Chirurgisches Protokoll für ein großes, wiederverschließbares Schädelfenster, das longitudinale, multimodale elektrophysiologische Aufzeichnungen des Maus-Default-Mode-Netzwerks ermöglicht

Das Default Mode Network oder DMN ist ein entscheidendes, groß angelegtes Netzwerk, das an einer Reihe kognitiver Funktionen und neuropsychiatrischen Störungen wie Depressionen beteiligt ist. Die Untersuchung der komplexen Dynamik des DMN in Tiermodellen liefert unschätzbare Einblicke in seine Funktion sowohl in gesunden als auch in pathologischen Zuständen. Eine erhebliche Herausforderung bestand jedoch darin, stabile, langfristige und groß angelegte elektrophysiologische Aufzeichnungen von den mehreren tiefen und verteilten Knoten, dem DMN, in wachen, sich verhaltenden Mäusen zu begeben.

Hier stellen wir ein neuartiges zweiphasiges chirurgisches Protokoll vor, das im Labor von Eero Castren entwickelt wurde. Diese Technik schafft ein großes, langlebiges und wiederverschließbares Schädelfenster, das wiederholte Längsaufnahmen von über 1.000 Elektrodenkanälen gleichzeitig ermöglicht. Dies wird erreicht, indem oberflächliche Mikroelektrokortikographie, Mikro-ECoG, mit zwei Neuropixel-Sonden kombiniert werden, was einen beispiellosen Zugang zum Default Mode Network ermöglicht.

Dieses Video bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zu diesem robusten chirurgischen Eingriff von der Tierpräparation und Kopfplattenimplantation bis hin zur Schaffung des chronischen Schädelfensters und gewährleistet so eine hochwertige, langfristige Datenerfassung für die Netzwerk-Neurowissenschaftsforschung. Alle gezeigten Verfahren wurden vom Nationalen Versuchsrat Finnlands genehmigt und entsprechen der Europäischen Richtlinie zum Schutz von Tieren, die zu wissenschaftlichen Zwecken verwendet werden. Phase 1, Tiervorbereitung und Einnistung der Kopfplatte.

Um dieses Verfahren durchzuführen, beginnen Sie damit, alle notwendigen chirurgischen Materialien und Geräte vorzubereiten. Betäuben Sie die Maus mit 4 % Isofluran und halten Sie die Anästhesie bei 1,5 bis 2,5 % bei einer Sauerstoffflussrate von 0,5 Litern pro Minute aufrecht. Rasieren Sie das Fell vom Kopf ab und legen Sie das Tier auf ein kontrolliertes Heizkissen, das mit einem internen Temperatursensor ausgestattet ist, das während des gesamten Eingriffs die Körpertemperatur bei 37 Grad Celsius hält.

Tragen Sie eine Kohlenhydratsalbe für die Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Sichern Sie die Maus im stereotaktischen Rahmen, sodass der Schädel flach liegt, und verabreichen Sie präoperative Analgetika und entzündungshemmende Mittel mittels subkutaner Injektionen, Carprofen, Buprenorphin und Dexamethason. Desinfizieren Sie die rasierte Stelle mit Povidon-Jod-Lösung und injizieren Sie Lidocain-Adrenalin-Lösung als lokales Betäubungsmittel unter die Haut der Kopfhaut.

Machen Sie einen kleinen queren Schnitt an der Earline und vergrößern Sie den Schnitt schrittweise, um die Oberseite der Schädeloberfläche vollständig freizulegen. Reinigen Sie den freiliegenden Schädel sorgfältig mit Aceton, bis das gesamte sichtbare Periost entfernt wurde, um eine starke Haftung des Implantats sicherzustellen. Verwenden Sie eine stumpfe, kreisförmige Skalpellklinge, um eventuelle restlichen Periost- und Bindegewebefragmente zu entfernen, die durch die Aceton-Spülung nicht vollständig behoben wurden.

Mit dem stereotaktischen Gerät markieren Sie eine rechteckige Fläche von 4 Millimetern mal 7,6 Millimetern auf dem Schädel relativ zum Bregma. Das Rechteck sollte sich auf beiden Seiten um zwei Millimeter seitlich von Bregma erstrecken, drei Millimeter rostral und caudal 4,6 Millimeter. Anschließend markieren Sie die beiden intrakraniellen Probe-Einführungsstellen auf der rechten Hemisphäre.

Markiere die Rostralsondenstelle 1,66 Millimeter vorne und 1,95 Millimeter seitlich von Bregma und die Schwanzsonde 2,2 Millimeter hinter und 1,9 Millimeter lateral von Bregma. Anschließend wird ein Kreuzmuster über alle freiliegenden Knochenflächen außerhalb des vorgesehenen Fensterbereichs mit einer chirurgischen Klinge der Nummer 11 graviert und flache, aber definierte Rillen von etwa 0,2 bis 0,4 Millimetern Tiefe erzeugt, um ein einheitliches Gitter aus etwa einem mal einem Millimeter Quadraten zu bilden. Erstellen Sie einen feinen Kleberapplikator, indem Sie eine sterile 30G-Nadel an die Spitze eines Wattestäbchens setzen und die Nadel V-förmig biegen.

Geben Sie Cyanoacrylatkleber in ein Einweg-Plastik-Wiegeboot und tauchen Sie den Applikator in den Kleberbehälter. Kleber auf jede freiliegende und gravierte Knochenoberfläche auftragen und nicht mehr als eine einzelne Ablagerung pro Stelle auftragen, damit die Abdeckung gründlich, aber niemals übermäßig ist. Lass den Kleber sieben Minuten trocknen, bevor du weitermachst.

Für die Implantation der Referenzfassung wählen Sie die Bohrstelle über der Position des linken Kleinhirns, um sichtbare oberflächliche Gefäße zu vermeiden. Bohren Sie das Pilotloch in fünf bis zehn Sekunden langen Stößen mit einem runden Stahlgrat mit 20.000 bis 25.000 Schuss pro Minute, bis das Loch durchsichtiger wird und einen hellrosa Schimmer sichtbar wird. Setzen Sie die vergoldete Referenzfassung in das Pilotloch, sichern Sie sie mit Cyanoacrylatkleber und verstärken Sie die Verbindung mit UV-aushärtendem Zahnkleber.

Härten Sie den Zahnklement eine Minute lang mit einer LED-Aushärtungslampe aus. Anschließend wird eine kleine Menge UV-aushärtendes Zahnzements auf die Spitze des freiliegenden Rostralknochens gelegt und die Kopfplatte unter den Schädel gelegt, sodass eine Kante auf dem Zahnbetongerüst ruht, ausgehärtet um die Referenzfassung, und die gegenüberliegende Kante auf dem frischen Rostralzement-Dab. Stelle sicher, dass die Kopfplatte zentriert und nivelliert ist.

Verstärken Sie die Struktur, indem Sie Zahnkleber um die Basis der Kopfplatte auftragen und den gravierten Knochen sowie die Referenzfassung umkreisen, bis ein kontinuierliches, versiegeltes Gehäuse um den Rand des zukünftigen Schädelfensters entsteht. Zum Schluss habe ich den Zahnklement mit dem LED-Aushärtungsstift für eine Minute ausgehärtet. Sobald der Zement vollständig ausgehärtet ist, lassen Sie die Maus aus der Narkose erwachen.

Die erste Phase ist nun abgeschlossen. Lassen Sie die Maus mindestens 48 Stunden erholen, bevor sie zur nächsten Phase übergeht. Phase 2, Chronische Schädelfenster-Erstellung.

Die zweite Phase erfordert dieselben Werkzeuge und Medikamente wie die erste Phase, abgesehen von der lokalen Betäubung. Zusätzlich erfordert diese Phase eine sterile, dünne PDMS-Membran, kalte, künstliche Gehirnspinalflüssigkeit, die auf Eis gehalten wird, ein Elastomer-Silikondichtmittel und eine maßgefertigte 3D-gedruckte Schutzkappe. Mindestens 48 Stunden nach der ersten Operation wird die Maus mit Isofluran erneut betäubt, auf das Heizkissen auf dem stereotaktischen Rahmen gelegt und die präoperativen Medikamente wie in der ersten Phase verabreicht, abgesehen vom Lidocain-Adrenalin-Lokalanästhetikum.

Beginnen Sie mit dem Zahnbohrer mit dem Zahnbohrer entlang der in Phase 1 markierten rechteckigen Umrandung, beginnend mit 25.000 Schuss pro Minute, wobei das Bohrgerät in einem 90-Grad-Winkel zur Knochenoberfläche gehalten wird, und führen Sie ein oder zwei leicht tiefere Durchgänge entlang der rechteckigen Kanten durch, um eine anfängliche Schnittrille zu schaffen. Bohren Sie flache Rillen in den Knochen und den Zahnzement neben dem Schädelfenster an den beiden Sondeneinsatzkoordinaten. Diese Rillen dienen als dauerhafte visuelle Orientierungspunkte, die nach der Entfernung des Knochenlappens sichtbar bleiben und zur reproduzierbaren Umpositionierung der intrakraniellen Sonden in nachfolgenden elektrophysiologischen Sitzungen verwendet werden.

Tragen Sie während des Bohrens regelmäßig eiskalte, sterile künstliche Gehirnspinalflüssigkeit auf, um thermische Schäden am darunterliegenden Kortex zu vermeiden und Blutungen zu minimieren. Reduziere die Bohrgeschwindigkeit schrittweise auf 20.000 Schuss pro Minute, während der Knochen dünner wird. Bohren Sie weiter entlang des rechteckigen Randes, bis der Knochen innerhalb der Kontur etwa zu 90 % verdünnt ist.

Bohren Sie nicht komplett durch den Schädel. Wechsle auf den fein gebogenen Dura-Haken. Führen Sie die Spitze mit äußerster Vorsicht unter den Rand des dünnen Knochens ein und schieben Sie den Haken entlang des Fensterrands, wobei Sie vorsichtig die Knochenlappen vom umliegenden Schädel und darunterliegendem Gewebe lösen.

Heben Sie die erfolgreich abgelöste Knochenlappe vorsichtig mit dem Dura-Haken in einer Rück- bis nach vorne gerichteten Richtung bis etwa 35 Grad über der Schädeloberfläche. Greifen Sie die angehobene Kante mit der Pinzette und schwingen Sie sanft nach links und rechts, bis sich die Platte vollständig löst. Reinigen Sie vorsichtig die freiliegende Stelle von geronnenem Blut mit wiederholten Waschen von eiskalten ACSF.

Setzen Sie eine einzelne sterile vorgefertigte PDMS-Membran direkt unter die Duraloberfläche, sobald die Blutung nachgelassen hat. Wenn sie richtig dimensioniert ist, bedeckt sie das Fenster genau und haftet passiv an der Dura, sodass sie flach am Gehirn gelagert wird. Versiegeln Sie die Kraniotomie durch Auftragen von Silikonversiegelung.

Füllen Sie jede Spalte zwischen dem zahnhaltigen Zementgehäuse und dem inneren Rand der Kopfplatte aus, sodass die Ränder der BDMS-Membran vollständig umgeben und überlappen. Bringen Sie eine maßgefertigte 3D-gedruckte Schutzkappe mit einer kleinen Menge Cyanoacrylatkleber auf die Kopfplatte, um das Fenster zwischen den Aufnahmesitzungen zu schützen. Die Maus ist nun bereit für die Genesung und sollte in ihren Stammkäfig gebracht werden, um individuell untergebracht zu werden, um Schäden am Implantat zu verhindern.

Eine erfolgreiche Operation führt zu einem klaren, transparenten Fenster über dem Kortex mit sichtbarer Gefäßstruktur und minimalen Anzeichen von Entzündungen oder Infektionen. Diese Klarheit kann über 21 Tage aufrechterhalten werden, was langfristige Längsschnittstudien ermöglicht. Rohe elektrophysiologische Signale, die durch das chronische Fenster aufgezeichnet wurden, behielten über die gesamte Längszeitlinie hinweg eine hohe Qualität.

Hier werden repräsentative breitbandige Mikro-ECoG-Spuren, die aus einem posterioren retrosplenialen Gitter entnommen wurden, sowie simultane intrakranielle lokale Feldpotentialspuren, die aus einem oberflächlichen kortikalen Kanal stammen, am ersten Aufzeichnungstag und 21 Tagen danach nebeneinander gezeigt. Tag-21-Aufnahmen zeigen vergleichbare Signalamplitude, spektralen Gehalt und das Fehlen von Bewegungs- und Rauschartefakten im Vergleich zu Tag-0-Aufnahmen desselben Tieres, was bestätigt, dass weder das chronische Vorhandensein der PDMS-Membran und Silikonversiegelung noch die wiederholten duralen Punktionen nachweisbare Degradation der Oberfläche oder der intrakraniellen Sondensignalqualität in oberflächlichen kortikalen Schichten verursachten, wo zuerst eine Verschlechterung erwartet wird. Die primäre Validierung dieser Technik ist die Erfassung stabiler, hochwertiger multimodaler elektrophysiologischer Daten über die Zeit.

Das wiederverschließbare Fenster ermöglicht das wiederholte Einsetzen von Sonden, um von denselben neuronalen Populationen über Wochen hinweg aufzuzeichnen. Über das Alphaband hinweg zeigen Phasensperre-Matrizen, berechnet aus Kanälen entlang der kaudalen, hochdichten intrakraniellen Elektrodensonde, eine stabile funktionelle Architektur zwischen dem Ausgangspunkt und der Sitzung am 21. Tag nach der Behandlung. Dies zeigt eine reproduzierbare Wiedereinsetzung an denselben kortikalen Ort statt einer formalen Nachverfolgung derselben einzelnen Neuronen.

Obwohl eine geringfügige Interzessionstranslation des Schafts eine gleiche Einheitsbehauptung ausschließt, bleibt die aggregierte laminare und regionale Struktur der Alphaband-Wechselwirkungen erhalten, was dafür spricht, dass das chronische Fenster eine longitudinale Abtastung desselben Funktionskreises ermöglicht. Um direkt zu überprüfen, dass das chronische Fenster reproduzierbares laminares Targeting derselben tiefen Strukturen über Sitzungen hinweg unterstützt, wurden aus den LFP-Kanälen der Sonden aktuelle Quelldichte oder CSD-Karten berechnet. Stimulus-evokierte CSD-Profile zeigen, dass die erwarteten laminaren Senkensignaturen, einschließlich des prelimbischen Kortex und des vorderen cingulaten Bereichs, zwischen den Sitzungen erhalten bleiben.

Die laminaren Leistungsprofil-Überlagerungen zwischen den beiden Sitzungen sind über die Sitzungen hinweg sehr ähnlich, wobei die Pearson-Korrelation 0,81 beträgt. Die im sekundären motorischen Kortex beobachteten Unterschiede sind wahrscheinlich auf Bewegungsunterschiede zwischen den Aufnahmen zurückzuführen. Da CSD-Plotting anatomische Informationen enthält, kann sie innerhalb der Sitzung eine nicht-terminale Anzeige liefern, welche Hirnregionen jede Sonde derzeit abtastet, unabhängig von postmortalen Gewebefärbungen.

Die Reproduzierbarkeit der Oberflächen-Mikro-ECoG-Platzierung über Sitzungen hinweg wird unabhängig von der intrakraniellen CSD-Anzeige quantifiziert. Bandbegrenzte räumliche Leistungskarten, die aus dem Mikro-ECoG-Gitter an Tag 0 und Tag 21 berechnet werden, werden überlagert, und die pixelweise Korrelation der beiden Karten wird separat für die rostralen und kaudalen Untergitter berechnet. Die Korrelationen mit Subgrid-Profilen bleiben hoch, und die räumlichen Barcodes der beiden Sitzungen haben sichtbar dieselben kortikalen Leistungs-Hotspots sowohl auf der rostralen als auch auf der kaudalen Hälfte des Arrays kolokalisiert.

Eine sinusförmige Ausrichtungsschlange, die durch das durchscheinende Gitter zusammen mit den eingravierten Knochenrillen an den Einsatzkoordinaten der Sonde sichtbar ist, unterstützt daher die millimetergroße Reproduzierbarkeit der Mikro-ECoG-Platzierung über das 21-tägige Längsintervall. Um die Technik weiter zu validieren, wurden etwa vier Wochen nach der Kraniotomie-Operation immunhistochemische Färbungen für GFAP und IBA1 in postmortalen Hirnschnitten durchgeführt. GFAP werden von Astrozyten exprimiert, die bei reaktiven Gliosen wie Hirnverletzungen oder Entzündungen hochreguliert werden.

IBA1 hingegen wird durch Mikroglia exprimiert, die während neuroinflammatorischer Prozesse aktiver sind. Die Validierungskohorte bestand aus Tieren, bei denen die vollständige zweistufige Operation durchgeführt wurde und das Schädelfenster anschließend dreimal an den postoperativen Tagen 0, 21 und 22 wieder geöffnet wurde. In dieser Kohorte wurden jedoch weder Mikro-ECoG-Einführungen noch intrakranielle Sondeneinführungen durchgeführt.

Das Fenster wurde zwischen den Sitzungen wieder versiegelt, wie bei einer elektrophysiologischen Aufzeichnung. Diese Kohorte isoliert daher den entzündlichen Beitrag des chronischen Fensters und wiederholter Duralexposition von etwaigen durch Sonden verursachten Gewebeschäden. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in keinem der Marker zwischen der Kontrollgruppe ohne Operation und der Fahrzeuggruppe, die operiert wurde, beobachtet.

Diese repräsentativen Mikroaufnahmen zeigen keine qualitativen Hinweise auf reaktive Gliose oder mikrogliale Aktivierung in der Region direkt unter dem Fenster. Allerdings wurde ein leichter Anstieg der Mikroglial- und Astrozytenaktivierung in der Nähe der Sondenbahn bzw. in der Hemisphäre der Sondeneinfügung beobachtet, was wahrscheinlich auf die zu hohe Einfügungsgeschwindigkeit der intrakraniellen Sonde zurückzuführen sein könnte. Eine erfolgreiche Operation führt zu einem klaren, transparenten Fenster über dem Cortex mit minimaler Entzündung.

Nach der chronischen Behandlungsphase kann eine gewisse Hirnschwellung auftreten. Dies kann durch sorgfältige Überwachung und, falls nötig, durch die Verabreichung zusätzlicher Schmerzmittel behandelt werden. Für Aufnahmen entfernen Sie einfach die Kappe und das Versiegelungsmittel, platzieren die Mikro-ECoG-Gitter und Neuropixel-Sonden und beginnen Sie mit der Datenerfassung vom wachen, sich verhaltenden Tier.

Zusammenfassend bietet dieses zweiphasige chirurgische Protokoll eine zuverlässige und äußerst effektive Methode, um ein großes, chronisches Schädelfenster bei Mäusen zu schaffen. Die Hauptvorteile des Verfahrens sind die minimale Schädigung der Dura und die große Belichtung, die sie bietet, was für die gleichzeitige Platzierung sowohl der Oberflächen-Mikro-ECoG-Gitter als auch mehrerer tiefgründiger Neuropixel-Sonden entscheidend ist. Diese Methode ermöglicht eine beispiellose longitudinale Untersuchung der netzwerkweiten elektrophysiologischen Dynamik im DMN und anderen großräumigen Schaltungen.

Sie öffnet die Tür zu tieferen Untersuchungen neuronaler Grundlagen komplexer Verhaltensweisen und der Pathophysiologie von Gehirnerkrankungen und trägt letztlich zur Entwicklung neuartiger Therapeutika bei.