Implantación de células de cáncer en el órgano de origen puede servir como un modelo preclínico útil para evaluar nuevas terapias. Células de carcinoma de vejiga MB49 se pueden cultivar dentro de la vejiga después de la instilación intravesical. Este protocolo demuestra la cateterización de la vejiga de ratón para el propósito de la implantación del tumor y la entrega adenoviral.
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Artículo de método
Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga de Estudios de liberación de genes
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Resumen
Resumen
El cáncer de vejiga es el segundo cáncer más común del tracto urogenital y nuevos enfoques terapéuticos que pueden reducir son necesarios recurrencia y progresión. El microambiente tumoral puede influir significativamente en el desarrollo del tumor y la respuesta al tratamiento. Por lo tanto, a menudo es deseable hacer crecer las células tumorales en el órgano del que se derivan. Este protocolo describe un modelo ortotópico de cáncer de vejiga, en el que las células de carcinoma de vejiga murino MB49 se instila en la vejiga a través de la cateterización. Implantación de células tumorales con éxito en este modelo requiere la interrupción de la capa protectora de glucosaminoglucano, que se puede lograr por medios físicos o químicos. En nuestro protocolo de la vejiga se trata con tripsina antes de la instilación de células. La cateterización de la vejiga también puede ser utilizado para entregar la terapéutica de una vez establecidos los tumores. Este protocolo describe la entrega de una construcción adenoviral que expresa un gen indicador de luciferasa. Si bien our protocolo ha sido optimizado para los estudios a corto plazo y se centra en la entrega de genes, la metodología de ratón cateterismo vesical tiene amplias aplicaciones.
Introducción
El cáncer de vejiga es el segundo cáncer más común del tracto urogenital, con cerca de 75.000 nuevos casos y 15.000 muertes esperadas en el 2012 1. Las altas tasas de recurrencia requieren seguimiento de por vida, lo que hace que el cáncer de vejiga uno de los cánceres más costosas de tratar. El cáncer de vejiga que ha invadido la capa muscular puede producir metástasis en el hígado, pulmón o hueso a través del sistema linfático. La terapia multimodal de tumores avanzados resultados en sólo 20-40% de supervivencia a los 5 años. Por lo tanto, las estrategias de tratamiento eficaces destinadas a reducir la recurrencia y progresión del cáncer superficial de vejiga, así como mejorar los resultados terapéuticos en los pacientes con enfermedad avanzada se necesitan con urgencia.
Desarrollo de nuevas terapias requiere modelos preclínicos para evaluar la eficacia después de la evaluación inicial in vitro. El microambiente tumoral puede influir significativamente en el desarrollo del cáncer y la capacidad de respuesta, lo que pone de relieve la necesidad de preclínicamodelos de AL en el que surgen los tumores o se pueden establecer en el órgano de origen. Un enfoque es el desarrollo de modelos transgénicos en los que surgen los tumores de forma espontánea o puede ser inducida en una manera específica de órgano. Una excelente protocolo de un modelo de cáncer de vejiga transgénico ha sido recientemente publicado 2. El inconveniente de los modelos transgénicos es que los tumores tienden a desarrollarse lentamente y con menos uniformidad de lo deseado. Además, el costo de mantenimiento de una colonia de cría tiene que ser considerado. Una alternativa a modelos transgénicos es la implantación ortotópica de las células tumorales, que tiene la ventaja de marcos corto de tiempo para el establecimiento de tumores en ratones disponibles comercialmente. Mientras que algunas líneas celulares de cáncer de vejiga humanos se pueden cultivar de forma ortotópica (hemos utilizado con éxito UM-UC-3), puede ser deseable para establecer tumores en ratones inmunocompetentes. Dos líneas celulares de cáncer vesical murino, que crecen ortotópicamente son MBT-2 y MB49 3. Desde MBT-2 células están contaminados con la replicaciónretrovirus tipo C 4, hemos elegido las células MB49 para nuestros estudios. Es importante señalar que las células MB49 fueron aisladas de un ratón macho y implantaciones ortotópico son por razones anatómicas realizados en ratones hembra. Esto tiene la ventaja de una fácil identificación de las células implantadas por marcadores del cromosoma Y, pero la falta de coincidencia de género puede ser un inconveniente para estudios inmunológicos.
El epitelio de la vejiga está revestida por una capa de glucosaminoglucano (GAG), que funciona como una barrera para la infección por microorganismos. Esta barrera también puede interferir con la implantación de las células tumorales y varios métodos se han desarrollado para superar esta dificultad (Tabla 1). Electrocauterio se ha utilizado ampliamente como un medio físico para interrumpir la capa GAG 5-13 y un electrocauterio demostrando protocolo ha sido recientemente publicado en Jove 14. Sin embargo, no debe estar disponible una unidad de electrocauterio, medios químicos para destruir el GAG capa tal como nitrato de plata o de poli-L-lisina también se puede utilizar 15-24. Los tumores se establecieron de manera efectiva por una breve exposición de la vejiga a un pequeño volumen de nitrato de plata (5-10 l, 0,15 a 1,0 M, ~ 10 seg) o de contacto más largo con poli-L-lisina (100 l de 0,1 mg / ml durante 20 min) (Tabla 1). Aquí se describe un método que usa tripsina para facilitar la implantación de las células MB49.
En un intento de mejorar los enfoques terapéuticos para el cáncer de vejiga, la terapia génica ha llamado la atención significativa. Desde un punto de vista clínico, el cáncer de vejiga es un objetivo ideal para la terapia génica debido a la fácil accesibilidad del órgano y la capacidad de administrar localmente la carga útil. Los vectores virales que se han explorado para la terapia génica del cáncer de vejiga incluyen un virus oncolítico del herpes simple 25, 26 de retrovirus, virus de la viruela del canario 27, virus de la vacuna, de AAV, y adenovirus 28. En la segunda parte de nuestro protocolo, se describe un método para la entrega viral que es prácticamente idéntica a la instilación de las células tumorales. De interés en nuestro laboratorio es el desarrollo de nuevos enfoques para la entrega de genes, que evaluamos a través de la bioluminiscencia usando un vector adenoviral que expresa un transgen de la luciferasa. Sin embargo, la metodología de la cateterización de la vejiga puede ser utilizado para la entrega de diversos agentes y por lo tanto tiene una amplia aplicabilidad.
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales han sido revisados y aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso de la Universidad Médica de Carolina del Sur. El protocolo fue aprobado por USDA categoría D para el dolor.
1. El implante de células
- Dos días antes de realizar el procedimiento, la placa 1 x 10 6 MB49 células en matraces T-25. El uso de alta glucosa DMEM suplementado con 10% de FBS (antibióticos y, si se desea). Un matraz es suficiente para cada grupo de hasta cinco ratones que se anestesió y se implanta en paralelo.
- En el día del procedimiento, preparar tripsina para la instilación por dilución de 0,25% de tripsina de grado de cultivo de tejido estéril a 0,125% con medio de base DMEM estéril (dilución 1:2). 1,2 ml es suficiente para 10 ratones. Colocar en un baño de agua a 37 ° C que se equilibre.
- Precalentar una almohadilla caliente y colocarlo bajo las nosecones del sistema de anestesia que se utilizará para entregar isoflurane. Coloque una almohadilla absorbente limpio sobre el cojín eléctrico.
- Coloque los ratones en la cámara de inducción de anestesia y el sistema de inducir la anestesia con 3% de isoflurano. Cuando los ratones han perdido el conocimiento, que es verificada por la pérdida del reflejo de los pies-pinch, transferirlos a los nosecones. Asegúrese de que cada animal está en una posición de decúbito supino y correctamente colocado en la plataforma de calentamiento para mantener la temperatura corporal.
- Reducir la concentración de isoflurano al 2% para mantener la anestesia.
- Aplique una pomada oftálmica de ambos ojos para evitar que se sequen.
- Paso opcional: Eliminar el vello abdominal. El pelo en la parte inferior del abdomen se debe retirar si se llevará a cabo en vivo bioluminiscente de imágenes.
- Aplicar una capa generosa de crema depilatoria, como Veet, la más baja 1 en la plaza de la piel en el abdomen, con cuidado de no ponerse en contacto con los genitales externos. Espere 3 min.
- Retire el cabello frotando el área con una esponja seca, y luego usar una esponja húmeda para limpiar la piel. Repetir una vez, si es necesario.
- Cateterizar la vejiga
- Engrasar un catéter nuevo, estéril 24 G pediátrica venosa con un gel lubricante no irritante como KY. Retire y deseche la aguja. Si la fuga de líquido alrededor del catéter es un problema común, es decir. ocurre con más frecuencia que en uno de los diez ratones, catéteres de calibre más grandes (20 g) se pueden utilizar. Esto puede ser una consideración importante en ratones de más edad de 8 semanas.
- Sosteniendo el cubo del catéter, use el pulgar y el dedo índice de la otra mano para extender las patas traseras del ratón y exponer el meato uretral. Introduzca suavemente el catéter en la uretra en un ángulo de 45 °, cambiando el ángulo de uno paralelo con el banco para insertar en su totalidad.
- Después de la inserción completa, levantar el catéter suavemente, manteniéndola paralela al banco, y confirmar visualmente que se coloca en la uretra y no la vagina, que está debajo de ella. Si se coloca correctamente, el catéter será capaz de estar eninsertado totalmente desde la vagina es más corta que la uretra.
- Reducir la concentración de isoflurano al 1%.
- Fije una punta a una pipeta P200 y eliminar la orina desde la vejiga mediante la aplicación de succión al extremo externo del catéter. Elimine cualquier resto de la orina desde el cubo del catéter. Deseche la orina y dejar el catéter en su lugar.
- Cuidadoso pipeteado 80 l de solución de tripsina al 0,125% en el cubo del catéter, evitando burbujas de aire. Acople una jeringa llena de aire 1 ml a la conexión del catéter y presione lentamente el émbolo 0,1-0,2 ml para entregar la tripsina en la vejiga.
- Deje la jeringa y el conjunto de catéter en el lugar durante 15 minutos. Repetir los pasos 1.8 a 1.11 para cualquiera de los ratones anestesiados restantes (hasta 4). Continúe con el siguiente paso, durante el período de espera. SUGERENCIA: Al principio puede ser útil tener a alguien más prepare las células (paso 1,12).
- Preparar las células MB49 para la implantación. Las células se sembraron a 1 x 10 6 por T-25 matraz de 48 horas antes de la implantación (paso 1.1).
- Retire el medio y añadir 500 l de 0,25% de tripsina al matraz. Cuando las células se desprenden añadir 5 ml de DMEM completo de volver a suspender las células. Quitar una alícuota de 50 l para contar, y centrifugar el resto a 1.000 rpm durante 5 min. Durante la etapa de centrifugación seguir pasos 1.12.2 y 1.12.3.
- Contar las células utilizando un hemocitómetro. Cálculo de las células / ml. Luego calcula el volumen necesario para que el sedimento celular a 4 x 10 6 células / ml (2 x 10 5 células por 50 l).
- Retirar el sobrenadante de células centrifugadas y resuspender el precipitado en medio base DMEM con el volumen necesario para suspender las células a 4 x 10 6 células / ml (según lo calculado en el paso 1.12.2). Mantener las células a temperatura ambiente.
- Cuando se alcanza el punto de tiempo de 15 min de tratamiento con tripsina de vejigas, desconectar la jeringa llena de aire del catéter dejando el catéter en su lugar. Tripsina gastado será normal,mente fluya hacia atrás a través del catéter. Eliminar cualquier tripsina restante de la vejiga por succión con la pipeta P200 como en el paso 1.9 arriba y descartar.
- Inmediatamente pipetear 50 l de suspensión de células MB49 en el cubo del catéter. Acople la jeringa llena de aire 1 ml al cubo del catéter y entregar las células a la vejiga apretando lentamente el émbolo 0,1-0,2 ml. Repita este paso hasta cuatro veces más para implantar los cinco ratones. Deseche cualquier célula no utilizados.
- Dejando el conjunto de catéter-jeringa en su lugar, permita que las células de habitar en la vejiga durante 50 min.
- Retirar con cuidado el conjunto de catéter-jeringa de la uretra. Gire a la concentración de isoflurano a cero y mover cada ratón una o dos pulgadas de distancia de la ojiva de recuperar sobre el cojín eléctrico.
- Cuando un ratón ha recuperado su reflejo de enderezamiento, devolverlo a su jaula.
2. Entrega intravesical de Adenovirus (8 días después de la implantación de células)
PRECAUCIÓN: Esta parte del protocolo utiliza adenovirus, que es un agente infeccioso y debe ser manejado bajo las directrices estrictas BSL2 (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/).
Todos los procedimientos realizados con agentes infecciosos fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad Médica de Carolina del Sur.
- Ocho días después de la implantación de los ratones con células MB49, compruebe si hay hematuria. Recoge animales individuales sobre un pedazo de papel blanco absorbente y presionar suavemente sobre el abdomen para borrar gotas de orina sobre el papel. La orina es de color rosa a rojo indica hematuria y es una señal de que los tumores se han establecido. Tumor tasa de absorción es al menos 80% y con una excelente técnica puede ser tan alta como 100%.
- Descongelar stock adenoviral que en hielo y se diluye hasta 10 9 PFU/50 l (2 x 10 10 UFP / ml) en PBS estéril temperatura ambiente.
- Anestesie los ratones como se describe en los pasos 1.3 a 1.6 anteriormente.
- Cateterizar los ratones como se describe en los pasos 1,8 y eliminar la orina como en el paso 1.9
- Después se elimina la orina, pipetear inmediatamente 50 l de suspensión de virus en el cubo del catéter. Acople la jeringa llena de aire 1 ml al cubo del catéter y entregar el virus de la vejiga apretando lentamente el émbolo 0,1-0,2 ml.
- Dejando el conjunto de catéter-jeringa en su lugar, permita que el virus, para que habiten en la vejiga durante 40 min.
- Retirar con cuidado el conjunto de catéter-jeringa de la uretra, y deseche en una solución de lejía al 10% para inactivar cualquier virus restante.
- Gire a la concentración de isoflurano a cero y mover cada ratón una o dos pulgadas de distancia de la ojiva de recuperar sobre el cojín eléctrico.
- Cuando un ratón ha recuperado su reflejo de enderezamiento, devolverlo a su jaula.
- Marcar jaulas para indicar que los ratones que han sido inculcados con adenovirus. Virus será derramada en la ropa de cama de la jaula durante varios días y todas las jaulas y ropa de cama debe sermanejado y desinfectado apropiadamente.
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Resultados
La hematuria se observa en casi todos los ratones dentro de 8 días después de la implantación de las células MB49 200000. Como se muestra en la Figura 1, el peso de la vejiga es más del doble de 34,7 ± 3,3 mg (rango de 31-37 mg, n = 4) no tumoral en ratones portadores de 87,5 ± 19,2 mg (rango de 77 a 120 mg, n = 10) en ratones que han sido implantados con las células MB49. En términos de la entrega de genes, encontramos que las imágenes ratones 24 horas después de la instilación viral produce una señal ...
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Discusión
La principal metodología descrita en este protocolo es la cateterización de la vejiga del ratón, que tiene amplias aplicaciones para la instilación de células o de cualquier agente destinado a la administración local en el epitelio de la vejiga. El protocolo específico descrito anteriormente ha sido optimizado para los estudios a corto plazo (~ 10 días). Implantar el número exacto de las células es fundamental, ya que un número mayor de células dará lugar a un crecimiento rápido del tumor más y, posiblemente, la pérdida...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el NIH R21 CA143505 a Christina Voelkel-Johnson.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Compañía | Número de catálogo | Comentarios |
| Ratones hembra de 6-8 semanas de edad | Jackson Laboratories | Nombre de la cepa: C57BL/6J Número de inventario: 000664 | |
| Trypsin* | MediaTech | MT25-053-CI | Obtenido a través de Fisher |
| DMEM* | MediaTech | MT10-017-CV | Obtenido a través de Fisher |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | Heat-inactivated |
| T25 frascos* | Corning Costar | Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63 | Obtenido a través de Fisher |
| MB49 cells | N/A | N/A | Obtenido del Dr. Boehle (ver referencia11) |
| Puralube Vet Omadment* | Pharmaderm | Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869 | Obtenida a través de Fisher |
| Crema depilatoria: Veet | farmacia local | ||
| Lubricante: K-Y Jelly | farmacia local | ||
| Catheters* | Exel International | Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21 | Obtenido a través de Fisher |
| Isoflurano | Terrell | NDC 66794-011-25 | Obtenido a través de la farmacia del hospital |
| 1 ml de boquilla deslizante jeringas TB | Becton Dickinson | BD309659 Fisher:14-823-434 | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnologies | L-123-1 | |
| Ad-CMV-Luc | VectorBiolabs | 1000; Solicite amplificación a gran escala y purificación de CsCl para uso in vivo | Agente infeccioso que requiere contención de BSL2 |
| Steady-Glo Sistema de ensayo de luciferasa | Promega | E2510 (10 ml), E2520 (100 ml) o E2550 (10 x 100 ml) | |
*disponible a través de múltiples proveedores | |||
EQUIPMENT | |||
| sistema de anestesia | E-Z Systems, Euthanex Corporation | Sistema de anestesia: EZ7000 5 puertos de ratón dispositivo de reinhalación: EZ109 | Obtenido a través de Fisher |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm | |
| FLUOstar Optima | BMG Labtech | http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
