Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تأمين تدفق الأحماض النووية الخلوي ومضان في الموقع التهجين (LNA تدفق FISH) : طريقة لاكتشاف الحمض النووي الريبي البكتيرية الصغيرة

Published: January 10, 2012 doi: 10.3791/3655
Automatic Translation
1, 1
1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory

Summary

وصفت رواية عالية الإنتاجية الأسلوب الذي يتيح اكتشاف والكميات النسبية للRNA الصغيرة والتعبير مرنا من الخلايا البكتيرية واحد باستخدام مسابر مؤمن الحمض النووي وتدفق الخلوي ومضان

Abstract

مضان التهجين في الموضع (FISH) هي تقنية قوية التي تستخدم لكشف وتوطين محددة تسلسل الحمض النووي في البيئة الخلوية. من أجل زيادة الإنتاجية ، يمكن الجمع بين سمك مع التدفق الخلوي (تدفق FISH) لتمكين الكشف عن تسلسل الحمض النووي المستهدف في الآلاف من الخلايا الفردية. نتيجة لذلك ، تدفق الأسماك يوفر ميزة واضحة على مدى lysate / الفرقة القائمة على الكشف عن الحمض النووي الأساليب لأن كل خلية يعامل بوصفه مراقبة مستقلة ، مما يسمح أقوى التحليلات الإحصائية والتباين. وقد دفعت هذه الصفات استخدام أساليب السمكية وتدفق الأسماك في عدد من التطبيقات المختلفة ، وكانت فائدة هذه الأساليب أثبتت بنجاح في تحديد هوية طول التيلومير ، 1،2 الخلوية والتعبير الجيني 3،4 ، ورصد تكاثر الفيروس في الخلايا المصابة 5 ، والبكتيرية تحليل المجتمع والتعداد6.

تقليديا ، وقد تم الكشف عنها من خصوصية وسائل السمكية وتدفق الأسماك بواسطة المجسات قليل النوكليوتيد الحمض النووي. لكن في الآونة الأخيرة ، ازداد استبدال تحقيقات مع قليل النوكليوتيد النظير DNA الحمض النووي وتحقيقات السمكية وتدفق الأسماك كلا من حساسية وخصوصية كل تقنية نظرا لارتفاع درجات الحرارة في ذوبان (T م) من هذه الأحماض النووية لالنظير الطبيعي 7،8 . الحمض النووي مؤمن (LNA) تحقيقات هي نوع من التناظرية التي تحتوي على الحمض النووي النيوكليوتيدات LNA ارتفعت طوال تسلسل الحمض النووي الريبي أو 9،10. عندما يقترن مع تدفق الأسماك ، تحقيقات LNA سبق أظهرت التحقيقات أن يتفوق الحمض النووي التقليدية 7،11 واستخدمت بنجاح لكشف حقيقية النواة مرنا 12 و RNA فيروسي في الخلايا الثديية 5.

هنا نوسع هذه القدرة ، ووصف تدفق الأسماك LNA الأسلوب الذي يسمح للكشف محددة من الحمض النووي الريبي في الخلية البكتيريةق (الشكل 1). على وجه التحديد ، ونحن مهتمون في الكشف الصغيرة غير الترميز التنظيمية الحمض النووي الريبي (الحمض الريبي النووي الذواب) والتي استقطبت اهتماما كبيرا في السنوات القليلة الماضية حيث تم العثور عليها لتكون بمثابة العناصر التنظيمية الرئيسية في العديد من العمليات الخلوية الحرجة 13. ومع ذلك ، هناك أدوات محدودة لدراسة sRNAs والتحديات للكشف عن الحمض الريبي النووي الذواب في الخلايا البكتيرية ويرجع ذلك جزئيا إلى الحجم الصغير نسبيا (عادة 5-30 النيوكليوتيدات في الطول) وفرة منخفضة من جزيئات الحمض الريبي النووي الذواب فضلا عن صعوبة في العمل العام مع أصغر الخلايا البيولوجية بدرجات الأغشية الخلوية. في هذه الطريقة ، ونحن تصف التثبيت وpermeabilzation الشروط التي تحافظ على بنية الخلايا البكتيرية والسماح للتغلغل تحقيقات LNA فضلا عن الخطوات التي تمكن من تضخيم إشارة الكشف محددة من الحمض الريبي النووي الذواب فرة منخفضة (الشكل 2).

Protocol

1. تحقيقات LNA والتصميم التجريبي

  1. تصميم تحقيقات LNA التي هي مكملة عكس الحمض الريبي النووي الذواب الخاص كتب / مرنا أو يكون لهم العرف مصممة على www.exiqon.com . في حالة استخدام الخيار تصميم العرف ، وسوف تعرف التسلسل ، ولكن ليس التشويك LNA النمط. إضافة لكل مخلفات LNA في الحمض النووي الريبي أو قليل النوكليوتيد النتائج إلى زيادة في م تي من بين اثنين و 10 درجة مئوية لتهجين المزدوجة LNA RNA - 14. من الناحية المثالية ، ينبغي أن تكون مصممة تحقيقات LNA بين 20-25 النيوكليوتيدات في الطول (أطول تحقيقات أكثر صعوبة في تجميع) ويملك تي م بين 85-90 درجة مئوية لمدة RNA التهجين.
  2. بعد تصميم تسلسل ، استخدم BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi أو مقارنة تسلسل التحقيق إلى قاعدة البيانات المحلية لضمان التحقيق غير محددة فقط لالحمض الريبي النووي الذواب الخاص / مرنا من الفائدة.
  3. عندما يأمر LNA التحقيق ، إضافة إلى تعديل البيوتين - TEG لانهاء 5 'من قليل النوكليوتيد LNA. وbiotinylation ضروري لمرحلة ما بعد التهجين تلطيخ مع المتقارن streptavidin صباغة. فمن الممكن لإضافة هذا التعديل إلى 3 'نهاية إذا لزم الأمر ، ولكن بالإضافة إلى 5' نهاية أقل تكلفة ، وينبغي أن يؤدي إلى زيادة الغلة.
  4. وينبغي أن تدرج ثلاثة عناصر تحكم السلبية في الأسلوب : (ط) هو لا LNA "الخاضعة لسيطرتها التي لا يتم إضافة مسبار LNA خلال الخطوة التهجين ، (ب) في" لا صبغة "التحكم فيه المهجنة التحقيق في LNA لم يتم الكشف عن الحمض الريبي النووي الذواب الهدف لكن الحدث تهجين نظرا لغياب وصمة الفلورسنت ، والسيطرة (ج) 'مرنا غير أعربت الحمض الريبي النووي الذواب /' إلى أن يستخدم مسبار LNA التي تستهدف الحمض الريبي النووي الذواب غير موجودة أو غير وأعرب في النظام لرصد غير محددة التهجين.
  5. التحقيق LNA محددة هنا هو مكمل لCsrB وقد سرنا وتسلسل 5' - البيوتين - TEG gTccAttTccCgtCctTagCagC - 3 "(مونومرات في LNAالأحرف الكبيرة).
  6. عقب استلام LNA مجفف بالتجميد ، resuspend مع nuclease خالية من المياه إلى 50 ميكروغرام / مل وتخزينها في 10-20 aliquots ميكرولتر -20 درجة مئوية في

الحلول

  • 8 ٪ paraformaldehye (منهاج العمل) ، وحمض الخل بنسبة 10 ٪ في برنامج تلفزيوني : مزيج 1 مل PFA 32 ٪ ، و 400 ميكرولتر حامض الخليك و 400 PBS 10X ميكرولتر ، ودرجة الحموضة = 7.4 و 2.2 مل من الماء nuclease خالية. لaliquots المجمدة ، وتجميد استخدام مرة واحدة في aliquots -20 درجة مئوية دون حمض الخليك.
  • 60 ٪ كبريتات ديكستران الحل : إضافة كبريتات ديكستران 6.0 g لأنبوب مخروطية 50 مل ويضاف الماء إلى الحجم النهائي من 10 مل. هذا الخليط الحرارة إلى 65 درجة مئوية في حمام مائي حتى يتم حل كبريتات ديكستران (قد تستغرق 1-2 ساعة). قد تحتاج إلى مياه إضافية تضاف طوال عملية solubilization للحفاظ على حجم 10 مل. قسامة كبريتات ديكستران 60 ٪ وتخزينها في حل -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. تثبيت

  1. حصاد 1x10 8 خلايا bioluminescent
  2. بيليه الخلايا البكتيرية بواسطة الطرد المركزي في 2300 x ج لمدة خمس دقائق. تجاهل طاف بواسطة pipetting وresuspend الخلايا في 400 ميكروليتر من PBS 1X.
  3. إلى هذا الخليط ، إضافة 400 ميكرولتر من paraformaldehye 8 ٪ (PFA) وحامض الخليك 10 ٪ في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (1X PBS) الحل المزيج جيدا ، واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية خلط مرة واحدة بعد خمس دقائق. يتم تنفيذ كافة حضانات ، ما لم يذكر خلاف ذلك ، في حامل أنبوب ساخنة. وينبغي إعداد الحل PFA الطازجة أو المستخدمة من aliquots المجمدة بعد إضافة حامض الخليك. بارافورمالدهيد هو مثبت يشابك أن حelps للحفاظ على مورفولوجيا الخلايا والاحتفاظ RNA داخل الخلايا.
  4. بيليه الخلايا من هذا الخليط بواسطة الطرد المركزي في 4500 x ج لمدة دقيقتين وإزالة طاف بواسطة pipetting. ينبغي لجميع الخطوات المستقبلية التي تتطلب استخدام الطرد المركزي ضبط نفس (7K ، 2 دقيقة). ومن المهم أن نلاحظ أن الطرد المركزي التالية يجب إزالة supernatants بواسطة pipetting والصب لا.
  5. غسل الخلايا مرتين مع 400 PBS 1X ميكرولتر وresuspend النهائي بيليه الخلية في 400 برنامج تلفزيوني 1X ميكرولتر. الآن يتم إصلاح الخلايا ويمكن تخزينها في 4 درجات مئوية في 400 برنامج تلفزيوني 1X ميكرولتر لمدة تصل إلى سبعة أيام.

3. إثيل pyrocarbonate العلاج

  1. إعداد 400 ميكروليتر من محلول 0.1 ٪ من pyrocarbonate إثيل (DEPC) في برنامج تلفزيوني 1X (400 ميكروليتر من هذا الحل هو حاجة لكل عينة لفحصها وفقا لذلك المقياس لذلك). وينبغي إعداد الحل DEPC جديدة من الأسهم DEPC. DEPC العلاج بواسطة carbethoxylation RNases يعطل ويقلل منإشارة الخلفية.
  2. إضافة 400 ميليلتر من الحل DEPC 0.1 ٪ إلى كل عينة الخلية البكتيرية الثابتة ومزيج جيد من قبل pipetting. احتضان هذا الخليط على 25 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة. غسل الخلايا مرتين مع 400 ميكرولتر 1X PBS ، بيليه الخلايا (7K ، 2 دقيقة) وإزالة طاف.

4. Permeabilization

  1. إضافة 1،0 ملغ من الليزوزيم إلى 1 العازلة تريس - EDTA مل (10 ملي تريس ، 1 ملم EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0) للتوصل إلى حل ملغ / مل 1.0. وينبغي إعداد هذا الحل الطازجة. إضافة 800 ميكروليتر من محلول الليزوزيم 1 ملغ / مل إلى الخلايا ، مزيج دقيق من قبل pipetting واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع خلط في بعض الأحيان. بيليه الخلايا (7K ، 2 دقيقة) وإزالة طاف. الليزوزيم بمثابة كاشف permeabilization بواسطة hydrolyzing الحاضر ببتيدوغليكان في جدران الخلايا البكتيرية.
  2. تعد 3،0 ميكروغرام / مل حل K بروتين في TE العازلة. وينبغي إعداد هذا الحل الجديد من 20 ملغ / مل K بروتيناز الأسهم التي تم تخزينها في -20 درجة مئوية.بروتين كاف هو الأنزيم البروتيني الذي يساعد على هضم سيرين مجموعة متنوعة من البروتينات ويساعد على الوصول للتحقيقات والكواشف إلى الحمض النووي الريبي.
  3. إضافة 800 ميكرولتر من 3.0 ميكروغرام / مل حل K بروتين الخلية إلى بيليه ومزيج دقيق من قبل pipetting. في احتضان 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع vortexing في منتصف الطريق من خلال الحضانة.
  4. بيليه الخلايا (7K ، 2 دقيقة) ، وإزالة طاف ويغسل خلايا مرة واحدة مع 400 PBS 1X ميكرولتر. بعد إزالة طاف يغسل ، resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X 400 ميكروليتر وإضافة 100 ميكرولتر من إعادة تعليق جديد الى أربعة أنابيب 1.5 مل microcentrifuge. بيليه الخلايا (7K ، 2 دقيقة) وإزالة طاف.

5. تهجين

  1. إعداد 100 ميكرولتر من التهجين العازلة (HB) لكل عينة. وأدلى غبطة formamide تتكون من 50 ٪ من حيث الحجم ، و 10 ٪ من الكتلة كبريتات ديكستران (إضافة 16.7 ميكرولتر من محلول كبريتات ديكستران 60 ٪ لكل ميكرولتر 100) ، والحل 1X دينهارت وفوسفات الصوديوم 50 درجة الحموضة 7.0 ملي ،2X سترات الصوديوم (SSC) ، و 20 ميكروغرام من الحمض النووي المنفصمة السلمون الحيوانات المنوية (SSSD) و 20 ميكروغرام الحمض الريبي النووي النقال الخميرة.
  2. كل واحد من مكونات HB له هدف مختلف. Formamide يخفض من درجة حرارة انصهار الدوبلكس الحمض النووي مما يساعد مع تمسخ من الحمض النووي الريبي وتقليل تلف الخلايا. وتستخدم كبريتات ديكستران كوحدة تخزين والتي لا تشمل البوليمر لتركيز التحقيق وزيادة معدل التهجين. Denhardts حل والخميرة والحمض الريبي النووي النقال SSSD بمثابة عرقلة للحد من عوامل غير محددة وملزمة.
  3. في كل خلية تحتوي على 1.5 - إعادة تعليق أنابيب microcentrifuge مل ، إضافة HB 95 ميكرولتر و 5.0 ميكرولتر من الحمض الريبي النووي الذواب / مرنا محددة LNA [20 بمول تركيز LNA محددة النهائي] أو الماء (للتحكم LNA أي سلبية). على سبيل المثال :
    1. أنبوب 1-95 HB ميكرولتر الحمض الريبي النووي الذواب + 5.0 ميكروليتر / مرنا محددة التحقيق
    2. أنبوب 2-95 ميكروليتر HB + 5.0 ميكرولتر الحمض الريبي النووي الذواب / مرنا التحقيق الخاصة (مكافحة "لا صبغة" السلبي)
    3. أنبوب 3-95 ميكروليتر HB الحمض الريبي النووي الذواب 5.0 + ميكرولتر/ مرنا المسبار ('غير أعربت الحمض الريبي النووي الذواب / مرنا" السيطرة السلبية)
    4. أنبوب 4-95 ميكروليتر HB المياه 5.0 + ميكرولتر ('لا LNA" السيطرة السلبية)
  1. احتضان جميع العينات الأربعة في 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. درجة الحرارة يعتمد على تهجين التحقيق LNA م T (ق) وينبغي أن تكون وضعت في حوالي 30 درجة مئوية تحت تنبأ تي م لرنا الصلب. كلا من درجة حرارة مرتفعة والتهجين formamide في HB يضمن تمسخ هيكل من الحمض الريبي النووي الذواب الثانوية أو مرنا في المصالح.

6. بعد التهجين يغسل

  1. بعد التهجين ، إضافة 1.0 مل 0.1X SSC بنسبة 0.1 ٪ توين - 20 (SSCT) إلى خليط التهجين. هذا أمر ضروري للسماح إزالة الخلايا من التهجين حل لزجة. بيليه الخلايا (7K ، 2 دقيقة) وإزالة طاف.
  2. إضافة 200 ميكرولتر من formamide 50 ٪ ، 2X محكمة أمن الدولة ، 0.1 ٪ توين - 20 إلى الكريات الخلية ، مزيج دقيق وincubأكل لمدة 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية في كتلة التدفئة.
  3. إضافة 1 مل 0.1X SSCT إلى الخليط ، بيليه الخلايا (7K ، 2 دقيقة) وإزالة طاف.
  4. إضافة 500 SSCT 0.1X ميكرولتر resuspend إلى الخلايا واحتضان لمدة 40 دقيقة عند 65 درجة مئوية في كتلة الحرارة. بيليه الخلايا (7K ، 2 دقيقة) وإزالة طاف.

7. الحجب وتلطيخ

  1. إعداد عازلة تمنع (BB) والحل تلطيخ streptavidin صباغة. يعد حل BB 1X من الأسهم 5X (متوفر تجاريا ، انظر الكواشف). لكل مجموعة من أربعة أنابيب ، وإعداد 1.2 مل 1X BB.
  2. إضافة 200 ميكرولتر 1X BB للكريات الخلية ، واحتضان resuspend لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  3. ويستخدم صبغة streptavidin ، مترافق تحقيقات للكشف عن حالات الغدد biotinylated. في حين وقف ، وإعداد حل من 2 ميكروغرام / مل أو 488 DyLight streptavidin المطلوب صبغ streptavidin المتقارن BB 1X في لمدة 30 دقيقة (لمدة ثلاث عينات ، وجعل 300 ميكرولتر).
  4. بعد incubأوجه مع BB 1X ، بيليه الخلايا (7K ، 2 دقيقة) وإزالة طاف. إضافة 50 ميكرولتر من الحل streptavidin صبغة لكريات الخلية ، مزيج دقيق ، واحتضان لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية مع الخلط المستمر على دوامة أو في thermomixer. لمكافحة "لا صبغة" ، بإضافة 50 ميكرولتر 1X عازلة تمنع فقط. بالنسبة لبقية من البروتوكول ، وحماية الأنابيب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
  5. غسل خلايا مرة واحدة مع 500 ميكرولتر العازلة SSCT 0.1X مرة واحدة مع 400 PBS 1X ميكرولتر بنسبة 0.1 ٪ توين - 20 (PBST). بيليه الخلايا (7K ، 2 دقيقة) وإزالة طاف.
  6. بعد تلطيخ streptavidin - المتقارن الأولي ، يتم تضخيمه إشارة عن طريق إدخال biotinylated المضادة للأجسام المضادة للstreptavidin المتقارن streptavidin صباغة وتلوين ثم مرة ثانية مع صبغ streptavidin بالتالي زيادة الانتاج في إشارة المهجنة LNA المسبار (الشكل 2) .
  7. biotinylated إضافة 100 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / مل المضادة للأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني streptavidin 1X ، resuspenد الخلايا ، واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع خلط في بعض الأحيان. بيليه الخلايا (7K ، 2 دقيقة) ، وإزالة طاف ويغسل مرتين مع PBST 1X 400 ميكروليتر.
  8. إضافة 50 ميكرولتر من 2 ميكروغرام / مل streptavidin صبغة حل لهذه الخلايا ، مزيج دقيق ، واحتضان لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية مع الخلط المستمر على دوامة أو في thermomixer. لمكافحة "لا صبغة" ، بإضافة 50 ميكرولتر 1X عازلة تمنع فقط.
  9. غسل خلايا مرة واحدة مع 500 ميكرولتر العازلة SSCT 0.1X مرة واحدة مع وPBST 1X 400 ميكروليتر.
  10. Resuspend الخلايا في PBST 1X 200 ميكروليتر وتخزينها في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للتحليل التدفق الخلوي. أصغر لخلايا جرثومية ضبط معدل تدفق بطيء للتقليل من حجم الأساسية. بالإضافة إلى ذلك ، لcytometers التدفق إلى الأمام مع انقطاع عتبة مبعثر ، لا بد من ضبط قطع عند أدنى مستوى ممكن لضمان الكشف عن خلايا صغيرة البكتيرية.
  11. الكشف عن 488 DyLight ، ينبغي أن تكون مجهزة لتدفق عداد الكريات مع ليزر 488 نانومتر والانبعاثات القياسيةالمرشحات لFITC. وينبغي جمع ما لا يقل عن 4 2x10 الأحداث. من أجل التوافق مع تدفق cytometers مجهزة ليزر مختلفة ، يمكن استخدام streptavidin أخرى ، مترافق fluorophores لهذا البروتوكول.

8. ممثل النتائج

ويرد مثال على الخلايا التي يتم إصلاحها وpermeabilized بفعالية في مؤامرة نقطة التدفق الخلوي في الشكل 3A. عند استخدام الشروط المذكورة أعلاه لpermeabilization ، السكان خلية صغيرة ومتجانسة تشير المجاميع الخلية قليلة. عندما يتم استخدام أعلى (5 ملغ / مل) تركيزات الليزوزيم ، والخلايا أكثر عرضة لتجميع وإظهار القيم مبعثر زيادة الأمام ، مما يدل على الجسيمات الأكبر حجما (الشكل 3B). ويرد مثال على بيانات التدفق الخلوي من تجربة ناجحة تدفق الأسماك LNA في الشكل 4. الرسم البياني يوضح الكشف معينة من الحمض الريبي النووي الذواب الهدف جنبا إلى جنب مع ثلاثة عناصر تحكم سلبية.في "لا صبغة" التحكم سلبية تنتج أقل مضان ، تليها "لا LNA' و 'غير وأعرب الحمض الريبي النووي الذواب" ضوابط سلبية. أخيرا ، العينة مع التحقيق LNA الحمض الريبي النووي الذواب محددة تنتج أكبر مضان. بمجرد التحقق من صحة الأسلوب وتحقيقات LNA بهذه الطريقة ، يمكن تصميم التجارب إضافية لرصد التغيرات في الحمض الريبي النووي الذواب إشارة مرور الوقت ، واستجابة لظروف الطفرات أو ثقافة متنوعة ، إلخ.

الشكل 1.
الشكل 1. تصوير الخطة الشاملة للتجربة تدفق الأسماك LNA للكشف عن الحمض الريبي النووي الذواب البكتيرية.

الشكل 2.
الشكل 2. تلطيخ والتضخيم للإشارة تدفق الأسماك LNA. أ) تهجين للمسبار LNA biotinylated. ب) يلطخ مع المتقارن DyLight الفلورسنت streptavidin 488. ج) ملزم من ليالي مكافحة biotinylatedtreptavidin الضد إلى 488 streptavidin DyLight. لا يمكن للجسم من خلال ربط streptavidin موقع مستضد الملزمة ، أو يمكن أن تكون ملزمة من خلال streptavidin مخلفاتها البيوتين. د) التضخيم للإشارة من تلطيخ أخرى مع المتقارن DyLight الفلورسنت streptavidin 488.

الشكل 3.
الشكل 3. مؤامرات نقطة التدفق الخلوي تظهر النتائج إلى الأمام في مقابل الجانب مبعثر لالليزوزيم) ملغ / مل 1 و 3 ميكروغرام / مل بروتيناز permeabilization K وب) 5 ملغ / مل الليزوزيم و 3 ميكروغرام / مل permeabilization K بروتين.

الشكل 4.
الشكل 4. تحليل الرسم البياني لنتائج التدفق LNA السمكية. يظهر إشارة الفلورسنت المتولدة من كل عينة من آثار الأربعة : الأسود -- الحمض الريبي النووي الذواب محددة LNA التحقيق ؛ الحمراء -- مراقبة "غير وأعرب الحمض الريبي النووي الذواب السلبي ؛ الزرقاء -- تحكم" لا LNA السلبي ؛ الأرجواني --"لا صبغة" السيطرة السلبية.

Discussion

وقد استخدم تدفق الأسماك LNA الأسلوب المعروضة هنا للكشف عن التعبير عن الحمض الريبي النووي الذواب من سلبية الغرام البحرية بكتيريا الضمة campbellii التعبير الذي سبق أن أكد عبر التنميط القائم على التعبير ميكروأري وعكس رد فعل البلمرة النسخ 16. حتى الآن ، وقد استخدمنا هذا الأسلوب لمراقبة التعبير عن مجموعة متنوعة من RNAs (مثلا عبر الحمض الريبي النووي الذواب المشفرة ، التي تعدل الحمض الريبي النووي الذواب نشاط البروتين ، riboswitches ، ومرنا). على هذا النحو ، ونحن واثقون من أن هذه الطريقة قابلة للتكيف ، ويمكن استخدامها للكشف عن أي هدف أو الحمض الريبي النووي الذواب مرنا ويمكن تعديلها لاستخدامها في أي نوع من الأنواع البكتيرية أو نوع من الخلايا. إذا كان تعديل هذا البروتوكول هو ضروري لأنواع الخلايا الأخرى ، والمتغير الأهم للنظر في التلاعب هو الخطوة permeabilization. على سبيل المثال ، عند تعديل شروط permeabilization الموصوفة هنا ، يجب اختبار التغيرات في تركيزات بروتين الليزوزيم وكاف. وجدنا أن تضاعف أوثلاثة أضعاف كمية بروتين الليزوزيم وكاف أدى إلى تغييرات كبيرة في النتائج تدفق الأسماك LNA. علاوة على ذلك ، عند اختبار الظروف permeabilization إضافية ، ينبغي تحليل الخلايا للتكتل ، وفقدان الخلية ، ويمكن الحصول على أفضل إشارة إلى نسبة الخلفية مضان. ويمكن اختبار مدى التثاقل عن الخلية و / أو المجهري التدفق الخلوي. من جانب التدفق الخلوي ، كتل الخلايا موجودة في ذيول في الأمام مقابل الجانب مؤامرة نقطة مبعثر والأسلوب الصحيح permeabilization سيقلل هذا التأثير المخلفات. هذا الأسلوب هو أيضا قابل للكشف عن الحمض الريبي النووي الذواب متعددة دون تعديلات رئيسية في البروتوكول كما هو موضح إضافية يمكن أن تضاف تحقيقات LNA المسمى مع haptens أخرى مثل digoxigenin خلال الخطوة التهجين والكشف عن الأجسام المضادة ثم مع مكافحة digoxigenin والثانوية للأجسام المضادة المتقارن fluorophore. حاليا ، والقيد الوحيد التي واجهناها مع هذا الأسلوب هو عدم قدرتها على توليد ما يكفي من الإشارات السابقة ضعيفةالحمض الريبي النووي الذواب أنواع الضغط والجهود جارية لتحديد عتبة الكشف (في عدد النسخ المطلق لكل خلية).

عموما ، فإن تدفق الأسماك LNA الأسلوب يتيح الفرصة لقياس الحمض الريبي النووي الذواب البكتيرية أو التعبير مرنا على مستوى خلية واحدة بطريقة إنتاجية عالية لتقديم رؤى حول وجود وفرة نسبية لأنواع سرنا والدرجة التي يختلف التعبير عنها في عدد السكان.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل مكتب البحوث البحرية عبر بحوث البحرية الامريكية الأموال الأساسية مختبر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Applied Biosystems AM9625
Nuclease-free water Applied Biosystems AM9932 (not DEPC treated)
32% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences RT 15714 Ethanol free
Acetic acid Acros Organics 327290010
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 Keep desiccated
Lysozyme Sigma-Aldrich L2879
Proteinase K (20 mg/mL) Applied Biosystems AM2546
Formamide Applied Biosystems AM9342 Deionized, aliquot and freeze
Dextran sulfate MW > 500,000 Sigma-Aldrich D8906 Aliquot 60% solution and freeze
Denhardt’s solution 50X concentrate Sigma-Aldrich D2532 Aliquot and freeze
Sodium citrate buffer 20X Applied Biosystems AM9770
Salmon sperm DNA (sheared) 10 mg/mL Applied Biosystems AM9680 Aliquot and freeze
Yeast tRNA (10 mg/mL) Life Technologies 15401-011 Aliquot and freeze
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
5X in situ hybridization blocking solution Vector Laboratories MB-1220
DyLight 488 streptavidin Vector Laboratories SA-5488-1
Biotinylated anti-streptavidin Vector Laboratories BA-0500 Aliquot and freeze

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E., Lansdorp, P. M. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nat. Biotechnol. 16, 743-747 (1998).
  2. Lansdorp, P. M. Heterogeneity in telomere length of human chromosomes. Hum. Mol. Genet. 5, 685-691 (1996).
  3. Pernthaler, A., Amann, R. Simultaneous Fluorescence In Situ Hybridization of mRNA and rRNA in Environmental Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5426-5433 (2004).
  4. Jen, C. J. Flow-FISH analysis and isolation of clostridial strains in an anaerobic semi-solid bio-hydrogen producing system by hydrogenase gene target. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 1126-1134 (2007).
  5. Robertson, K. L., Verhoeven, A. B., Thach, D., Chang, E. Monitoring Viral RNA in Infected Cells with LNA Flow-FISH. RNA. 16, 1679-1685 (2010).
  6. Friedrich, U., Lenke, J. Improved Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Mesophilic Dairy Starter Cultures by Using Multiplex Quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometry-Fluorescence In Situ Hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 72, 4163-4171 (2006).
  7. Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11, 1745-1748 (2005).
  8. Silahtaroglu, A. N., Tommerup, N., Vissing, H. FISHing with locked nucleic acids (LNA): evaulation of different LNA/DNA mixmers. Mol. Cell. Probes. 17, 165-169 (2003).
  9. Obika, S. Synthesis of 2'-O, 4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3'-endo sugar puckering. Tetrahedron. Lett. 38, 8735-8738 (1997).
  10. Koshkin, A. A. LNA (locked nucleic acids): synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine, and uracil bicyclonucleoside monomers oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition. Tetrahedron. 54, 3607-3630 (1998).
  11. Kubota, K., Ohashi, A., Imachi, H., Harada, H. Improved in situ hybridization efficiency with locked-nucleic-acid-incorporated DNA probes. Appl. Environ. Microbiol. 72, 5311-5317 (2006).
  12. Robertson, K. L., Thach, D. C. LNA flow-FISH: A flow cytometry-fluorescence in situ hybridization method to detect messenger RNA using locked nucleic acid probes. Anal. Biochem. 390, 109-114 (2009).
  13. Waters, L., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136, 615-628 (2009).
  14. Petersen, M., Wengel, J. LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics. Trends. Biotechnol. 21, 74-81 (2003).
  15. Corput, M. P. C. vd, Grosveld, F. G. Fluorescence in Situ Hybridization Analysis of Transcript Dynamics in Cells. Methods. 25, 111-118 (2001).
  16. Silveira, A. C. G. Identification of non-coding RNAs in environmental vibrios. Microbiology. 156, 2452-2458 (2010).

Tags

علم المناعة ، العدد 59 ، مضان
تأمين تدفق الأحماض النووية الخلوي ومضان<em> في الموقع</em> التهجين (LNA تدفق FISH) : طريقة لاكتشاف الحمض النووي الريبي البكتيرية الصغيرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robertson, K. L., Vora, G. J. Locked … More

Robertson, K. L., Vora, G. J. Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection. J. Vis. Exp. (59), e3655, doi:10.3791/3655 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter