Summary
Foram utilizadas técnicas de microscopia e processamento de imagem com lapso de tempo para observar e analisar a compactação de gel mediada por fibroblasto e o realinhamento da fibra fibrina em um bioreator ambientalmente controlado durante um período de 48 horas.
Abstract
Células embutidas em géis de colágeno e fibrina ligam e exercem forças de tração sobre as fibras do gel. Essas forças podem levar à reorganização local e global e ao realinhamento da microestrutura de gel. Esse processo prossegue de forma complexa e dependente, em parte, da interação entre a localização das células, a geometria do gel e as restrições mecânicas do gel. Para entender melhor como essas variáveis produzem padrões globais de alinhamento de fibras, usamos microscopia de contraste diferencial de impacto de lapso de tempo (DIC) juntamente com um bioreator ambientalmente controlado para observar o processo de compactação entre explantas geométricas espaçadas (clusters de fibroblastos). As imagens são então analisadas com um algoritmo de processamento de imagem personalizado para obter mapas da cepa. As informações obtidas a partir desta técnica podem ser usadas para sondar a mecanobiologia de várias interações de matriz celular, o que tem implicações importantes para a compreensão de processos em aplicações de cicatrização de feridas, desenvolvimento de doenças e engenharia de tecidos.
Introduction
Uma ferramenta importante para estudar as interações entre células e matrizes é o gel de colágeno povoadocelular 1,2. O gel fornece um ambiente 3D mais próximo do caráter in vivo do tecido e mais adequado para entender o comportamento celular do que é oferecido pelas culturas 2D tradicionais3. Estudos iniciais nos quais os fibroblastos foram distribuídos de forma homogênea dentro de um gel de colágeno descobriram que as células consolidam rapidamente as fibras de colágeno e compactam o gel4,5. Os fibroblastos contratuais em géis flutuantes livres então transitam para um estado quiescente logo após o gel ter atingido totalmente a compactação1,6,7. Os fibroblastos em géis que são limitados nos limites permanecem em estado ativo e sintético8 e geram alinhamento de fibras de forma dependente da geometria do gel e restrições externas5,9. As diferenças na atividade celular parecem ser resultado da tensão interna (ou falta dela) que se desenvolve à medida que as células exercem forças de tração através de integrins nas fibras de colágeno no gel.
Uma variante dessa técnica envolve colocar explantas de fibroblastos (ou seja, aglomerados de células) a uma distância entre um gel de colágeno e observar interações de matriz celular e o desenvolvimento gradual do alinhamento de fibras entre as explantas (às vezes chamadas de correias ligamentares)10-12. A principal vantagem do sistema de explant é que ele permite que se organize as células em padrões geométricos simples, o que torna mais fácil visualizar e sondar os mecanismos subjacentes ao realinhamento de fibras orientados por células. Esses padrões de alinhamento — que dependem principalmente da interação entre as forças de tração celular, distribuição espacial celular, geometria do gel e as restrições mecânicas do gel — são importantes de entender porque desempenham um papel central na organização global de tecidos, função mecânica e ambiente mecânico local13.
No campo da engenharia de tecidos, uma estratégia para a produção de tecidos mecanicamente funcionais e projetados envolve o controle do padrão de alinhamento de fibras que se desenvolve a partir da compactação celular para que o tecido projetado possua alinhamento de fibras que imita o do tecido nativo14,15. Acredita-se que tal alinhamento seja necessário para que os tecidos projetados repliquem o complexo comportamento mecânico dos tecidos nativos. Uma modificação dessa estratégia é substituir o gel de colágeno por um gel de fibrina16. O gel de fibrina desenvolve um padrão de alinhamento semelhante ao de um gel de colágeno durante a compactação. Com o tempo, a fibrina é degradada e substituída por ECM sintetizado por células que segue o padrão inicial de alinhamento da fibra fibrina. A construção projetada resultante melhorou significativamente as propriedades mecânicas em comparação com as construções derivadas de gel de colágeno17.
O processo de alinhamento e os eventos subsequentes de remodelação em géis de fibrina prosseguem de forma complicada e mal compreendida. Para caracterizar melhor essas interações e seu efeito sobre o comportamento celular e a remodelação do ECM, desenvolvemos um procedimento baseado no método de explant. Neste método, explantas de fibroblasto são posicionadas em um gel de fibrina em diferentes padrões geométricos. Os géis são mantidos em um bioreator18controlado pelo microscópio, controlado pelo microscópio, e o processo de compactação e realinhamento de fibras é monitorado com microscopia de contraste diferencial de interferência de lapso de tempo (DIC). Os campos de deslocamento são quantificados com algoritmos personalizados. Os dados obtidos a partir desses experimentos têm amplas implicações para uma série de processos, incluindo a otimização de estratégias de engenharia tecidual, a melhoria da cicatrização de feridas e o tratamento da remodelação patológica do tecido.
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Protocol
1. Preparação de estêncil
Prepare um estêncil no Parafilm para layout da localização de cada explanta, seguindo a geometria desejada (Figuras 1A e 1B). Espaço cada explante aproximadamente 1-2 mm de distância. Essa distância corresponde a um espaçamento ideal para gerar alinhamento de fibras entre explantas. Fixar o estêncil sob a área da tampa onde a amostra será preparada com fita.
2. Esterilização
Limpe completamente todos os componentes do bioreator usando 70% de etanol e esterilize por 2-3 horas sob luz UV antes da experimentação. Se um vaso alternativo estiver sendo usado em vez de um bioreator, então devem ser utilizadas técnicas adequadas de esterilização. Veja o passo 4.12 para comentários sobre o uso de uma placa de Petri de fundo de vidro.
3. Preparação do gel de fibrina
Após a esterilização dos componentes do bioreator, coloque uma fina camada de gel de fibrina na superfície da almofada. Detalhes para a preparação de soluções de estoque de fibrinogen e trombina para a fabricação de géis fibrinas de 6,6 mg/ml são descritos em Sander et al. 13 Um protocolo semelhante por Ye et al. 19 para fazer 3,3 mg/ml de géis fibrinas também podem ser vistos no site da JoVE.
- Prepare uma solução de microesferas fluorescentes em DMEM a uma concentração de 10 milhões de contas/ml. As contas serão usadas para ajudar a rastrear deslocamentos de gel. Para alcançar essa concentração, combine 0,017 ml de solução de estoque de microesferas e 0,149 ml de DMEM em um tubo de microcentrifuge.
- Sonicar esta suspensão por 10 minutos para dispersar as contas e homogeneizar a solução.
- Solução Fibrin — Em um tubo C de 15 ml, misture 0,22 ml de solução de estoque de fibrinogênio com 0,44 ml de tampão HEPES de 20 mM. Adicione os 0,1667 ml de DMEM com microesferas criadas na etapa 3.1.
- Solução Thrombin — Em um tubo c separado de 15 ml, misture 0,0328 ml de solução de estoque de trombina, 0,131 ml de tampão HEPES de 20 mM e 0,00246 ml de 2 M CaCl2.
- Misture cuidadosamente a solução de trombina (passo 3.4) com a solução fibrinogênio (etapa 3.3) por tubulação para cima e para baixo de 5-10x até que a solução seja distribuída uniformemente. Evite introduzir bolhas o máximo possível. Para reduzir a quantidade de bolhas produzidas, tenha cuidado para não descarregar totalmente a pipeta durante a mistura.
- A adição de trombina fará com que a solução geleia rapidamente (~30 seg). Pipete a solução mista na tampa o mais rápido possível. Deixe o gel polimerizar em RT.
- Sele o bioreator, insira os blocos de aquecimento e conecte os termopares ao controlador de temperatura. Incubar o gel a 37 °C por 15-30 min.
4. Preparação de explanta celular
- Remova o meio do frasco T-75 contendo as células do fibroblasto dérmico humano.
- Enxágue cuidadosamente a superfície com aproximadamente 5 ml de salina tamponada de fosfato (PBS) para remover proteínas séricos. Adicione 1 ml de trippsina-EDTA e incubar por 3 minutos, ou até que as células tenham levantado.
- Depois que as células tiverem sido levantadas, gire a suspensão para baixo em uma centrífuga a 200 x g por 5 min. Remova o supernasce e resuspense a pelota em um volume de DMEM que permitirá uma concentração final de 20 milhões de células/ml.
- Enquanto as células estão girando para baixo na centrífuga desconecte o bioreator dos blocos de aquecimento e dos termopares. Transfira o bioreator para um armário de biossegurança e remova cuidadosamente a tampa seguindo técnicas ascetônicas.
- Crie explantas ao pipetar 0,3 μl da suspensão celular no gel de fibrina polimerizado, seguindo o padrão no estêncil. Cada explanta deve conter aproximadamente 6.000 células. Certifique-se de que são usadas dicas de micropipette de baixo volume (0,1-10 μl).
- Permitir que as células se instalem e se conectem à matriz de fibrinas por 1 hora a 37 °C.
- Com o bioreator ainda aberto, adicione aproximadamente 5 ml de DMEM suplementado com soro bovino fetal de 10% (FBS), 1% penicilina-estreptomicina, 0,1% anfotericina B e 10 mg/ml de aprotinina diretamente na câmara bioreatorial. O DMEM é tamponado bicarbonato e requer 5% de CO2 para manter um pH neutro. Uma vez que o bioreator não é fornecido com CO2, condiciona o meio em uma incubadora com 5% de CO2 por 2-3 horas antes do uso. Aprotinina é um inibidor de protease serino que é amplamente utilizado para reduzir a taxa de degradação fibrina20.
- Resseque o bioreator. Use uma seringa para fornecer um adicional de 5 ml de meio condicionado de CO2 através do encaixe farpado na porta de entrada. Dispense o meio lentamente e certifique-se de que todo o volume da câmara bioreatorial esteja preenchido. Remova cuidadosamente bolhas que se formam no bioreator.
- Fornecer alimentos frescos, 5% de CO2 condicionado ao bioreator durante todo o experimento, a fim de manter o pH, fornecer nutrientes e remover resíduos. Configure uma bomba de seringa com uma seringa de 10 ml ou 30 ml preenchida com 5% de CO2 médio condicionado. Conecte a seringa diretamente à porta de entrada na tampa bioreaator com tubos estéreis equipados com luer. Remova o encaixe masculino e conecte a tubulação ao encaixe farpado no bioreator (ver Figura 1C).
- Defina a taxa de perfusão para 0,01 ml/min. Conecte pedaços modificados de tubulação em ambas as portas de tomada e coloque as extremidades em um béquer de 100 ml para coletar resíduos.
- Use uma tomada de laboratório para definir as alturas das rações de entrada e saída para que um diferencial de pressão não se desenvolva no bioreator (consulte a Figura 1D para referência).
- Se um bioreator não estiver disponível, prepare amostras em placas de Petri de fundo de vidro de 35 mm com topos de vidro. Use um com um tamanho de deslizamento de cobertura que seja otimizado para o conjunto específico de objetivos a serem utilizados. As amostras que são preparadas em placas de Petri devem ser mantidas em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
Nota: O poliestireno despolariza a luz e interferirá com a imagem dic, por isso os topos de vidro devem ser usados se a imagem DIC for conduzida. O contraste de fase é uma modalidade de imagem alternativa adequada. A transferência de pratos entre a incubadora e o microscópio dificultará o registro de imagens. Se as imagens não estiverem devidamente registradas, a cepa calculada na Seção 6 não será precisa.
5. Imagem de lapso de tempo
- Uma vez que a amostra tenha sido preparada, resseque o bioreator, reconecte os blocos de aquecimento e os termopares, e coloque a temperatura do bioreator a 37 °C.
- Coloque o bioreator no estágio motorizado montado no microscópio. Posicione o objetivo DIC 20X sob a porta de exibição. Um objetivo de ampliação mais baixo é aceitável, particularmente se um estágio motorizado de precisão não estiver disponível. Certifique-se de que o polarizador, o analisador e o prisma estejam todos no lugar. Alternativamente, as amostras também podem ser imagens usando contraste de fase.
- Abra o software de imagem.
- Concentre o objetivo na área entre as três explantas.
- Salve as coordenadas (x, y e z) deste local no software de imagem.
- Para imaginar toda a área entre e ao redor das explants selecione a opção de adquirir uma imagem grande e especifique o tamanho da área. Isso permitirá a aquisição de múltiplas imagens ao redor da área especificada e criará uma imagem de ladrilho que representa uma região maior da amostra.
- Defina o tempo de exposição e a intensidade da luz aos menores valores possíveis para evitar a morte celular causada pela fonoxoxicidade, ao mesmo tempo em que fornece resolução suficiente para discriminar entre células, microesferas e fibras fibrinas.
6. Rastreamento de tensão
Para obter detalhes e instruções sobre o software de rastreamento de tensão(Figura 2) usado consulte Raghupathy et al. 21 O algoritmo é um código MATLAB personalizado que pode ser baixado a partir de http://www.license.umn.edu/default.aspx. Observe que as imagens DIC geralmente têm textura suficiente para o rastreamento de tensão. As microesferas estão incluídas para servir como uma verificação nos campos de tensão calculados. Se o rastreamento de tensão for feito, é fundamental que as imagens obtidas sejam tiradas exatamente no mesmo local para que as imagens sejam registradas. Imagens não registradas produzirão cepas espúrias.
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Representative Results
A remodelagem tecidual é um processo complexo que é impulsionado em parte por interações físicas recíprocas entre as células e a matriz circundante. As células reorganizam as fibras circundantes e geram tensão na rede de fibras. O alinhamento das fibras e do ambiente mecânico, por sua vez, controla o comportamento celular, de modo que tanto as células quanto a matriz globalmente se reorganizam para produzir tecido remodelado. Neste experimento, as células das explanações, inicialmente redondas em morfologia, começaram a se estender até o gel e aderir às fibras fibrinas(Figura 3). As células exerciam forças de tração que se propagavam através do gel e induziam o alinhamento da fibra paralelo ao eixo entre explantas. Em poucas horas as "alças" tornaram-se visíveis(Figura 3A). As medições de cepas também indicaram que as maiores cepas são transversais ao eixo entre explantas(Figuras 3D e 3E). As cepas são mais altas nesta região porque as fibras dessa região são livres para traduzir para o eixo.
Este protocolo fornece um modelo simples para o estudo da remodelação da matriz induzida por células e os efeitos do alinhamento de fibras no comportamento celular. O uso de explants celulares fornece um meio para controlar facilmente a distribuição espacial de aglomerados de células (ou seja, explantas). As explantas também concentram forças geradas por células para que o alinhamento de fibras seja rapidamente gerado em uma pequena área que pode ser facilmente imagen. Imagens de ladrilhos de alta resolução das explanações e da área circundante são então usadas para quantificar a reorganização matricial (Figuras 3B e 3C) em resposta a variações em condições experimentais.
Figura 1. (A) Esquema de uma configuração de explant triangular em um gel de fibrina. (B) Um estêncil parafilm colado na parte inferior da porta de visão bioreatorial pode ser usado para orientar a colocação de explant. (C) O bioreator montado é (D) colocado no estágio motorizado de precisão para imagens de lapso de tempo. Uma bomba de seringa fornece meio condicionado a uma taxa constante. Um béquer coleta meio de saída. Está posicionado em uma altura apropriada para minimizar as diferenças de pressão no bioreator.
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Figura 2. Gui de rastreamento de tensão. Esquerda: Uma grade é criada sobre a área da imagem DIC que será analisada. Certo: O algoritmo, que é baseado na correlação espacial, encontra os deslocamentos de pixels entre imagens que resultam na maior correlação (ou seja, o pico).
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Figura 3. Microscopia de lapso de tempo e rastreamento de tensão de reorganização fibrina entre explantas. ( A )Orealinhamento da fibra foi observado entre explantas através da captura de imagens de ladrilhos utilizando um objetivo DIC de 20X. Os quadros individuais foram extraídos da imagem de ladrilhos em (B) t = 0 hr e (C) t = 24 horas para analisar a reorganização da fibra na área entre explantas celulares. (D) As parcelas de contorno mostram a distribuição da cepa principal máxima na área correspondente à "correia".
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Discussion
Este protocolo foi desenvolvido com o objetivo de observar e quantificar a mecânica envolvida na remodelação do ECM mediado por células. Tais processos estão por trás de uma série de fenômenos biológicos e têm implicações importantes para os tecidos de engenharia2,22, reduzindo a cicatriz1,23, e entendendo a remodelação do tecido patológico12,24. O uso de microscopia DIC de lapso de tempo permite resolver e quantificar o deslocamento e o alinhamento das fibras fibrinas que ocorrem como resultado das forças de tração celular. A reorganização aqui observada é a primeira etapa do processo de remodelação, e segue os padrões organizacionais observados no colágeno11. A reorganização é seguida por uma combinação de degradação fibrina e síntese de ECM. Considerando que a etapa reorganizatória da remodelação ocorre ao longo de algumas horas a poucos dias, a etapa de síntese do processo de remodelação leva semanas para se desenrolar13. O sistema descrito aqui é capaz de operar por semanas, e por isso pode ser adaptado para monitorar esses eventos de estágio posterior.
Possíveis modificações nesta técnica podem envolver a variação da localização, número e tamanho das explantas para criar diferentes geometrias e observar diferenças nos padrões de alinhamento. Explantas também podem ser incorporadas dentro do gel em vez de na superfície, colocando as explantas entre camadas de fibrina. Outras modificações podem envolver o uso de outras fibras formando géis em vez de fibrina, como colágeno, ou adicionando outras proteínas de matriz extracelular, como fibronectina ou ácido hialurônico.
Independentemente de qual conjunto de variáveis experimentais é escolhido, o sucesso do experimento depende criticamente do apego celular. Portanto, é importante que se utilize o microscópio para verificar se as explantas se anexaram à superfície do gel antes de adicionar meio cultura, pois a tesoura de fluido pode remover as explantas do gel de fibrina. Outro desafio que se pode encontrar é manter as células da explanta juntas ao pipeta-las sobre o gel. Se isso se tornar um problema pode-se modificar a etapa 4.4 para que a pelota celular seja resuspendida em quantidades iguais de DMEM e recém-misturada 0,5 mg/ml de colágeno tipo I reconstituído. Adicionar uma quantidade diluída de colágeno pode ajudar a manter as células da explanta juntas. Este procedimento pode ser comparado ao método de matrizes de colágeno aninhados desenvolvido por Grinnell et al., onde a migração celular e as mudanças na microestrutura de colágeno também podem ser estudadas colocando géis de colágeno povoados por células em géis de colágeno acelulares25,26. A obtenção de imagens focadas ao longo do experimento também é muito importante. Manter o foco pode ser difícil porque as explantas se movem para baixo à medida que o gel compacta e diminui na espessura. Como resultado, o refoco será necessário desde que o gel compacte. Finalmente, as explantas podem se desprender do gel durante o experimento devido à tensão mecânica excessiva27,degradação da fibrina ou alguma combinação dos dois. Se as fibras rasgarem devido à tensão mecânica pode-se tentar reduzir o número de células em uma explanta e aumentar a concentração de fibrina no gel. Observamos problemas de desprendimento devido à degradação da fibrina em torno da explanta que desaparecem quando inibidores de plasmin, como a aprotinina (como usado aqui) ou ácido epsilon-aminocaproico (ACA) são incluídos no meio.
Optamos por usar o DIC como nossa modalidade de imagem para esses experimentos, pois o DIC permite que se exercite as fibras e o processo de alinhamento de fibras por longos períodos de tempo de forma a minimizar os danos celulares da exposição à luz (ou seja, fototoxicidade). A imagem de contraste de fase também pode ser usada, mas a resolução de fibras individuais é inferior à DIC. Nenhuma dessas modalidades de imagem, no entanto, fornece informações sobre o realinhamento de fibras que ocorrem fora do plano ( ouseja, através da espessura da amostra) e, portanto, a interpretação dos dados deve ter essa limitação em mente. Essas informações podem ser obtidas com microscopia confocal, desde que possíveis problemas com fototoxicidade sejam abordados na configuração do experimento. Finalmente, as imagens DIC contêm um gradiente de contraste (ou seja, eixo de corte) que afeta a visibilidade das fibras de forma dependente de ângulo. Como resultado, algumas direções de fibra serão mais fáceis de visualizar do que outras.
Aplicações futuras desta técnica podem envolver observar o efeito das condições de fronteira, a distância explanta-para-explantar e a geometria do gel na reorganização da fibra. Técnicas de análise de imagens, como o algoritmo de rastreamento de tensão usado aqui, podem ser usadas para quantificar como cada um desses fatores contribui para a reorganização do gel e o processo de remodelação. Por exemplo, encontramos diferenças quantificáveis no campo de tensão de explants triangulares com limites fixos e livres no avião28. Essa técnica também pode ajudar na dissecação de vias mecanobiológicas envolvidas na migração celular e remodelação tecidual, bem como como esses processos podem ser modulados por vários bioquímicos. Esses dados também podem ser usados como insumos valiosos para o desenvolvimento de modelos computacionais e para avaliar suas capacidades preditivas29.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
Acknowledgments
Agradecemos a George Giudice e Steven Eliason por doarem fibroblastos dérmicos humanos e Ramesh Raghupathy por ajuda com o algoritmo de rastreamento de cepas. O apoio a este trabalho foi fornecido por um Departamento de Educação do Departamento de Educação dos EUA em Áreas de Bolsa de Necessidade Nacional (GAANN P200A120071).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Molecular Probes | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Biotense Bioreactor | ADMET | ||
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | ||
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
References
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