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Summary
Cellules DNabT sont rares chez les cellules T périphériques; cependant, ils sont abondants dans certains tissus non lymphoïdes. Difficulté d'isoler les cellules T DN à partir de tissus non lymphoïdes entrave leur analyse fonctionnelle malgré l'augmentation reconnu l'importance physiopathologique. Nous décrivons un nouveau protocole pour l'isolement de cellules T DN hautement purifiés à partir de rein de souris.
Abstract
Il n'existe actuellement aucun protocole standard pour l'isolement de cellules T DN à partir des tissus non lymphoïdes, malgré leur implication de plus en plus rapportée dans diverses réponses immunitaires. DN cellules T sont un type de cellule immunitaire unique qui a été impliquée dans la régulation des réponses immunitaires et de la tolérance aux allogreffes et auto-immunes 6.1. Cellules T DN sont cependant rares dans le sang périphérique et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions rate et les ganglions), mais sont des résidents du rein normal. On sait très peu sur leur fonction physiopathologique 7 en raison de leur rareté dans la périphérie. Nous avons récemment décrit une analyse phénotypique et fonctionnelle complète de cette population dans le rein 8 dans l'état d'équilibre et pendant les lésions de reperfusion de l'ischémie. Analyse de la fonction des cellules T DN sera grandement améliorée par l'élaboration d'un protocole pour l'isolement du rein.
Ici, nous décrivons un nouveau protocole qui permet isolation de cellules hautement purs ab CD4 + CD8 + T et les cellules T DN du rein murin. En bref, nous digérer le tissu rénal en utilisant de la collagénase et d'isoler les cellules mononucléaires (rein) KMNC par gradient de densité. Ceci est suivi par deux étapes pour enrichir les cellules T hématopoïétiques de 3% à 70% de KMNC. La première étape consiste en une sélection positive des cellules hématopoïétiques CD45 + en utilisant un kit d'isolement. Dans la seconde étape, les cellules T sont isolées à DN négativement par élimination des cellules non désirées à l'aide de CD4, CD8, CMH de classe II et les anticorps monoclonaux et CD1d α-GalCer tétramère. Cette stratégie conduit à une population de plus de 90% de cellules T DN purs. la coloration de la surface avec les anticorps mentionnés ci-dessus, suivie par une analyse FACS est utilisée pour confirmer la pureté.
Introduction
Périphérique αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - double négatif cellules (DN) T sont divisés en différents sous-ensembles qui possèdent des phénotypes et des fonctions distinctes 1-4. Cellules T DN sont mal compris, mais de plus en plus impliqués dans les réponses immunitaires physiopathologiques dans différents modèles de maladies 4-6.
Cellules DN T sont un type de cellule immunitaire unique qui est de plus en plus impliqué dans la régulation de diverses réponses immunitaires et auto-immunes et la modulation de la tolérance allogreffe. 4-6, 9 Ils sont rares dans le sang périphérique et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions de la rate et des ganglions lymphatiques ). Cependant, ils sont les principaux habitants du rein et de l'intestin épithélium normal 10-12. On sait très peu sur leur fonction 7 dans le rein à l'état stationnaire et dans des conditions pathologiques telles que l'insuffisance rénale aiguë (IRA) associée à rein transplfourmi.
En raison des rôles complexes de cellules immunitaires différentes dans la régulation des réponses immunitaires, y compris alloresponses, définissant le rôle de chaque joueur est critique dans la compréhension alloresponses et la conception de nouveaux produits thérapeutiques. Étant donné le nombre important de cellules T DN présents dans le rein dans des conditions physiologiques et pathologiques différentes, les cellules T DN sont susceptibles de jouer un rôle critique dans la régulation des réponses immunitaires et auto-immunes chez la souris et chez l'homme, et alloresponses chez les greffés. Accumuler si la preuve encore dispersés implique cellules T DN dans les deux fonctions pathogènes et immunosuppresseurs, mais il est mal compris pourquoi et comment ils présentent une fonction nuisible ou suppressive spécifique et comment l'environnement influe sur leurs décisions.
En raison de leur faible abondance dans le rein, l'amélioration des méthodes d'isolement sont nécessaires.
Il n'existe actuellement aucun protocole standard pour l'isolement de cellules de T DN Tes tissus non lymphoïdes. Notre protocole décrit un nouveau procédé pour l'isolement de cellules provenant du rein DN T; Cependant, le procédé peut également être utilisé pour divers tissus non lymphoïdes.
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Protocol
1. Préparation des instruments, de la culture des médias et réactifs
- Instruments: Préparer les réactifs dans des conditions stériles et utiliser sous une hotte à flux laminaire.
- Préparer 1 litre de milieu de culture RPMI tissulaire, ajouter 5% de sérum fœtal bovin, 2,1 g de bicarbonate, de 10 ml de glutamate 100x, 10 mg d'HEPES, du pyruvate de sodium à 1 mg et de 10 ml de 100x de la pénicilline / streptomycine.
Note: le milieu de culture tissulaire recommandé, RPMI, est interchangeable avec DMEM. - Préparer une solution à 5% de collagénase "D" (5 ml de collagénase "D" à 9 ml de milieu de culture de tissu).
- Ajoutez la solution de Percoll à trois concentrations différentes: 100%, 80% et 40%. Les concentrations suivantes sont calculées pour 1 échantillon. Conserver les solutions à la température ambiante.
- Solution de Percoll: ajouter 9 ml de Percoll (non dilué de solution mère); ajouter 1 ml de PBS 10x.
- Solution de Percoll: ajouter 8 ml de Percoll 100%; ajouter 2 ml de PBS 1x.
- Solution de Percoll:ajouter 4 ml de Percoll 80%; ajouter 4 ml de PBS 1x.
- Ajoutez 1 L de cellules activé par fluorescence (FACS) tampon; ajouter 5 ml 10% de BSA (BSA à 0,1%), l'azoture de sodium 1 ml de 10% (0,1%), l'agent 2 ml d'EDTA, faire jusqu'à 1000 ml avec PBS 1x.
2. Préparation du rein Digestion
- Ayant acquis une approbation institutionnel nécessaire, sacrifier et être exsangue la souris avec les méthodes standard et en suivant les réglementations en vigueur et des directives de protection des animaux.
- Anesthésier les souris avec du pentobarbital (0,07 mg / kg).
- Passez à la saignée.
- Placez la souris dans une position couchée sur une table d'opération.
- Pulvériser la zone abdominale avec 70% d'éthanol.
- Ajouter 10 ml de solution de collagénase D de la boîte de Pétri.
- Retirez et décapsuler les deux reins de chaque souris.
- Ouvrir la cavité de abdomimal en faisant une incision médiane abdominale à travers la peau et du péritoine du sternum aule pubis.
- Exposer le rein gauche en déplaçant l'intestin latéralement sur le côté.
- Séparez délicatement la capsule gauche avec la pince.
Remarque: La capsule apparaît comme une couche transparente qui entoure le rein et partiellement recouvert par le tissu adipeux périrénal. - Retirez le rein gauche en coupant les vaisseaux pédiculaires en utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux.
- Répétez cette procédure pour le rein droit.
Remarque: Le rein droit est plus crânienne et plus proche de la ligne médiane (pédicelles sont plus courts).
- Placez le rein dans la boîte de Pétri.
- Couper le tissu rénal en petits morceaux (1 à 2 mm en dimension) en utilisant une lame de mise en forme régulière de métal et placer les morceaux dans la solution de collagénase pendant 30 à 45 min dans un incubateur à 37 ° C (figure 1).
3. Préparation des cellules mononucléées du rein (KMNC) à partir de la digestion du rein
- Obtenir une suspension de cellules du reindigestion par perturbant mécaniquement le tissu à l'aide d'une passoire (70 um) et remettre en suspension dans 25 ml de milieu de culture de tissus et mélanger.
- Centrifuger à 400 g pendant 10 min à 4 ° C pour sédimenter la suspension cellulaire.
- Re-suspendre le culot dans 4 ml d'une solution de Percoll à 40% et doucement superposer à 4 ml d'une solution de Percoll à 80% avec une pipette de transfert de matière plastique, très lentement et avec précaution. Cela se traduira en deux phases nettement séparées par une couche translucide. Sur le sommet sera une couche jaune correspondant aux lipides.
- Centrifuger à 1500 g pendant 30 min à température ambiante avec la centrifugeuse dans le mode frein.
- Retirer par aspiration de la couche supérieure jaune et épaisse (environ 1-2 ml).
- Ne recueillir que la légère couche translucide blanchâtre de l'interface des deux phases avec une pipette de transfert. Transférer très soigneusement cette suspension dans un tube conique de 15 ml contenant 2 ml de milieu de culture tissulaire, puis ajouter 13 ml de milieu pour obtenir un volume total de15 ml.
- Centrifuger à 400 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Remettre en suspension les échantillons dans 1 ml de milieu.
- Comptez le nombre de KMNC utilisant exclusion au bleu trypan sur un hématimètre et exprimer les résultats sous forme de nombres de KMNC par ml par rein.
- Laver une fois comme ci-dessus.
4. Isolation de hématopoïétiques (CD45 +) Les cellules de KMNC (étape I)
- Remettre en suspension les cellules jusqu'à 10 7 dans 90 ul de tampon de migration.
- Ajouter 10 ul de microbilles CD45 et incuber pendant 15 min à 4 ° C.
- Ajouter 1 ml de tampon courante pour arrêter la réaction. Centrifuger à 400 g pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 500 ul de tampon de migration.
- Préparer la colonne magnétique en plaçant à l'aimant et rincer avec 3 ml de tampon de migration.
- Faire passer la suspension de cellules à travers la colonne magnétique et de recueillir les cellules non marquées qui passent à travers la colonne.
- Laver les cellules trois fois avec 3 ml de runntion tampon. Ramassez ensuite l'effluent.
- Supprimez la colonne du séparateur et la pipette 5 ml de tampon fonctionnant sur les colonnes et débusquer la fraction marqué immédiatement. Cette fraction contient des cellules CD45 +. Compter les cellules.
- Pour calculer le nombre absolu de cellules T différents sous-ensembles dans les reins de multiplier le nombre total de KMNC par le pourcentage de cellules positives déterminé par cytométrie de flux (Figure 2).
5. L'isolement de cellules T DN CD45 + de préparation par une sélection négative (étape II)
- Ajouter 2,5 pi (0,5 mg / ml, 1,25 ug) de chacun des anticorps biotinylés suivants: anti-CD4, anti-CD8, anti-récepteur Fc (CD16/32), anti-CMH de classe II (I-Ab), anti- CD1d PBS-57 tétramère pour 10 cellules hématopoïétiques 7.
- Incuber les cellules pendant 30 min dans une chambre froide.
- Ajouter 1 ml microbilles anti-biotine.
- Incuber pendant 30 min dans une chambre froide.
- Placer le tube dans til aimant et procéder à l'épuisement.
- Compter le nombre de cellules viables pour déterminer le nombre total de cellules T DN dans la fraction négative en utilisant un hématimètre.
- Vérifiez la pureté des cellules T DN cytométrie de flux en suivant cette stratégie de déclenchement: première porte CD45 +, deuxième porte TCRaß +. Exclure CD1d cellules +. Terrain CD4 + CD8 + contre pour identifier les cellules T DN (Figure 3).
- Multipliez le nombre total par le pourcentage déterminé en pureté.
Note: L'utilisation de ce protocole pour résultat une population de plus de 90% de cellules T DN pures.
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Representative Results
Type sauvage C57BL / 6 (B6) rein contient environ 1.5 à 2.1 x 10 6 cellules mononucléées par les reins. Environ moins de 10% de CD45 + des cellules hématopoïétiques. Pour la préparation de cellules mononucléaires (rein KMNC), les reins sont découpés en petits morceaux comme le montre la figure 1, suivie par la digestion à l'aide de 5% de la collagénase.
Ceci est suivi par l'exécution d'une centrifugation en gradient de densité à collecter KMNC couche (Figure 2, panneau de gauche). KMNC ont été ensuite soumis à une sélection positive en utilisant CD45 + microbilles magnétiques comme décrit dans la section 4 (STEP I). Les cellules de la colonne liée ont ensuite été élues et analysés pour CD45 + par FACS. Cela se traduit par un enrichissement de cellules CD45 + à environ 80 à 95% selon l'analyse par cytométrie de flux (Figure 2, panneau du milieu). Parmi CD45 + cellules hématopoïétiques enrichies, environ 40-60% était αβ TCR + (données non présentées), environ 30-60% étaient des cellules T DN (figure 2, panneau de droite).
La dernière étape a consisté à soumettre CD45 + cellules enrichies à la sélection négative à étiqueter et retirer CD4 +, CD8 +, le CMH de classe II + et + CD16/32 cellules en utilisant Acm spécifiques de la biotine et les microbilles anti-biotine et de colonnes magnétiques. Ce résultat dans hautement purifié (90-95%) des cellules T DN (Figure 3). Après ce protocole, il est possible d'obtenir jusqu'à 0,5 x 10 6 cellules hématopoïétiques CD45 + magnétiquement marquées par la souris (deux reins).
Figure 1. Préparation du rein pour une digestion avec une solution de collagénase de 5%. L'rein de souris est coupé en petits morceaux de 1 à 2 mm et placé dans une solution de collagénase D à 5% pendant 30 min pour creuserestion. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 2 Stratégie pour l'enrichissement de CD45 + cellules hématopoïétiques du rein gauche:.. CD45 coloration de rein MNC avant l'enrichissement en utilisant le kit CD45 + par sélection positive Center: CD45 coloration de rein MNC après enrichissement en utilisant le kit CD45 + par sélection positive droit.: CD4 et CD8 profil de αβTCR + cellules CD45 + entre les cellules bloquées différents de sous-ensembles de cellules T. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 3 Pureté des cellules DN T isolés gauche:. CD45 coloration des cellules de rein isolé DN T par sélection négative Center:.. TCRaß coloration des cellules de rein isolé DN T par sélection négative de droite: CD4 et CD8 coloration entre les cellules DN T isolés par sélection négative. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Lymphocytes dans le rein avant purification.
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Discussion
Il ya un intérêt croissant dans les cellules T DN car ils sont impliqués dans différentes pathologies telles que les troubles auto-immunes, le cancer, la tolérance du greffon, et les maladies primaires du rein, y compris insuffisance rénale aiguë (IRA), la glomérulonéphrite 8, 13. Par conséquent, il est nécessaire de mieux comprendre et caractériser les fonctions physiopathologiques de cellules T DN. Toutefois, actuellement, il ya un manque de compréhension de la fonction de ces cellules par rapport aux cellules CD4 et CD8 T. Une des principales raisons est la rareté des cellules DN T dans les organes lymphoïdes secondaires et donc de la difficulté à obtenir suffisamment de cellules pour l'analyse in vitro et des expériences de transfert adoptif. Cellules T DN sont principalement situés dans les tissus non lymphoïdes tels que le rein 8 mais le manque de méthodes fiables pour leur isolement organe solide entrave les efforts visant à enquêter sur leur fonction. Par conséquent, notre nouveau protocole pour l'isolement de cellules T DNs à partir du rein est prévu afin d'accélérer la recherche dans la fonction des cellules T DN. Cellules DN T s'accumulent dans les ganglions lymphatiques en grand nombre dans Fas déficient (LPR) ou souris FasL déficient (de GLD) et ils peuvent être facilement isolés à partir des organes lymphoïdes 9, 14, 15, mais il reste encore un défi à isoler ces cellules à partir d'autres tissus.
Selon ce protocole, les reins de deux souris produisent environ 0,5 x 10 6 cellules hématopoïétiques (CD45 +) et environ 0,2 x 10 6 cellules T DN. Ce nombre est suffisant pour effectuer la culture in vitro, des dosages fonctionnels et / ou l'analyse de FACS. La pureté de la population de cellules T DN doit être confirmée par cytométrie en flux. Ce protocole prévoit une population de cellules T DN qui peuvent être aussi pur que 98%. Bien que ce protocole est conçu pour l'isolement de cellules provenant du rein DN T, il peut être modifié pour l'isolement de lymphocytes T provenant d'autres organes non lymphoïdes telles le cœur, thyroïde, etc
Comme les cellules T DN représentent une petite population, il est parfois nécessaire d'augmenter le rendement en effectuant des tours supplémentaires de purification. Toutefois, si un plus grand nombre de cellules T DN est nécessaire (supérieur à 0,5 x 10 6 cellules), nous recommandons d'effectuer le tri séparation afin de réduire le temps et le coût de réactif.
En résumé, ce protocole décrit une nouvelle méthode pour l'isolement de cellules de rein T DN. Il est composé d'une préparation (par l'intermédiaire de la digestion et de l'enrichissement de KMNC) Étape suivie par la sélection positive et la sélection négative de l'épuisement des populations cellulaires non désirées. Par conséquent, il existe un minimum de manipulation directe de cellules T DN pendant le processus d'isolement. Il est à noter qu'il existe des protocoles existants pour l'isolement de cellules du sang périphérique chez la souris et chez l'homme et des organes lymphoïdes secondaires, similaires à ceux utilisés pour l'isolement de cellules T conventionnelles T DN.
ove_content "> Parce qu'il a été démontré que certaines cellules DN T expriment FcR-γ, une autre option est de ne pas inclure CD16/32 + dans le cocktail 16, 17. l'isolement réussie de cellules T DN nécessite une grande attention aux détails. particulièrement cruciale étapes: la digestion du tissu, la coupe du tissu rénal en petits morceaux, et d'identifier correctement et recueillir la couche de la lumière dans le gradient de densité globale, plusieurs séries de la pratique et une certaine dextérité manuelle sont nécessaires pour obtenir le résultat souhaité..Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par le NIH PBS (R21 AI095484). Nous remercions l'installation centrale de tétramère INSA de CD1d tétramère.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37 °C with 5% CO2) | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10x | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-MHC class II (I-A b) biotinylated | BD | 553609 | |
| AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys - Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| CD1d α-galcer tetramer | NHI |
References
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Immunologie Numéro 87 Double Negative (DN) αβ les cellules T l'isolement CD45 + des cellules T les lymphocytes rénales non lymphoïdes-tissus les cellules T purification l'ischémie-reperfusion l'insuffisance rénale aiguë tissus résident lymphocytes Syndromes lymphoprolifératifs lupus érythémateuxErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 02/10/2016.
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Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle
