Mehrstufige Mikrodissektion und funktionell-strukturelle Profilierung humaner Nierenarterienäste

Unsere Forschung zielt darauf ab, standardisierte Methoden zur Isolierung und funktionellen Beurteilung menschlicher Nierenarterienäste zu etablieren, Mechanismen der vaskulären Dysfunktion aufzudecken und zielgerichtete Therapien zu leiten. Frühere Forschungen stützten sich auf Tiermodelle oder indirekte Bildgebung, bei denen unsere Drahtmyographie die Funktion der menschlichen Nierenarterie in vitro direkt widerspiegelt. Unsere Methode ermöglicht eine präzise, humanspezifische Gefäßanalyse, die Überwindung von Speziesgrenzen und die Verbesserung der translationalen Wirkstoffentwicklung.

Stellen Sie zunächst sicher, dass das Nierengewebe während des Transports vollständig in Flüssigkeit eingetaucht bleibt, um die Lebensfähigkeit des Gewebes und die strukturelle Integrität zu erhalten. Identifizieren Sie die koronale Ebene visuell, indem Sie den Nierenhilum lokalisieren und den Schnitt so ausrichten, dass er sowohl durch das Nierenbecken als auch durch die laterale konvexe Grenze verläuft. Halbieren Sie die Niere mit einem sterilen Skalpell entlang dieser koronalen Ebene, um zwei symmetrische Hälften zu erhalten, und legen Sie innere Strukturen wie die Nierenpyramiden und -säulen frei.

Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop eine Mikrodissektionsschere und eine Pinzette, um die interlobären, bogenförmigen und interlobulären Arterien in einer 10 Zentimeter großen Kulturschale mit schwarzem Boden sorgfältig zu trennen. Entfernen Sie dann vorsichtig das umgebende Gewebe und Fett aus den präparierten Arterien in derselben 10 Zentimeter großen Kulturschale mit schwarzem Boden, um sie gründlich zu reinigen. Schneiden Sie die gereinigten Arterien mit einer Mikrodissektionsschere in etwa zwei Millimeter lange Ringe für Gefäßfunktionsuntersuchungen.

Führen Sie den ersten Führungsdraht vorsichtig in einen arteriellen Ring in der Schale ein. Biegen Sie eine Seite des Führungsdrahtes in einem 90-Grad-Winkel und übertragen Sie den arteriellen Ring mit dem Draht in die Kammer. Bevor Sie den Arterienring auf dem Probenhalter befestigen, notieren Sie die Gefäßlänge.

Platzieren Sie den Ring zwischen den beiden Haltern und lesen Sie die Mikrometerskala ab, wobei eine Skalenteilung 10 Mikrometer entspricht. Subtrahieren Sie den anfänglichen Skalenwert, der gemessen wird, wenn sich die Halter nur berühren, um die Länge und Breite des Arterienrings zu berechnen. Befestigen Sie dann den arteriellen Ring mit den mitgelieferten Schrauben des Instruments auf dem Muschel-Probenhalter und ziehen Sie sie im Uhrzeigersinn fest.

Fädeln Sie dann einen zweiten Führungsdraht durch den Arterienring. Wickeln Sie den Draht im Uhrzeigersinn um die Befestigungsschrauben an beiden Enden und befestigen Sie ihn fest an der Oberfläche des Probenhalters. Wählen Sie im DMT-Menü die Option "Normalisierungseinstellungen" und stellen Sie die Okularkalibrierung auf einen Millimeter pro Teilung, den Zieldruck auf 13,3 Kilopascal, den IC1/IC100 auf 0,9, die Online-Mittelungszeit auf drei Sekunden und die Verzögerungszeit auf 60 Sekunden ein.

Wählen Sie den Kanal aus, der der Zielarterie entspricht, und öffnen Sie den Normalisierungsbildschirm aus dem DMT-Menü. Geben Sie in den entsprechenden Feldern die Endpunkte des Gewebes ein, da a1 gleich Null und a2 die gemessene Gefäßlänge in Millimetern ist. Geben Sie den Drahtdurchmesser als 40 Mikrometer ein und geben Sie den Mikrometerwert von der Skala ein.

Klicken Sie auf Punkt hinzufügen, um die Daten zu speichern. Wenden Sie nun passive Dehnung an und warten Sie drei Minuten. Geben Sie den neuen Mikrometermesswert als nächsten Punkt ein und klicken Sie auf Punkt hinzufügen.

Geben Sie fünf Milliliter 60er Kaliumionenlösung in die Kammer, um eine kaliumvermittelte Kontraktion des Gefäßes zu induzieren. Um die 60-Kalium-Ionen-Lösung auszuwaschen, fügen Sie dreimal fünf Milliliter Krebslösung hinzu. Um die Phenylephrin-induzierte, konzentrationsabhängige Kontraktion zu bewerten, wenden Sie kumulatives Phenylephrin in halblogarithmischen Schritten von 10 hoch neun bis 10 hoch vier molaren Potenzen an.

Waschen Sie die Kammer für zusätzliche Drogentests mindestens fünfmal mit warmen fünf Millilitern Krebslösung, bis die Spannung wieder auf den Ausgangswert zurückkehrt und mindestens 10 Minuten lang stabil bleibt. Die Arteria interlobaris wurde erfolgreich aus dem Nierenmark präpariert, wobei eine dicke Gefäßwand und das umgebende Fettgewebe zu sehen waren, die zur Erhaltung der strukturellen Integrität vorsichtig entfernt werden mussten. Die Arteria arcuatus wurde am kortikomedullären Übergang isoliert und wies eine dünnere Gefäßwand und eine gewölbte Trajektorie auf.

Es wurde die interlobuläre Arterie identifiziert, die linear durch die Nierenrinde verläuft, eine sehr dünne Wand aufweist und eng mit dem kortikalen Gewebe integriert ist. Die histologische Analyse zeigte, dass die Arteria interlobäris die dickste Gefäßwand mit einer ausgeprägten Adventitia aufwies, während die Arteria archuatus und die Arteria interlobuläris zunehmend dünnere Wände und weniger glatte Muskelschichten aufwiesen. Die arterielle Normalisierung beinhaltete wiederholte mechanische Dehnung und kaliuminduzierte Stimulation, wodurch stabile Ausgangsspannungsbedingungen über die Proben hinweg geschaffen wurden.

Die kumulative Zugabe von Phenylephrin von 10 hoch neun bis 10 hoch von minus vier molaren Konzentrationen induzierte dosisabhängig zunehmend stärkere Kontraktionen in den arteriellen Ringen. In den vorkontrahierten Arterien von Phenylephrin führte eine Erhöhung der Acetylcholinkonzentrationen von 10 hoch minus acht bis dreimal 10 hoch minus fünf molaren zu einer konzentrationsabhängigen Vasodilatation.