Mikrofluidischer Chip für axonale Verletzungsmodelle, Aufbau und Ermöglichung von Multi-Omics-Analysen

Wir haben groß angelegte mikrofluidische Chips entwickelt, um Multiomics-Analysen zu ermöglichen, mit dem Ziel, den Stoffwechselmechanismus von Neuronen nach axonaler Verletzung zu veranschaulichen. Wir nutzen hauptsächlich die Mikrofluidik, die Stoffwechselflussanalyse und die Transkriptomik, um die Erforschung der Stoffwechselmechanismen von Neuronen während der axonalen Schädigung und Regeneration voranzutreiben. Wir fanden heraus, dass es metabolische Unterschiede zwischen kortikalen Neuronen bei verschiedenen Entwicklungskrankheiten gibt und dass junge Neuronen nach äußeren Verletzungen einen metabolischen Umbau durchlaufen.

Der Hauptvorteil unseres Protokolls liegt in dem Design der größeren mikrofluidischen Plattform und den Betriebsstandards, die eine genaue Multiomik und die Größe von Millionen von Zellen ermöglichen. Übertragen Sie zunächst die PDMS-Basis und das Härter in ein Zentrifugenröhrchen. Legen Sie das Zentrifugenröhrchen mit der Mischung in einen Zentrifugalrührermischer.

Bei 2.000 g zweimal vier Minuten lang zentrifugieren, um zu mischen und zu entgasen. Gießen Sie 13 bis 15 Gramm des entgasten PDMS in die mikrofluidische Form, wobei Sie sicherstellen, dass der Boden der Form vollständig bedeckt ist. Legen Sie nun die Form in einen Vakuumexsikkator und verwenden Sie dann eine Vakuumpumpe, um die Luft fünf bis 10 Minuten lang zu evakuieren, um Blasen gründlich aus dem PDMS zu entfernen.

Klopfen Sie mit einem Gummiball vorsichtig auf die Oberfläche des PDMS, um alle verbleibenden Oberflächenblasen aufzubrechen. Die Form in einen Heißluftofen geben und bei 80 Grad Celsius 100 Minuten backen, um das Polydimethylsiloxan auszuhärten. Sobald das PDMS vollständig ausgehärtet ist, schieben Sie die Spitze eines Skalpells vorsichtig unter den Rand des PDMS, um es vorsichtig anzuheben und von der Form zu trennen.

Mit einem Biopsiestanzer mit einem Durchmesser von 2,0 bis 2,5 Millimetern werden Löcher in das PDMS für die Infusion des Kulturmediums und die Zellbeladung gebohrt. Entfernen Sie alle Oberflächenverunreinigungen mit Klebeband vom PDMS, legen Sie es dann in eine saubere Glasschale und wickeln Sie es zur Aufbewahrung mit Aluminiumfolie ein. Vor dem Experiment autoklavieren Sie das mikrofluidische Gerät fünf Minuten lang bei 121 Grad Celsius und 101 Kilopascal, um die Sterilität zu gewährleisten.

Legen Sie ein Deckglas, das für herkömmliche mikrofluidische Geräte vorgesehen ist, in eine 35-Millimeter-Kulturschale. Geben Sie zwei Milliliter 0,1 Milligramm Poly-D-Lysin-Lösung pro Milliliter in die Schüssel. Inkubieren Sie das Gericht bei 37 Grad Celsius für sechs Stunden oder über Nacht.

Holen Sie die Poly-D-Lysin-Lösung nach der Inkubation vorsichtig zur Wiederverwendung oder zur ordnungsgemäßen Entsorgung zurück. Geben Sie nun zwei Milliliter steriles Reinstwasser in die Schüssel. Drehen Sie es 50 Mal im Uhrzeigersinn, gefolgt von 50 Mal gegen den Uhrzeigersinn.

Saugen Sie das Wasser mit einer Vakuumpumpe an, die an eine sterile Pipettenspitze angeschlossen ist, und sammeln Sie den Abfall in einem Behälter für flüssige Abfälle. Lassen Sie die Deckbezüge nach Abschluss aller Wäschen vor Gebrauch in einer Biosicherheitswerkbank an der Luft trocknen. Platzieren Sie den autoklavierten Mikrofluidik-Chip mit einer sterilen Pinzette mit feiner Spitze in der Mitte der Glasoberfläche, wobei die Mikrokanäle nach unten zeigen.

Drücken Sie den Chip vorsichtig mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze auf die Glasoberfläche, um eine vollständige Haftung zu gewährleisten. Markieren Sie als Nächstes die linke Kammer mit einem Punkt, indem Sie einen Permanentmarker verwenden, um das Soma-Fach zu kennzeichnen. Aspirieren Sie 10 Mikroliter der neuronalen Suspension mit einer 10-Mikroliter-Pipette und geben Sie die Suspension dann langsam in die Ladeöffnung über dem markierten Soma-Kompartiment ab.

Vergewissern Sie sich, dass die Flüssigkeit ordnungsgemäß in den unteren Behälter der linken Kammer fließt. Bringen Sie die Kulturschale für 20 Minuten in einen befeuchteten Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist. Halten Sie die Schale nach der Inkubation unter ein 20-faches Mikroskop, um die Medienfülle vom Soma-Kompartiment zum axonalen Kompartiment durch die Mikrokanäle zu bestätigen.

Pipettieren Sie nun 150 Mikroliter neuronales Basalmedium in den oberen Port des axonalen Kompartiments. Geben Sie auf ähnliche Weise 150 Mikroliter des vollständigen neuronalen Mediums in die obere Öffnung des Soma-Kompartiments. Gießen Sie anschließend 20 Milliliter Reinstwasser in eine 150-Millimeter-Kulturschale, um eine Feuchtigkeitskammer zu schaffen.

Stellen Sie die 35-Millimeter-Kulturschale in die große Schale, übertragen Sie dann das gesamte Kultursystem in den Inkubator und halten Sie es für die erforderliche Dauer. Verwenden Sie eine 10 Zentimeter breite Petrischale, um das großflächige mikrofluidische Gerät zu platzieren. Wählen Sie je nach experimentellem Bedarf entweder Vollkanal- oder Intervallkanal-Seeding, da jede Methode unterschiedliche axonale Verletzungsprotokolle erfordert.

Nachdem die Aussaat abgeschlossen ist, geben Sie fünf Milliliter vollständiges Neuronenkulturmedium in die Petrischale, um das Neuronenwachstum aufrechtzuerhalten. Füllen Sie eine angemessene Menge des neuronalen Basalmediums in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen für die spätere Verwendung. Stellen Sie ein mikrofluidisches Gerät mit kortikalen Neuronen auf eine saubere Bank.

Trocknen Sie den Boden der 35-Millimeter-Kulturschale mit fusselfreiem Papier ab und saugen Sie dann mit einer 200-Mikroliter-Pipette das Medium aus den beiden rechten Seitenlöchern des mikrofluidischen Geräts ab. Schließen Sie als Nächstes einen Vakuumpumpenschlauch an eine sterile, filterfreie 200-Mikroliter-Pipettenspitze an. Schalten Sie die Vakuumpumpe mit einer Saugleistung von 60 Litern pro Minute ein und richten Sie die Spitze auf den Verbindungspunkt zwischen dem unteren Loch der Axonendkammer und der Kammer, um das alte Medium abzusaugen, was zu einem Axonbruch aufgrund von Unterdruck führt.

Setzen Sie die Pipettenspitze wieder auf und ziehen Sie 150 Mikroliter neuronales Basalmedium und fügen Sie es langsam durch das untere Loch der rechten Kammer hinzu. Nach der viermaligen Addition und Aspiration wird durch frisches vollständiges neuronales Medium ersetzt, dann das alte Medium aus dem Seitenloch des Zellkörpers aspiriert und bei Bedarf frisches vollständiges neuronales Medium hinzugefügt, das Arzneimittel enthält. Legen Sie das mikrofluidische Gerät zusammen mit der Kulturschale in eine 150-Millimeter-Kulturschale und kultivieren Sie für die erforderliche Zeit, z. B. 24 Stunden, weiter.

Bei manueller axonaler Verletzung säen Sie Neuronen in alle Kammern des mikrofluidischen Großgeräts. Inkubieren Sie das Gerät bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid für drei Tage. Nehmen Sie am siebten Tag in vitro die Kulturschale mit dem mikrofluidischen Gerät aus dem Inkubator und stellen Sie sie auf einen sterilen Tisch.

Bereiten Sie ein Mikroskop mit 20-facher Vergrößerung vor und sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 75 % Ethanol. Halten Sie eine sterile gefilterte Pipettenspitze von 10 Mikrolitern in der Hand und identifizieren Sie Axonbündel in den ursprünglichen Mikrokanälen unter Mikroskopführung. Führen Sie mit der Pipettenspitze Längskratzer entlang jedes Axonbündels durch.

Beobachten Sie den Axonbruch unter dem Mikroskop in Echtzeit. Die Mikrokanäle eines mikrofluidischen Standardgeräts ermöglichen das Wachstum von Axonen, aber nicht von Somas, wie die Beta-3-Tubulin-Färbung nach sieben Tagen in vitro bestätigte. Die neuronale Dichte zeigte keinen signifikanten Unterschied nach axonaler Verletzung, was auf keinen beobachtbaren neuronalen Tod hindeutet.

Für Multiomics-Analysen wurde ein großflächigen, mikrofluidisches Gerät mit dreidimensional erweiterbarem Design entwickelt. Sowohl ungelochte als auch perforierte PDMS-Repliken hafteten sicher auf 10 Zentimeter großen Schalen oder Leiterplatten. Axonale Schäden, die durch Kratzen der Pipettenspitze induziert wurden, führten zu deutlich durchtrennten Axonen mit gestörter Morphologie, im Gegensatz zu intakten Axonen vor der Verletzung.

Die axonale Regeneration wurde sowohl sechs Stunden als auch 24 Stunden nach der Verletzung beobachtet, während unverletzte Axone stabil blieben. Die Konzentration neuronaler Proteine stieg signifikant von 1420,4 Mikrogramm pro Milliliter zu Studienbeginn auf 1748,9 Mikrogramm pro Milliliter nach sechs Stunden und 1823,7 Mikrogramm pro Milliliter 24 Stunden nach der Verletzung. Die RNA-Ausbeuten von Kontroll- und Axon-verletzten Gruppen waren nahezu identisch.

Die RNA-Sequenzierung ergab 595 verletzungsspezifische Gene und 609 kontrollspezifische Gene, wobei 17.471 Gene von den Gruppen gemeinsam genutzt wurden. Die Analyse des KEGG-Signalwegs identifizierte eine signifikante Hochregulation der oxidativen Phosphorylierung, der Reaktion reaktiver Sauerstoffspezies, der Autophagie und der TCA-Zykluswege nach der Verletzung.