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Immunology and Infection

Isolamento de duplas Células αβ T negativa do Rim

Published: May 16, 2014 doi: 10.3791/51192
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

DNabT células são raras entre as células T periféricas; no entanto, eles são abundantes em certos tecidos não linfóides. Dificuldade de isolar as células T DN a partir de tecidos não-linfóides dificulta a sua análise funcional, apesar do aumento reconhecida importância fisiopatológica. Descreve-se um novo protocolo para o isolamento de células altamente purificadas DN T de rim murino.

Abstract

Não existe actualmente nenhum protocolo padrão para o isolamento de células T DN dos tecidos não linfóides apesar do seu envolvimento cada vez relatada em diversas respostas imunitárias. DN células T são um tipo de células imunitárias única que tem sido implicado na regulação de respostas imunes e tolerância e auto-imunes a alotransplante 1-6. Células T DN são, no entanto, raro no sangue periférico e órgãos linfóides secundários (baço e linfonodos), mas são os principais habitantes do rim normal. Muito pouco se sabe sobre sua função fisiopatológica 7, devido à sua escassez na periferia. Recentemente, descreveu uma análise fenotípica e funcional abrangente desta população no rim 8 em estado estável e durante a isquemia reperfusão. Análise da função das células T DN será consideravelmente reforçada através do desenvolvimento de um protocolo para o isolamento do rim.

Aqui, descrevemos um novo protocolo que permite isolation de células altamente puros ab CD4 + CD8 + T e células T DN do rim murino. Resumidamente, podemos digerir tecido renal utilizando colagenase e isolamento de células mononucleares de rim (KMNC) por gradiente de densidade. Isto é seguido por dois passos para enriquecer as células T hematopoiéticas de 3% a 70% de KMNC. A primeira etapa consiste de uma selecção positiva de células hematopoéticas CD45 + usando um kit de isolamento. No segundo passo, as células T são DN negativamente isolado por remoção das células não desejadas usando CD4, CD8, e anticorpos monoclonais de MHC de classe II e CD1d α-GalCer tetrâmero. Esta estratégia conduz a uma população de mais do que 90% de células T DN puros. Coloração de superfície com os anticorpos acima mencionados, seguida por análise FACS é usado para confirmar a pureza.

Introduction

Peripheral αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - double-negativo células (DN) T são divididos em vários subgrupos que possuem fenótipos e funções 1-4 distintas. DN células T são pouco compreendidos mas cada vez mais a ser implicadas nas respostas imunes fisiopatológicas em diferentes modelos de doença 4-6.

Células DN T são um tipo de célula imunológica única que é cada vez mais implicados na regulação de várias respostas imunes e auto-imunes ea modulação da tolerância alotransplante. 4-6, 9 Eles são raros no sangue periférico e órgãos linfóides secundários (baço e linfonodos ). No entanto, eles são os principais moradores do rim e intestino epitélio normal 10-12. Muito pouco se sabe sobre sua função 7 no rim no estado estável e em condições patológicas como lesão renal aguda (LRA), associados com transpl renalformiga.

Devido às funções complexas de células imunes diferentes na regulação de respostas imunes, incluindo alloresponses, a definição do papel de cada jogador é fundamental na compreensão alloresponses e concepção de novas terapias. Dado o número significativo de células T DN presentes no rim em condições fisiológicas e de doenças diferentes, as células T DN são susceptíveis de desempenhar um papel crítico na regulação das respostas imunológicas e auto-imunes em ratos e seres humanos, e alloresponses em receptores de transplante. Acumulando embora a evidência ainda espalhados implica células T DN em ambas as funções patogênicos e imunossupressores, mas é mal compreendido por que e como eles exibem uma função prejudicial ou supressiva específico e como o ambiente influencia-los.

Devido à sua fraca abundância no rim, métodos melhorados de isolamento são necessárias.

Não há atualmente nenhum protocolo padrão para isolamento de células T DN de the tecidos não linfóides. Nosso protocolo descreve um novo método para o isolamento de células T DN do rim; No entanto, o método também pode ser utilizado para vários tecidos não linfóides.

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Protocol

1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura e Reagentes

  1. Instrumentos: Preparar os reagentes em condições estéreis e usar em uma capela de fluxo laminar.
  2. Prepare 1 litro de meio de cultura RPMI tecidos, adicionam-se 5% de soro fetal bovino, 2,1 g de bicarbonato, 10 ml de glutamato de 100 vezes, 10 mg de HEPES, piruvato de sódio 1 mg e 10 ml de 100x de penicilina / estreptomicina.
    Nota: o meio de cultura de tecidos recomendados, RPMI, é intercambiável com DMEM.
  3. Preparar a solução de 5% de colagenase "D" (5 ml de colagenase "D" a 9 ml de meio de cultura de tecido).
  4. Adicione uma solução de Percoll a três concentrações diferentes: 100%, 80% e 40%. As seguintes concentrações são calculados para um amostra. Manter as soluções à temperatura ambiente.
    1. Solução de Percoll: adicionar 9 ml de Percoll (não diluído de solução estoque); adicionar 1 ml de PBS 10x.
    2. Solução de Percoll: adicionar 8 mL de Percoll a 100%; adicionar 2 ml de PBS 1x.
    3. Solução de Percoll:adicionar 4 ml de Percoll a 80%; adicionar 4 mL de PBS 1x.
  5. Adicione 1 L de células activadas por fluorescência tampão (FACS); adicionar 5 ml de 10% BSA (0,1% BSA), azida de sódio a 1 ml a 10% (0,1%), 2 ml agente EDTA, fazer até 1.000 ml com PBS 1x.

2. Preparação de rim Digestão

  1. Tendo adquirido qualquer aprovação institucional necessário, sacrificar e desangrar os ratos com métodos padronizados e seguindo as normas vigentes e orientações de cuidados de animais.
    1. Anestesiar o mouse com pentobarbital (0,07 mg / kg).
    2. Vá para a sangria.
    3. Posicione o mouse em decúbito dorsal sobre uma mesa cirúrgica.
    4. Pulverizar a área abdominal com etanol a 70%.
  2. Adicionar 10 ml de solução de colagenase D para a placa de Petri.
  3. Retire e decapsulate ambos os rins de cada rato.
    1. Abrir a cavidade abdomimal fazendo uma incisão na linha média abdominal através da pele e do peritoneu do esternoo púbis.
    2. Expor o rim esquerdo movendo o intestino lateralmente para o lado.
    3. Cuidadosamente deixou separar a cápsula com a pinça.
      Nota: A cápsula aparece como uma camada transparente em torno do rim e parcialmente coberta por tecido adiposo perirrenal.
    4. Remover o rim esquerdo cortando os vasos do pedículo usando uma tesoura cirúrgica.
    5. Repita o mesmo procedimento para o rim direito.
      Nota: O rim direito é mais cranial e mais perto da linha média (pedicelos são mais curtas).
  4. Coloque o rim para a placa de Petri.
  5. Cortar o tecido renal em pedaços pequenos (1-2 mm de dimensão) usando uma lâmina de moldagem de metal regular e colocar as peças na solução de colagenase durante 30-45 minutos na incubadora a 37 ° C (Figura 1).

3. Preparação de células mononucleares do rim (KMNC) da Digestão rim

  1. Se obter uma suspensão de células do rimdigestão por disrupção mecânica do tecido com um filtro (70 mm) e ressuspender em 25 ml de meio de cultura de tecidos e misturar.
  2. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar a suspensão de células.
  3. Re-suspender o sedimento em 4 ml de solução de Percoll a 40% e suavemente sobrepor em 4 ml de uma solução de Percoll a 80% com uma pipeta de transferência de plástico, muito lentamente e cuidadosamente. Isto irá resultar em duas fases claramente separadas por uma camada translúcida. Na parte superior vai ser uma camada amarela correspondente aos lípidos.
  4. Centrifugar a 1.500 xg durante 30 minutos à temperatura ambiente com a centrífuga no freio modo.
  5. Remover por aspiração a camada superior amarela e espessa (cerca de 1-2 ml).
  6. Recolhe apenas uma ligeira camada translúcida esbranquiçado a partir da interface das duas fases, com uma pipeta de transferência. Transferir muito cuidadosamente esta suspensão em um tubo de 15 ml contendo 2 ml de meio de cultura de tecido e, em seguida, adicionar 13 ml de meio para perfazer um volume total de15 ml.
  7. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C.
  8. Ressuspender as amostras em 1 ml de meio.
  9. Contar o número de KMNC usando exclusão com azul de tripano em um hemocitómetro e exprimir os resultados como o número de KMNC por ml por rim.
  10. Lavar uma vez como acima.

4. Isolamento de hematopoiéticas (CD45 +) Células de KMNC (Passo I)

  1. Ressuspender as células até 10 7 em 90 ul de tampão de corrida.
  2. Adicionar 10 ul de microesferas de CD45 e incubar durante 15 min a 4 ° C.
  3. Adicionar 1 ml de tampão de corrida para parar a reacção. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender em 500 ul de tampão de corrida.
  4. Prepare a coluna magnética, colocando no ímã e enxágüe com 3 ml de tampão de corrida.
  5. Passar a suspensão de células através de uma coluna magnética e recolher as células não marcadas que passam através da coluna.
  6. Lave as células três vezes com 3 ml de runnção tampão. Em seguida, coletar o efluente.
  7. Remova a coluna do separador e pipeta de 5 ml de tampão de corrida para as colunas e expulsar a fração rotulado imediatamente. Esta fracção contém as células CD45 +. Contar as células.
  8. Para calcular o número absoluto de células T diferentes subconjuntos em rins multiplicar o número total de KMNC pela percentagem de células positivas determinada por citometria de fluxo (Figura 2).

5. Isolamento de DN celular T de CD45 + Preparação de selecção negativa (Etapa II)

  1. Adicionar 2,5 mL (0,5 mg / mL, 1,25 ng) de cada um dos seguintes: anticorpos biotinilados anti-CD4, anti-CD8, anti-receptor de Fc (CD16/32), anti-MHC classe II (IA b), anti- CD1d PBS-57 tetrâmero para cada 10 células hematopoiéticas 7.
  2. Incubar as células durante 30 minutos em câmara fria.
  3. Adicionar 1 ml de microesferas anti-biotina.
  4. Incubar durante 30 minutos numa sala fria.
  5. Colocar o tubo no tele ímã e proceder ao esgotamento.
  6. Contagem de células viáveis ​​para determinar o número total de células T DN na fracção negativa, utilizando um hemocitómetro.
  7. Verifique a pureza das células T DN com citometria de fluxo, seguindo esta estratégia de propagação: primeiro portão CD45 +, segundo portão TCRαβ +. Excluir células CD1d +. Lote T CD4 + contra CD8 + para identificar células DN T (Figura 3).
  8. Multiplicar o número total determinado pela percentagem em pureza.
    Nota: O uso deste protocolo resulta em uma população de mais de 90% de células T DN puros.

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Representative Results

Tipo selvagem C57BL / 6 (B6) rim contém aproximadamente 1,5-2,1 x 10 6 células mononucleares por rim. Cerca de menos de 10% são células hematopoiéticas CD45 +. Para a preparação de células mononucleares do rim (KMNC), os rins são cortadas em pedaços pequenos, como mostrado na Figura 1 seguido por digestão usando 5% de colagenase.

Isto é seguido por realização de uma centrifugação de gradiente de densidade para recolher camada KMNC (Figura 2, painel esquerdo). KMNC foram então submetidos a seleção positiva usando CD45 + microesferas magnéticas como descrito na seção 4 (STEP I). As células foram, em seguida, ligado coluna eluída e analisaram para CD45 + por FACS. Isto resulta no enriquecimento de células CD45 + para cerca de 80 a 95%, tal como analisada por citometria de fluxo (Figura 2, painel do meio). Entre as células hematopoiéticas CD45 + enriquecidas, cerca de 40-60% foi αβ TCR + (dados não mostrados), cerca de 30-60% eram células T DN (Figura 2, painel direito).

O último passo de sujeitar as células CD45 + enriquecidas para a selecção negativa para identificar e eliminar células CD4 +, CD8 +, MHC de Classe II + e CD16/32 + células usando mAbs específicos de biotina e microesferas anti-biotina e colunas magnéticas. Isto resulta em elevada pureza (90-95%), as células T DN (Figura 3). Seguindo este protocolo, foi possível obter-se a 0,5 x 10 6 hematopoéticas CD45 + células magneticamente marcadas por ratinho (dois rins).

Figura 1
Figura 1. Preparação do rim para a digestão com solução de colagenase a 5%. Rato O rim é cortado em pequenos pedaços de 1-2 mm e colocados em solução de colagenase D 5%, durante 30 min para escavaçãoestion. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
. Figura 2 Estratégia para o enriquecimento de CD45 + células hematopoiéticas do rim esquerdo:.. Coloração CD45 do rim MNC antes de enriquecimento usando kit CD45 + por seleção positiva Center: coloração CD45 do rim MNC após enriquecimento usando kit CD45 + por seleção positiva Direito.: CD4 e CD8 perfil de células αβTCR + + entre as células CD45 fechados diferentes subconjuntos de células T. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
. Figura 3 Pureza de células T DN isoladas Esquerda:. CD45 coloração de células renais isolado DN T por seleção negativa Center:.. TCRαβ coloração de células renais isolado DN T por seleção negativa direita: coloração CD4 CD8 e entre as células T DN isoladas por seleção negativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Linfócitos no rim, antes de purificação. direita:.. Coloração CD45 no tecido renal antes de purificação Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Há cada vez mais interesse em células T DN, uma vez que estão sendo implicados em diferentes condições patológicas, como doenças auto-imunes, câncer, tolerância enxerto e doenças primárias do rim, incluindo lesão renal aguda (LRA), glomerulonefrite 8, 13. Portanto, há necessidade de melhor compreender e caracterizar as funções fisiopatológicos de células T DN. No entanto, atualmente há uma falta de compreensão da função dessas células, em comparação com CD4 e células T CD8. Uma das principais razões é escassez de células T DN em órgãos linfóides secundários e, portanto, dificuldade na obtenção de células suficientes para a análise in vitro e transferência de experiências adotivos. DN células T localizam-se principalmente nos tecidos não linfóides, tais como o rim 8, mas a falta de métodos eficazes para o seu isolamento a partir de órgãos sólidos prejudica o esforço para investigar a sua função. Portanto, o nosso romance protocolo para o isolamento de células T DNs a partir do rim é esperado para acelerar a investigação sobre a função das células T DN. DN células T acumulam nos gânglios linfáticos em grandes números em Fas deficiente (lpr) ou FasL deficiente (GLD) e murganhos que podem ser facilmente isoladas a partir de órgãos linfóides 9, 14, 15, mas continua a ser um desafio para isolar essas células dos outros tecidos.

De acordo com este protocolo, os rins de dois ratos produzir aproximadamente 0,5 x 10 6 células hematopoiéticas (CD45 +) e cerca de 0,2 x 10 6 células T DN. Este número é suficiente para realizar a cultura in vitro, ensaios funcionais e / ou análise de FACS. A pureza da população de células T DN deve ser confirmada por citometria de fluxo. Este protocolo proporciona uma população de células T DN que podem ser tão pura quanto 98%. Embora este protocolo é concebido para o isolamento de células T DN do rim, pode ser modificado para o isolamento de células T a partir de outros órgãos não linfóides, tais como o coração, tireóide, etc

Uma vez que as células T DN representam uma população pequena, às vezes é necessário para aumentar o rendimento, realizando ciclos adicionais de purificação. No entanto, se um maior número de células T é necessário DN (maior do que 0,5 x 10 6 células) é recomendável realizar a triagem de separação, a fim de reduzir o tempo e custo do reagente.

Em resumo, este protocolo descreve um novo método para o isolamento de células T DN do rim. É composto de uma preparação (através de digestão e de enriquecimento de KMNC) passo seguido por selecção positiva e selecção negativa em seguida, para depleção da população de células não-desejadas. Portanto, não há manipulação directa mínima de células DN T durante o processo de isolamento. É digno de nota que existem protocolos existentes para o isolamento de células DN T do sangue periférico em ratos e seres humanos e a partir de órgãos linfóides secundários, semelhantes aos utilizados para o isolamento de células T convencionais.

ove_content "> Como foi mostrado que algumas células T expressam DN FcR-γ, uma opção alternativa é a de não incluir CD16/32 + no cocktail 16, 17. isolamento bem sucedido de células T DN exige grande atenção aos detalhes. particularmente crucial etapas incluem: digestão do tecido, o corte do tecido renal em pequenos pedaços, e corretamente identificar e recolher a camada de luz no gradiente de densidade geral, várias rodadas de prática e alguma destreza manual são necessárias para atingir o resultado desejado..

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho é apoiado pelo NIH PBS (R21 AI095484). Agradecemos NHI tetramer instalação do núcleo para CD1d tetrâmero.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminar flow hood  Baker Company, Inc Or equivalent equipment 
Centrifuge Beckman Coulter Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Atmosphere-controlled incubator Fisher Scientific  (37 °C with 5% CO2)
Analytical flow cytometer LSR II
RPMI 1640 Media Tech 10-040-CV
Collagenase D Roche 11088858001
Percoll  GE Healthcare 17-0891-01
Fetal bovine serum  Corning Cellgro 35-011-CV
0.1% sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich S2002
Buffer phosphate buffered saline (PBS) Corning Cellgro 21-040-CV
PBS 10x Mediatech 46-013-CM
EDTA buffer  Sigma-Aldrich E1161
LS columns  MiltenyiBiotec 130-042-401
CD45+ microbeads MiltenyiBiotec 6.78E-51
Biotin microbeads  MiltenyiBiotec 130-090-485
anti-CD45 (clone: 30-F11)  PerCP  eBioscience G1397
anti-CD45 (clone: 30-F11)  APC-Cy7 Biolegend 103116
anti-TCR Pacific Blue  (ab-chain, clone: H57-597) Invitrogen HM3628
anti-CD4 PE eBioscience 12-0043
anti-CD8 FITC eBioscience 8011-0087
anti-CD4 biotinylated (GK1.5) BD 553728
anti-CD8 biotinylated  (clone 53-6.7) BD 553029
anti-MHC class II (I-A b) biotinylated BD 553609
AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer  MIlteny I Biotec 130-091-221
C57BL/6J mice Jackson Labs 000664 Kidneys - Lymph Nodes
Petri dish  BD Biosciences 356517
70 μm filter  Fisher Scientific 22363548
Plunger  Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 50 ml Bioexpress C-3394-3 Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 15 ml Bioexpress C-3394-1 Or equivalent equipment 
CD1d α-galcer tetramer NHI

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References

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Imunologia Edição 87 Double Negative (DN) αβ as células T isolamento CD45 + células T linfócitos renais não-linfóides-tecidos células T purificação de isquemia e reperfusão lesão lesão renal aguda Tissue Residente Linfócitos Transtornos Linfoproliferativos lúpus eritematoso

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 02/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

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Samantha Bandapelle

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Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney. J. Vis. Exp. (87), e51192, doi:10.3791/51192 (2014).

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