核輸送の1分子イメージング

Summary

単一分子顕微鏡は、核輸送への新たな洞察を提供approch。

Abstract

単一分子蛍光顕微鏡のアプローチの有用性は過去10年間、生物学的反応を理解する上で非常に無駄であることが実証されています。細胞内の深い高時間空間分解能で分子間相互作用の調査は、ために個々の分子から生じる本質的に弱い信号に挑戦し続けている。 Yangらによる最近の作品。狭い視野落射蛍光顕微鏡、単一分子レベルでの核 - 細胞質間輸送の可視化を可能にすることを示した。信号に依存し、独立した貨物分子の単一分子のアプローチ、このような核輸送の時間と効率性などの重要な動力学、、によって得られている。ここでは0.4ミリ秒と12 nmの改良された時空間分解能を持つ方法論的アプローチのためのプロトコルを説明した。改良された解像度は、私たちは半無傷の細胞で核膜孔複合体（NPC）を通じて一時的な能動輸送と受動拡散のイベントをキャプチャすることができました。我々は、このメソッドは、他の結合と細胞内トラフィッキングのイベントを解明することに使用されることを期待しています。

Protocol

1。単一分子の実験用セルのシステムの準備

1. 事前に少なくとも一週間は、37℃で融解し、5 mLのメディアで25cm ^2の培養フラスコに入れて在庫からのHeLa細胞株の新鮮な培養を開始し、37℃で細胞をインキュベート° C内で5％CO ₂ 24時間インキュベーターとは、細胞に最適な条件を提供するために少なくとも3回それを分割する。しかし、細胞は著しく減速する彼らの成長率の傾向のために20回以上に分割すべきではない。 HeLa細胞は、以前は遺伝的に核膜孔の膜タンパク質POM 121に融合したGFP（緑色蛍光タンパク質）を有するように設計された。それは、核膜の正確な局在に必要である。
2. 実験前日には、単一分子の実験を目的とした細胞を滅菌ペトリ皿に入れ、オートクレーブしたカバースリップ上に分散させる必要があります。カバースリップは4.5 g / Lのグルコースを添加したDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地、グランドアイランド、NY）、862 mg / Lのグルタミン- I、15 mg / mLのフェノールレッド、100 U / mlペニシリン、100μg/mLに懸濁しすべきストレプトマイシンおよび10％新生児ウシ血清。培養液量は一様にすべての面に分散、カバースリップあたり1mLのはずです。カバースリップを持つこれらのペトリ皿は、CO ₂インキュベーターに入れ、前の実験を24時間保持されます。単一分子の実験に適していることが細胞培養のための順序でカバースリップ上でコンフルエントの細胞は、核輸送を受けて関心の洗浄バッファーとタンパク質の良い自由を提供するために、70％を超えないようにしてください。
3. 実験日に、フローチャンバーは上部カバーがスペーサーとしてシリコーングリースの二行と一緒にスリップ添加することにより構築した。それは細胞が準備中に乾燥させないことを確認することが不可欠です。我々は通常、実験用の2つの異なる条件を可能にするためつのカバースリップで行われた2つのチャンバーを持つことを好む。トップカバーは、約6平方ミリメートルはキムワイプで上下逆さまに置かれたようにダイヤモンドナイフでカットガラス製カバースリップの小さな細片を放出します。シリコーングリースの二行は、細かくしっかりとグリースビーズの大きさを制御するために、パラフィルムで接続されているピペットの先端を持って10 mLのプラスチック製の注射器でカバースリップの彼のエッジに沿って配置された。
4. HeLa細胞 - 細胞コートスライドは、防滴で乾燥させ、家庭アルミ削り出しのフレームに接着剤としてのグリースを搭載した - 気性、顕微鏡の試料ホルダーにス​​ライドを保持するために提供。
5. グリース2行の上部カバースリップは、フローチャンバーを形成し、その後、先の尖ったピンセットで拾い、その後細胞でコーティングされたスライドを介して反転された。比較的堅調に添付ファイルはカバースリップの油を塗ったエッジ上に軽く押すことによって行われた。
6. 我々は一つのセルでコーティングされたスライドに2つの別々のチャンバーを作ったので、クロスコンタミネーションを防ぐために、良好な密封を提供することが不可欠です。この目的のためにシリコーングリースのいくつかの行が離れて密封するために上からスライドの下部にチャンバーとの間に適用されました。グリースの数行は、チャンバーの外側に置かれた。
7. DMEM培地を乾燥から細胞を防ぐために、フローチャンバーに追加されました。溶液の流量は、フローチャンバーの出口側の流体を吸収するために小片ろ紙によって促進された。安定した手で、解決策は、片手でフローチャンバーの一方の側にマイクロピペットで、同時に追加される可能性、およびろ紙で反対側に吸収。
8. 建設後は、スライドの下部には、水で2回、接液綿棒で洗浄した後、二回100％エタノールを持つ。
9. スライドを顕微鏡にマウントされると、細胞は2 × 25μLインポートバッファ（20mMのHEPES、110 mMのKOAc、5mMのNaOAc、2mMのMgOAc、1mMのEGTA、pH7.3）で洗浄した。細胞は、インポートバッファの2 X 25μL40μg/ mLのジギトニンで〜2分間透過処理し、2 X 25μLインポートバッファ（20mMのHEPES、110 mMのKOAc、5mMのNaOAc、2mMのMgOAc、1mMので再度洗浄360 kDa）は、EGTA、pHは7.3）1.5％ポリビニルピロリドン（PVPで補足。それは明るいフィールドを使用してリアルタイムで透過性を監視する必要があるかもしれません。 PVPは、原子核の浸透圧膨張を防ぐためにジギトニン後にすべてのインポートバッファのソリューションに含まれていた。一緒に制御された細胞質環境との完全な核は、、私たちはステップによって複雑な核輸送のステップを明らかにすることができる非常に単純化された輸送システムを提供します。システムで実施された前回のアンサンブルと、単一分子の実験は、核輸送に大きな洞察を提供している。

2。核輸送の実験に不可欠な蛋白質の調製

1. 従来の細菌の形質転換によって大腸菌 （JM109）の特殊な株がの原因となる遺伝子を過剰発現するために設計された興味の上記のタンパク質の生産とは、-80℃で株式に保存されています（NLS - 2xGFPために私達はInvitrogen社pTrcHisBベクトルを使用）。 大腸菌細胞をアンピシリンの5μL（U 1000）を追加してLB培地5mlのに転送し、37℃で一晩振とうしながら好気的に栽培されている表現蛍光または貨物タンパク質の凍結ストックの白金耳または〜50μL225℃rpmでC。
2. 24時間後、飽和500μlの培養液をLB培地500mL中に転送され、37℃のインキュベーターで振盪さ5〜6時間のために250μLIPTGの添加（イソプロピル_ - D - 1 -チオガラクトピラノシド）に続いて、別のインキュベート5-6時間。 IPTGはlacZ遺伝子が関心とIPTGの遺伝子で置換されるlacオペロンの転写は、遺伝子の発現を誘導するために使用されるトリガー代謝物乳糖なので、これは必要です。
3. 培養物を15分間12000rpmで冷却高速遠心機でスピンされ、上清は廃棄されます。次いで、細胞を、ボリュームがペレットの1グラム当たり10 mLのに基づいて行われるべきCelLytic B（アフィニティー精製と分析に適したタンパク質の迅速かつ効率的な抽出のCelLytic Bの結果。）40mLに再懸濁する。メルカプトエタノール28μlを細胞溶解の後に目的のタンパク質を消化からプロテアーゼを無効にするにはジスルフィド結合とphenylmethanesulphonylフッ化物の400μlを破るに追加されます。タンパク質抽出物は、目標のために分析する前に劣化しないようにすること、"プロテアーゼのカクテルは"また（2 mg / mlのトリプシンインヒビターの400μLは0.2 mg / mLのロイペプチン0.2 mg / mLのペプスタチンAの400μLの400μL）に追加されます興味のある。我々はその後、400μLの1Mイミダゾールを追加、5 phosphodinucleotideおよびオリゴヌクレオチドに不要な一本鎖および二本鎖DNAを分解するために使用されるDNase Iのクロマトグラフィーカラムと1mMの中でビーズの表面に付着したNiイオンに結合したHisタグ融合タンパク質を溶出するために使用されますフラグメント。
4. 冷却遠心機で60分間10000 rpmで反応するための十分な時間、スピンを可能にするために、氷上で30分間暗所で混合物をかき混ぜなさい。上清を回収し、クロマトグラフィーの準備のために3分間最大速度でマイクロ遠心チューブに回転し、溶解緩衝液で洗浄、混合が終了するまで回転し、洗濯を繰り返すことによるNi - NTA（QIAGEN社ニッケル - ニトリロ三酢酸のSuperflowの）で注入を行うどんな青みの明確な。ゆっくりと60分間氷上で暗いコンテナで得られた混合物をかき混ぜなさい。
5. 次のように、12分画を流れるカラムクロマトグラフィーを実行します。最初のフラクションは、前のステップでのNi - NTAと混合10mlの上澄み液のフロースルーです。二つ目は溶解バッファーを10 mL（50 mMのリン酸ナトリウム、300mMのNaCl、20mMのイミダゾール、pH8.0）に、バッファの第10 mLの（10mMイミダゾール、100mMのNaCl、pH8.0）に、4番目と残りがないです。溶出緩衝液0.5ml（250mMイミダゾール、100mMのNaCl、pH8.0）に
6. SDS - PAGEポリアクリルアミドゲルを調製し、分数の4μLと5倍SB（300mmのトリスpH6.8、25％のBME、10％SDS、50％グリセロール）の1μLを混合することにより我々のサンプルを準備する。標準のために我々は、Invitrogen社の100 kbのDNAラダーを使用していました。ロードする前に我々は5分間我々のサンプルを煮沸。ロードした後は我々は60分間120Vでゲルを走った。その後、我々は、脱色、染色し、最終的に80℃で2時間の特別なゲルの乾燥機で乾燥。
7. 私たちは、その後、ゲル上で結果を閲覧して最良の結果が得られた分画に位置する。私たちの目的のタンパク質に応じて、バンドは、タンパク質の大きさにそれぞれ配置する必要があります。この画分をMonoQとスーパーデックス200（アマシャムファルマシア社）と、さらにタンパク質の精製のために選択する必要があります。
8. 濃度は、毎回、5分のための14回転で10Kの細孔サイズとNanosepフィルタで最も集中して分画を回転溶出バッファーでそれを洗浄することにより行われます。さらにタンパク質標識の手順については、BSAのアッセイを利用して、最終タンパク質濃度を決定するために必要です。
9. NLS - 2xGFPの本質的な緑色蛍光は細胞の自家蛍光とにより、その乏しい光安定性とオーバーラップスペクトルに核輸送の1分子イメージングに利用することはできません。従って、我々は、TCEPトリス（2削減後の50 mMリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム150mMの中、室温で2時間システイン-反応性有機色素（Molecular Probes社からAlexa555またはアレクサ647マレイミド）の過剰の貨物の分子にラベルを付ける - 20分間カルボキシエチル）。反応は2 - メルカプトエタノールでクエンチし、タンパク質溶液は、無料の色素を除去するために透析した。

3。単一分子顕微鏡

1. 私たちの顕微鏡では、GFPフィルターを持つHe - Neレーザ（メレスグリオ）、水銀ランプが点灯し、設定1.4 NA 100倍の油浸対物レンズ（UPLSAPO 100XO、オリンパス）、35 mWの633 nmの装備オリンパスIX81を含むセットアップチップの乗算ゲイン電荷結合素子カメラ（カスケード128 +、ローパーサイエンティフィック）と目データ収集と処理のためのe Slidebookソフトウェアパッケージ（インテリジェントイメージングイノベーション）。光チョッパ（ニューポート）は、レーザー励起のオンオフモードを生成するために使用されていました。 GFPとAlexa647の蛍光はそれぞれ水銀ランプと633nmのレーザーで励起された。緑色と赤色の蛍光発光は、ダイクロイックフィルター（Di01-R405/488/561/635-25x36、Semrock）と発光フィルター（NF01-405/488/561/635-25X5によってフィルタ処理された同じ目的、回収した。 0、Semrock）と同一のCCDカメラによる撮像。
2. 単一分子の実験では、我々は輸送時間よりも長くなるように単一の貨物の分子の蛍光退色時間を有効にしてください。退色時間を決定するには、0.1 nMの貨物分子が非特異的吸着に起因する30分後の位置ずれと不動になるガラスカバー上にプレーされています。その後、蛍光の経時変化を測定する。興味の退色時間の蛋白質に応じてそのためマレイミド、照度および照明領域と反応することができるシステインの数に基づいて異なるでしょう予備退色を誘発しないために調整する必要がありますし、Alexa 647のディスプレイで標識その貨物の分子を保証する貨物より長くのための蛍光は、NPCをと対話します。
3. 膜透過した細胞の細胞内のインポートの実験のために、貨物と本質的な輸送因子は、一緒に追加されました。典型的な輸入貨物の反応は、1mMのGTP、0.5μM含まインポーチンを、0.5μMのインポーチン- 1、2μMが実行され、受動輸送のための10KDaデキストランの促進輸送、0.1 nMの1μMのNTF2 ..蛍光貨物濃度はバルクの実験で> 100 nMであった、と単分子アッセイのための100 pMの〜を。これらの濃度で、貨物の> 99％がインポーチンとインポーチンと複合体を形成するものと期待された。輸送速度は、落射蛍光（のみ相対速度が重要である場合）または共焦点蛍光顕微鏡（絶対速度だけが必要な場合）によりモニターした。
4. 最初の核膜の位置は、NEの写真を撮るためにGFPのフィルターのセットでHBO水銀ランプを係合することにより広視野落射蛍光顕微鏡によって測定した。行または列内のピクセルの強度はガウス分布でフィットしたほぼ垂直NEになります。ピクセル輝度の特定のセットのためのガウスのピーク位置は、その行と列のNEの位置と考えられていた。このようなガウスの一連のピーク位置は、全体画像内のNEのパスをもたらし、2次多項式を適合させた。
5. NEがローカライズされるとそれは完全にphotobleachedになるまで、それは633 nmのHe - Neレーザーを利用するすべての自家蛍光を取り除くために不可欠である、通常以上の60秒で十分です。
6. 試料分子は、PVPの1.5％溶液中で維持する必要がありますし、混合物を25リットルの体積でフローチャンバーに添加し、ろ紙の芯を適用するチャンバーを介してドラッグ。フォーカスが容易に活発な動きによって破壊することができるので、全く心配は右の核膜局在化の後に透過性細胞への輸入貨物の蛋白質の添加により注意が必要です。
7. とすぐに貨物の分子が追加されると、633 nmのHe - Neレーザは、通過する分子の輸送の軌跡を照らすために使用されていました。光チョッパ（ニューポート）は、レーザーの高出力密度による退色、同様にNEに近づくために、非photobleached単一分子の新しい部分を可能にするためにを避けるために、約5 Hzで従事する必要があります。単一分子の転座の一連のビデオが2500 Hzまで行くことができる、高速CCDカメラで撮影してください。

4。代表的な結果

正しく実行される、我々のプロトコルは、私たちは、透過性HeLa細胞POM 121細胞の核膜孔複合体と相互作用する単一の貨物分子の転座を示す一連のビデオを収集することができました。 （図1）。我々は、画像に着手し、安定的にGFP - POM121を表現ジギトニン透過性HeLa細胞におけるNPCを通じてデキストランの分子の過渡的な輸送の手順を追跡する。細胞は標識されたデキストランの分子の低濃度でインキュベートした。核の赤道面は、488 nmの水銀灯の光により励起されたGFP蛍光の緑の輪の鮮明な画像で焦点に持って来られた。 GFP - NEの長時間露光は、NEの中間平面をローカライズするための優れた信号対ノイズ（SNR）比を得るために私達が可能になります。以前10kDaのデキストランの分子は、500または1000 Hzの検出のフレームレートで約20〜40 nmの空間分解能で約2ミリ秒以内にNEを介して拡散することが見出された。そのような時空間分解能は、受動拡散のためのより多くの空間情報を解明するのに十分ではないNPCを通じてデキストランの分子の1〜2拡散ステップのキャプチャが可能になります。よりよいspatiでNPCの中でデキストラン分子のより細かいステップをキャプチャするにはより微細な拡散の手順をキャプチャするために2500 Hzの迅速な検出のフレームレートを適応させる（I）、及び（ii）を得るために、単一分子からのより多くの光子を励起するための高い照明光学密度を採用する：otemporal解像度、我々は2つ​​の主要な改善を実施しているより高い空間分解能。これらの改善は、私たちが12 nmと400ミリの時空間分解能で100キロワット/ cm ²の照度で633 nmのレーザー光でNEを越えalexa647標識デキストランの分子の過渡拡散の複数のステップをキャプチャすることができます。

図1に示すように、デキストランの分子の典型的なトランスポートイベントの一連の静止イメージを記録した。個々の通過デキストランの分子の空間的な軌跡を追跡することにより、NEを介して拡散の細かいステップが区別されていました。我々は、NEとの相互作用イベントの約30％は、発信元と宛先の区画が認識しているあることがわかった。 NEを介して拡散後の核内の最後または同様の状況は、輸出のイベントで発生したNEとのやり取りの後に細胞質に戻って移動：：原子核から始まるデキストランの分子その中でも、細胞質からNEへの移行デキストラン分子は2つの宛先を持っている細胞質を入力するか、またはNEとの対話の後に核内に戻って拡散する。このようなイメージのシリーズは、NPCに関してだけでなく、NPCを介して分子の滞留時間に関する時間情報を持つ単一分子の空間的位置に関する情報が含まれています。 NEのエリアの周りにデキストランの分子の軌跡を解析することにより、輸送時間、効率と入口の周波数を決定することができます。我々の仕事における輸送時間は、インポートまたはエクスポートの時間として識別することができます。彼らは平均がインポートまたはエクスポートを受けるNPCの中にデキストランの分子の滞留時間として定義されました。インポートまたはエクスポートの効率は、完全なインポートまたは完全で失敗に終わったイベントの合計以上の輸出のイベントの割合として定義されました。インポートまたはエクスポート入り口の周波数は、秒間にNEと相互作用する分子の数を指します。

図1。NEを介してデキストランの分子の典型的なトランスポートイベントの選択されたビデオフレーム。 （A）細胞質から核のイベント。単一のデキストランの分子（赤色スポット）がNE（緑のピクセルの線）と相互作用、細胞質から始まり、核内に終わった。イベント（青い線とオープンドット）の軌道を決定し、NE（黒線）と重ね合わせていた。緑と赤の線は、細胞質と核の側のNEから100nmの距離を表します。 C、細胞質。 N、核。スケールバー：2 mmです。 （B）細胞質から細胞質のイベント。 （C）核対核のイベントを。 （D）核から細胞質のイベント。

Discussion

ケアは、実験中にNEと単一分子の適切な共存を保証するために注意する必要があります。信号が低い貧しいラベルまたは退色が原因である場合は特に、高い信号対雑音比を提供することも重要です。ローカライズの精度は、バックグラウンドノイズ（アウトフォーカス蛍光、CCDの読み出しノイズ、暗電流とその他の要因に起因する）によって制限されます。