Spectrometría de masas de tándem

La espectrometría de masas en tándem vincula múltiples etapas de espectrometría de masas para aislar primero una biomolécula y luego determinar aspectos de su composición química. Las biomoléculas tienen estructuras grandes y complejas, lo que dificulta la determinación de su composición molecular. La espectrometría de masas en tándem selecciona una molécula de interés que luego se fragmenta en múltiples subunidades, lo que puede ayudar a dilucidar su identificación y secuencia. Este video mostrará los conceptos de la espectrometría de masas en tándem, un procedimiento general y algunos de sus usos en bioquímica.

La espectrometría de masas en tándem comienza como un instrumento típico de espectrometría de masas: con una fuente de iones, que convierte la muestra en iones, y un analizador de masas, que separa los iones en función de su relación masa-carga. Un analizador de masas común, el cuadrupolo, solo permite el paso de iones con una relación específica, mientras que los otros chocan contra las varillas del aparato. La especie permitida a través de ella, llamada ion precursor, es la biomolécula de interés. El ion se mueve a una celda de colisión, generalmente otro cuadrupolo, donde se aplica energía para fragmentar el ion en un patrón predecible.

Estos fragmentos se mueven a otro analizador de masas, como un tiempo de vuelo, que separa estos "iones producto". A continuación, los iones producto se envían al detector, como en un instrumento MS normal. En el caso de una proteína desconocida, el espectro resultante contiene numerosos fragmentos superpuestos, lo que dificulta la generación de una secuencia completa y definitiva de la biomolécula. Sin embargo, el patrón espectral es único para una proteína determinada. El software de análisis compara el espectro con una base de datos de secuencias de péptidos conocidas, dilucidando la proteína desconocida a partir de los fragmentos superpuestos.

Dependiendo de la muestra y del grado de fragmentación deseado, son posibles varios métodos de fragmentación. Los patrones de fragmentación dependen de cómo se transfiere la energía, su cantidad y cómo se distribuye a través del ion precursor. La energía se puede transferir a través de partículas neutras, radiación o electrones. El uso de átomos neutros, un proceso llamado disociación inducida por colisión o CID, se escinde principalmente en el enlace peptídico entre los aminoácidos, ideal para su identificación.

Ahora que se han cubierto los conceptos básicos de la técnica, echemos un vistazo a la espectrometría de masas en tándem CID que se utiliza para estudiar un componente de las envolturas de células bacterianas.

Como en todos los experimentos de espectrometría de masas, el primer paso es ionizar la muestra. En el caso de las biomoléculas, esto se suele hacer con desorción láser asistida por matriz o ionización por electropulverización. A continuación, la señal de iones precursores se optimiza mediante el ajuste de la óptica de iones. Una vez hecho esto, se aísla el objetivo y se elige el método de fragmentación, como CID.

La fuerza de un voltaje aplicado, que acelera el ion precursor en la celda de colisión, afecta el grado de fragmentación. Este voltaje se incrementa hasta que el precursor tiene aproximadamente un 10% de abundancia en comparación con el ion producto más alto. Se adquieren múltiples espectros y se promedian hasta que se logra una relación señal-ruido suficiente. El número de exploraciones necesarias depende de la intensidad de la señal del ion precursor original y puede oscilar entre 3 y 300.

El analito de este ejemplo, el lípido A de Escherichia coli K-12, tenía 19 fragmentos principales después de la CID. La estructura general del lípido A es bien conocida, lo que permite al software reconstruir la composición específica de la muestra.

Ahora que hemos visto el procedimiento, veamos algunas de las formas en que se utiliza la espectrometría de masas en tándem en bioquímica.

Un modo de escaneo común en la espectrometría de masas en tándem es el monitoreo de reacción seleccionado, o SRM. En SRM, ambos analizadores de masas se fijan a una relación masa-carga seleccionada, centrándose en precursores e iones de productos específicos. Debido al alto grado de sensibilidad del SRM, se pueden utilizar y comparar los espectros de los patrones peptídicos de concentración conocida con los de las muestras desconocidas, lo que permite cuantificar las proteínas de interés.

Las proteínas se modifican comúnmente después de la traducción, generalmente mediante la adición de grupos funcionales como grupos metilo, grupos fosfato o azúcares, conocidos como glicanos. Estos son importantes en los procesos de señalización celular, dilucidando cómo las células se comunican entre sí. Debido a que la espectrometría de masas en tándem fragmenta las proteínas en componentes más pequeños, es posible determinar la ubicación del PTM en el fragmento específico o incluso en un aminoácido. Algunas modificaciones, como la acetilación y la trimetilación, son difíciles de diferenciar solo por la masa, por lo que la separación cromatográfica se realiza antes de la espectrometría de masas.

Muchos analitos en la sangre del paciente se encuentran en concentraciones por debajo del límite de detección para la espectrometría de masas típica. Otra ventaja de SRM es que descarta todos los iones del producto excepto uno, lo que aumenta la sensibilidad y mejora el límite inferior de detección hasta 100 veces. En este ejemplo, el fármaco inmunosupresor, tacrolimus, podría detectarse a niveles de 1 ng/mL.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la espectrometría de masas en tándem. Este video describió la teoría del instrumento, repasó un procedimiento general y explicó algunas de las formas en que la técnica se utiliza actualmente. ¡Gracias por mirar!