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Immunology and Infection

Isolierung von Double Negative αβ T-Zellen aus der Niere

Published: May 16, 2014 doi: 10.3791/51192
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

DNabT Zellen sind selten unter peripheren T-Zellen; aber reichlich sind sie in bestimmten Nicht-lymphatischen Gewebe. Schwierigkeitsgrad der Isolierung DN T-Zellen von nicht-lymphatischen Gewebe behindert ihre Funktionsanalyse trotz steigender erkannt pathophysiologische Bedeutung. Wir beschreiben eine neue Methode zur Isolierung von hoch gereinigten DN T-Zellen aus murinen Niere.

Abstract

Derzeit gibt es keine Standard-Protokoll für die Isolierung von DN-T-Zellen von den nicht-lymphatischen Gewebe trotz ihrer zunehmend berichtet Beteiligung an verschiedenen Immunantworten. DN-T-Zellen sind eine einzigartige Immunzelltyp, der bei der Regulierung der Immun-und Autoimmunreaktionen und Toleranz zu allotransplants 1-6 gebracht wurde. DN-T-Zellen sind jedoch selten im peripheren Blut und sekundären lymphatischen Organen (Milz und Lymphknoten), jedoch sind die Haupt Bewohner der normalen Niere. Sehr wenig ist über die pathophysiologische Funktion 7 aufgrund ihrer Mangel in dem Umfang bekannt. Wir haben vor kurzem beschrieben, eine umfassende phänotypische und funktionelle Analyse dieser Bevölkerung in der Niere 8 in stationären und während der Ischämie Reperfusion. Analyse der DN-T-Zell-Funktion wird stark durch die Entwicklung eines Protokolls für ihre Isolation von der Niere verbessert werden.

Hier ein neues Protokoll, das ermöglicht isolatio beschreiben wirn von hochreinem ab CD4 + CD8 + T-Zellen und DN-T-Zellen aus der Maus-Nieren. Kurz gesagt, wir verdauen Nierengewebe mittels Collagenase und zu isolieren, Nierenmononuklearen Zellen (KMNC) durch Dichtegradientenzentrifugation. Dies wird durch zwei Schritte auf hämatopoetischen T-Zellen von 3% bis 70%, gefolgt von KMNC bereichern. Der erste Schritt besteht aus einer positiven Selektion von hämatopoetischen Zellen mit einer CD45 +-Isolierungs-Kit. Im zweiten Schritt werden negativ DN-T-Zellen durch Entfernen von nicht-gewünschten Zellen mit CD4, CD8, MHC Klasse II und monoklonale Antikörper und CD1d α-GalCer Tetramer isoliert. Diese Strategie führt zu einer Bevölkerung von mehr als 90% rein DN T-Zellen. Oberflächenfärbung mit den oben erwähnten Antikörper, gefolgt von FACS-Analyse wird verwendet, um die Reinheit zu bestätigen.

Introduction

Periphere αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - doppelt-negative (DN) T-Zellen werden in verschiedene Untergruppen, die unterschiedliche Phänotypen und Funktionen besitzen 1-4 unterteilt. DN-T-Zellen sind wenig verstanden, aber zunehmend auch in pathophysiologischen Immunantworten in verschiedenen Krankheitsmodellen 4-6 verwickelt.

DN-T-Zellen sind eine einzigartige Immunzelltyp, der immer an der Regulation von verschiedenen Immun-und Autoimmunreaktionen und die Modulation der Allotransplantat-Toleranz in Verbindung gebracht wird. 4-6, 9 Sie sind selten im peripheren Blut und sekundären lymphatischen Organen (Milz und Lymphknoten ). Allerdings sind sie großen Bewohner der normalen Nieren-und Darmepithel 10-12. Sehr wenig ist über ihre Funktion 7 in der Niere im stationären Zustand und unter pathologischen Bedingungen, wie akute Nierenschädigung (AKI) mit Nieren Transpl. verbundenen bekanntAmeise.

Wegen der komplizierten Rollen der verschiedenen Immunzellen bei der Regulierung der Immunantworten einschließlich alloresponses, die Definition der Rolle der einzelnen Spieler ist entscheidend für das Verständnis alloresponses und Gestaltung neuer Therapeutika. Angesichts der erheblichen Zahl von DN-T in der Niere unter physiologischen und unterschiedliche Krankheitszustände vorliegenden Zellen sind DN-T-Zellen wahrscheinlich eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Immun-und Autoimmunreaktionen in Mäusen und Menschen, und alloresponses bei Transplantatempfängern spielen. Thesaurierend wenn auch noch zerstreut Beweise bringen DN-T-Zellen in beiden pathogenen und immunsuppressive Funktionen, aber es ist schlecht verstanden, warum und wie sie eine spezifische schädliche oder drück Funktion aufweisen und wie die Umwelt beeinflusst sie.

Aufgrund ihrer geringen Menge in der Niere, sind verbesserte Verfahren zur Isolierung erforderlich.

Derzeit gibt es keine Standard-Protokoll für die Isolierung von DN T-Zellen von ter nicht-lymphatischen Geweben. Unser Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zur Isolierung von DN-T-Zellen aus der Niere; Jedoch kann das Verfahren auch für verschiedene nicht-lymphoiden Geweben verwendet werden.

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Protocol

1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und Reagenzien

  1. Instrumente: Bereiten Sie die Reagenzien unter sterilen Bedingungen und unter Verwendung einer Steril.
  2. Herstellung von 1 l RPMI-Gewebekulturmedium mit 5% fötalem Rinderserum, 2,1 g Natriumbicarbonat, 10 ml Glutamat 100x, 10 mg HEPES, 1 mg Natriumpyruvat und 10 ml 100x Penicillin / Streptomycin.
    Hinweis: Die empfohlene Gewebekulturmedium RPMI, ist austauschbar mit DMEM.
  3. Vorbereitung 5% Collagenase "D"-Lösung (5 ml Collagenase "D" zu 9 ml Gewebekulturmedium).
  4. Machen Percoll-Lösung bei drei verschiedenen Konzentrationen: 100%, 80% und 40%. Die folgenden Konzentrationen sind 1 Probe berechnet. Halten Lösungen bei Raumtemperatur.
    1. Percoll Lösung: 9 ml unverdünntem Percoll (aus Stammlösung); 1 ml PBS 10x.
    2. Percoll-Lösung: 8 ml Percoll 100%; 2 ml PBS 1x.
    3. Percoll-Lösung:4 ml Percoll 80%; 4 ml PBS 1x.
  5. Auffüllen auf 1 L der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)-Puffer; 5 ml 10% BSA (0,1% BSA), 1 ml 10% Natriumazid (0,1%), 2 ml EDTA-Agent, machen bis zu 1.000 ml mit 1x PBS.

2. Vorbereitung von Nieren Verdauung

  1. Nach dem Erwerb aller erforderlichen institutionellen Genehmigung opfern und exsanguinate die Mäuse mit Standardmethoden und nach den aktuellen Vorschriften und Tierpflege-Richtlinien.
    1. Betäuben die Maus mit Pentobarbital (0,07 mg / kg).
    2. Fahren Sie mit dem Ausbluten.
    3. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf einem Operationstisch.
    4. Sprühen Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol.
  2. 10 ml Collagenase D Lösung der Petrischale.
  3. Entfernen und entkapseln beide Nieren aus jeder Maus.
    1. Öffnen abdomimal Hohlraum, indem eine Mittelschnitt durch die Bauchhaut und Peritoneum vom Brustbein bisdas Schambein.
    2. Die linke Niere freizulegen, indem der Darm seitlich zur Seite.
    3. Trennen Sie vorsichtig die linke Kapsel mit der Zange.
      Hinweis: Die Kapsel wird als transparente Schicht rund um die Nieren-und teilweise durch perinephric Fettgewebe bedeckt.
    4. Entfernen Sie die linke Niere durch Schneiden der Stiel Schiffe, die mit einer chirurgischen Schere.
    5. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die rechte Niere.
      Hinweis: Die rechte Niere ist Schädel und näher an der Mittellinie (Blütenstiele sind kürzer).
  4. Legen Sie die Niere in der Petrischale.
  5. Schneiden Sie das Nierengewebe in kleine Stücke (1-2 mm in der Abmessung) mit einem normalen Metallformung Klinge und legen die Stücke in den Collagenase-Lösung für 30-45 min im Brutschrank bei 37 ° C (Abbildung 1).

3. Vorbereitung von Nieren mononukleären Zellen (KMNC) aus der Niere Verdauung

  1. Eine Zellsuspension zu erhalten, der NiereVerdauung durch mechanisches Aufbrechen der Gewebe mit einem Sieb (70 um) und Resuspension in 25 ml Gewebekulturmedium und mischen.
  2. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C, um die Zellsuspension pelletieren.
  3. Re-suspend das Pellet in 4 ml 40% Percoll-Lösung und sanft überlagern auf 4 ml 80% Percoll-Lösung mit einer Übertragungsplastikpipette, sehr langsam und vorsichtig. Dies wird in zwei Phasen klar durch eine transluzente Schicht getrennt führen. Auf der Oberseite wird eine gelbe Schicht, die den Lipiden sein.
  4. Zentrifugieren bei 1500 × g für 30 min bei Raumtemperatur mit der Zentrifuge in Brems Aus-Modus.
  5. Durch Absaugen entfernen das gelbe und dicke Deckschicht (ca. 1-2 ml).
  6. Sammeln nur die leichte weißlich durchscheinende Schicht von der Grenzfläche der beiden Phasen mit einer Transferpipette. Diese Suspension sehr sorgfältig übertragen in eine 15 ml konischen Röhrchen mit 2 ml Gewebekulturmedium und fügen Sie dann 13 ml Medium, um ein Volumen von insgesamt machen15 ml.
  7. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C.
  8. Resuspendieren der Proben in 1 ml des Mediums.
  9. Zähle die Anzahl der KMNC mit Trypanblau-Ausschluss auf einer Zählkammer und das Ergebnis wird als Zahl der KMNC pro ml pro Niere.
  10. Einmal wie oben waschen.

4. Isolierung von hämatopoetischen (CD45 +) Zellen aus KMNC (Schritt I)

  1. Resuspendieren der Zellen bis zu 10 7 in 90 ul des Laufpuffers.
  2. In 10 ul CD45-Mikroperlen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C
  3. 1 ml Laufpuffer, um die Reaktion zu stoppen. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C und Resuspendieren in 500 ul Laufpuffer.
  4. Vorbereitung der Magnetspalte, indem an dem Magneten und gründlich mit 3 ml Laufpuffer.
  5. Übergeben Sie die Zellsuspension durch die Magnetsäule und sammeln Sie die unmarkierte Zellen, die durch die Säule.
  6. Mit 3 ml runn Waschen Sie die Zellen dreimalten Puffer. Dann sammeln das Abwasser.
  7. Entfernen Sie die Spalte aus dem Separator und Pipette 5 ml Laufpuffer auf die Säulen und spülen Sie die markierten Bruch sofort. Diese Fraktion enthält die CD45 +-Zellen. Zählen Sie die Zellen.
  8. Um die absolute Anzahl verschiedener T-Zellen in Teilmengen Nieren Errechnung der Gesamtzahl von KMNC durch den Prozentsatz positiver Zellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt (Abbildung 2).

5. Isolierung von DN-T-Zellen aus CD45 + Vorbereitung durch negative Selektion (Schritt II)

  1. Add 2,5 ul (0,5 mg / ml, 1,25 &mgr; g) von jedem der folgenden biotinylierten Antikörper: anti-CD4, anti-CD8, anti-Fc-Rezeptor (CD16/32), Anti-MHC-Klasse II (IA b), anti- CD1d Tetramer PBS-57 für alle 10 7 hämatopoetischen Zellen.
  2. Inkubieren Zellen für 30 min in kalten Raum.
  3. 1 ml anti-Biotin-Mikrokügelchen.
  4. Inkubation für 30 min in einem kalten Raum.
  5. Das Röhrchen wird in ter Magnet und fahren Sie mit Erschöpfung.
  6. Zählen der lebensfähigen Zellen, die Gesamtzahl von DN-T-Zellen in der negativen Fraktion unter Verwendung einer Zählkammer bestimmen.
  7. Überprüfen Reinheit der DN-T-Zellen mit Durchflusszytometrie, indem Sie dieses Gating-Strategie: erste Tor CD45 +, zweite Tor TCRαβ +. Ausschließen CD1d +-Zellen. Grundstück CD4 + vs CD8 + T-Zellen auf DN (Abbildung 3) zu identifizieren.
  8. Multiplizieren Sie die Gesamtzahl der in der Reinheit bestimmt Prozentsatz.
    Hinweis: Die Verwendung dieses Protokolls zu einer Bevölkerung von mehr als 90% rein DN T-Zellen.

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Representative Results

Wildtyp C57BL / 6 (B6) Niere enthält etwa 1,5 bis 2,1 x 10 6 mononuklearen Zellen pro Niere. Weniger als etwa 10% hämatopoetische CD45 +-Zellen. Für die Herstellung von Nieren mononukleären Zellen (KMNC) werden die Nieren in kleine Stücke geschnitten, wie in Fig. 1 gezeigt, gefolgt von Verdauung mit Collagenase 5%.

Dies wird durch Durchführen einer Dichte-Gradienten-Zentrifugation auf KMNC Schicht (Fig. 2, links) zu sammeln, gefolgt. KMNC wurden dann auf positive Selektion unter Verwendung von CD45 + magnetische Mikroperlen, wie in Kapitel 4 (STEP I) beschrieben, unterzogen. Die Säule gebundenen Zellen wurden dann mittels FACS eluiert und für CD45 + analysiert. Dies führt zu einer Anreicherung von CD45 +-Zellen um etwa 80 bis 95%, bestimmt durch Durchflusszytometrie (Fig. 2, Mitte) analysiert. Unter angereicherten hämatopoetischen CD45 +-Zellen betrug etwa 40-60% αβ TCR + (Daten nicht gezeigt), etwa 30-60% waren DN-T-Zellen (Abbildung 2, rechts).

Der letzte Schritt beteiligt Werfen angereicherten CD45 +-Zellen, um die negative Selektion zu kennzeichnen und zu entfernen CD4 +, CD8 +, MHC-Klasse-II + und CD16/32 + Zellen unter Verwendung von Biotin spezifischen mAb und anti-Biotin-Mikrokugeln und magnetische Säulen. Dies führt zu hochgereinigten (90-95%) DN-T-Zellen (Fig. 3). Nach diesem Protokoll war es möglich, bis zu 0,5 x 10 6 CD45 + hämatopoetischen magnetisch markierte Zellen pro Maus (zwei Nieren) zu erhalten.

Figur 1
1. Herstellung der Niere für die Verdauung mit Collagenase 5% Lösung. Die Maus Niere wird in kleine Stücke von 1-2 mm geschnitten und in 5% Collagenase D Lösung für 30 min bei rabenestion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
. Abbildung 2 Strategie zur Anreicherung von CD45 + hämatopoetischen Zellen aus der Niere. Links:. CD45-Färbung von Nieren MNC vor der Anreicherung mit CD45 +-Kit durch positive Selektion Center: CD45-Färbung von Nieren MNC nach Anreicherung mit CD45 +-Kit durch positive Selektion Right.: CD4-und CD8-Profil von αβTCR + Zellen unter gated CD45 +-Zellen unterschiedliche Untergruppen von T-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses fi ansehengure.

Fig. 3
. Abbildung 3 Reinheit der isolierten DN T-Zellen. Links: CD45 Färbung der isolierten Niere DN-T-Zellen durch negative Selektion Center:.. TCRαβ Färbung der isolierten Niere DN-T-Zellen durch negative Selektion Rechts: CD4-und CD8-Färbung unter isolierten DN T-Zellen durch negative Selektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig. 4
4. Lymphozyten in der Niere vor der Reinigung. Rechts:. CD45-Färbung in Nierengewebe vor der Reinigung Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Es gibt immer mehr Interesse an DN-T-Zellen, da sie, die in verschiedenen pathologischen Bedingungen, wie Autoimmunerkrankungen, Krebs, Transplantat-Toleranz und primären Erkrankungen der Niere einschließlich akuten Nierenschädigung (AKI) in Verbindung gebracht, Glomerulonephritis 8, 13. Daher besteht Bedarf, die pathophysiologische Funktionen DN-T-Zellen besser zu verstehen und zu charakterisieren. Derzeit jedoch mangelt es in Verständnis der Funktion dieser Zellen im Vergleich zu CD4 und CD8 T-Zellen. Ein wesentlicher Grund ist Mangel an DN-T-Zellen in sekundären lymphatischen Organe und damit Schwierigkeiten bei der Beschaffung genügend Zellen für die in vitro Analyse und Adoptivtransferexperimenten. DN-T-Zellen werden vor allem in nicht-lymphatischen Geweben wie der Niere 8 gelegen, aber der Mangel an zuverlässigen Methoden für ihre Isolation von soliden Organ wird behindert die Bemühungen um ihre Funktion zu untersuchen. Daher unsere neue Methode zur Isolierung von DN T-Zellens von der Niere wird erwartet, dass die Erforschung der Funktion der DN-T-Zellen zu beschleunigen. DN-T-Zellen in Lymphknoten akkumulieren in großer Zahl in Fas-defizienten (LPR) oder FasL defizient (GLD) Mäusen und sie können leicht aus lymphoiden Organen 9, 14, 15 isoliert werden, aber es bleibt eine Herausforderung, diese Zellen von anderen zu isolieren, Gewebe.

Gemäß diesem Protokoll Nieren von zwei Mäusen ergeben etwa 0,5 x 10 6 hämatopoietische Zellen (CD45 +) und etwa 0,2 x 10 6 DN-T-Zellen. Diese Anzahl ist ausreichend, um in-vitro-Kultur, funktionellen Assays und / oder FACS-Analyse durchzuführen. Die Reinheit des DN-T-Zellpopulation muss durch Durchflusszytometrie bestätigt werden. Dieses Protokoll bietet eine Bevölkerung von DN-T-Zellen, die so rein wie 98% sein kann. Während dieses Protokoll für die Isolierung von DN-T-Zellen aus der Niere entwickelt, kann sie für die Isolierung von T-Zellen von anderen nicht-lymphoiden Organen modifiziert werden, wie Herz, Schilddrüse usw.

Seit DN T-Zellen stellen eine kleine Bevölkerung, ist es manchmal notwendig, um die Ausbeute durch Ausführen einer zusätzlichen Runden der Reinigung zu erhöhen. Wenn jedoch eine höhere Anzahl von DN-T-Zellen erforderlich ist (höher als 0,5 x 10 6 Zellen) empfiehlt sich die Durchführung Sortier Trennung, um Zeit-und Reagenzienkosten zu verringern.

Zusammenfassend Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zur Isolierung von DN-T-Zellen aus der Niere. Es wird von einem Präparat (über Verdauung und Anreicherung KMNC) zusammen Schritt für positive Selektion und negative Selektion zur Erschöpfung der nicht gewünschten Zellpopulationen gefolgt. Daher besteht eine minimale direkte Manipulation von DN-T-Zellen während des Isolierungsverfahrens. Es ist bemerkenswert, dass es bestehende Protokolle für die Isolierung von DN-T-Zellen aus peripherem Blut in Mäusen und Menschen und von sekundären lymphatischen Organen, ähnlich den für die Isolierung von herkömmlichen T-Zellen verwendet.

ove_content "> Denn es hat sich gezeigt, dass einige DN T-Zellen exprimieren FCR-γ, ist eine alternative Option nicht CD16/32 + in der Cocktail 16, 17 enthalten. Erfolgreiche Isolierung von DN T-Zellen erfordert viel Liebe zum Detail. Besonders entscheidend Schritte: Gewebe Verdauung, Schneiden des Nierengewebes in kleine Stücke, und korrekt zu identifizieren und sammeln das Licht Schicht in der Dichtegradienten Insgesamt werden mehrere Runden von Praxis und etwas handwerkliches Geschick erforderlich, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen..

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird von NIH PBS (R21 AI095484) unterstützt. Wir danken NHI Tetramer Core Facility für CD1d Tetramer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminar flow hood  Baker Company, Inc Or equivalent equipment 
Centrifuge Beckman Coulter Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Atmosphere-controlled incubator Fisher Scientific  (37 °C with 5% CO2)
Analytical flow cytometer LSR II
RPMI 1640 Media Tech 10-040-CV
Collagenase D Roche 11088858001
Percoll  GE Healthcare 17-0891-01
Fetal bovine serum  Corning Cellgro 35-011-CV
0.1% sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich S2002
Buffer phosphate buffered saline (PBS) Corning Cellgro 21-040-CV
PBS 10x Mediatech 46-013-CM
EDTA buffer  Sigma-Aldrich E1161
LS columns  MiltenyiBiotec 130-042-401
CD45+ microbeads MiltenyiBiotec 6.78E-51
Biotin microbeads  MiltenyiBiotec 130-090-485
anti-CD45 (clone: 30-F11)  PerCP  eBioscience G1397
anti-CD45 (clone: 30-F11)  APC-Cy7 Biolegend 103116
anti-TCR Pacific Blue  (ab-chain, clone: H57-597) Invitrogen HM3628
anti-CD4 PE eBioscience 12-0043
anti-CD8 FITC eBioscience 8011-0087
anti-CD4 biotinylated (GK1.5) BD 553728
anti-CD8 biotinylated  (clone 53-6.7) BD 553029
anti-MHC class II (I-A b) biotinylated BD 553609
AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer  MIlteny I Biotec 130-091-221
C57BL/6J mice Jackson Labs 000664 Kidneys - Lymph Nodes
Petri dish  BD Biosciences 356517
70 μm filter  Fisher Scientific 22363548
Plunger  Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 50 ml Bioexpress C-3394-3 Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 15 ml Bioexpress C-3394-1 Or equivalent equipment 
CD1d α-galcer tetramer NHI

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References

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Tags

Immunologie Double Negative (DN) αβ T-Zellen CD45 + T-Zellisolierung Nieren-Lymphozyten nicht-lymphatischen-Gewebe T-Zellen Reinigung Ischämie-Reperfusion Injury Acute Kidney Injury- Tissue-Einwohner-Lymphozyten Lymphoproliferative Störungen erythematodes Lupus

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 02/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

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Samantha Bandapelle

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Martina, M. N., Bandapalle, S.,… More

Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney. J. Vis. Exp. (87), e51192, doi:10.3791/51192 (2014).

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