichtung für schnellere Experimente und insgesamt einen höheren Durchsatz erleichtert.

Unsere Ergebnisse fördern die Forschung, indem sie die Visualisierung von Mikroglia-Neuron-Interaktionen, zellulärer Kommunikation und Dynamik mittels transgener fluoreszierender Linien sowie hochauflösende Zeitrafferbildgebung ermöglichen.