Abstract
İnsan genomunun büyük bir kısmı kopyalanmış fakat tercüme değildir. Bu Mesaja genomik çağda, RNA düzenleyici işlevleri giderek daha önemli olduğu gösterilmiştir. RNA işlevi çoğu zaman alternatif yapılarını benimsemek yeteneğine bağlıdır olarak, sırayla doğrudan RNA üç boyutlu yapılarını tahmin etmek zordur. Tek molekül bir seferde moleküler yapılarla bir molekül izleyerek RNA yapısal polimorfizmi sorunu çözmek için gösteri potansiyelleri yaklaşır. Bu çalışma, tam optik cımbız kullanarak tek RNA moleküllerinin, katlanma ve yapının manipüle etmek için bir yöntem sunmaktadır. İlk olarak, yöntemler tek moleküllü mekanik iş için uygun moleküller tanımlanmıştır sentezlenmesi için. Optik cımbız düzgün işlemleri sağlamak yanında, çeşitli kalibrasyon prosedürleri tartışılmıştır. Daha sonra, çeşitli deneyler açıklanmıştır. Tekniğin yararlılığını göstermek için, mekanik olarak saç tokası RNA açılımı sonuçlarını ve bir tek RNA öpmeyeceğing karmaşık delil olarak kullanılır. Bu örneklerde, bağımsız bir şekilde nanomanipulation tekniği, ikinci ve üçüncü dahil olmak üzere her yapısal etki katlanmasını incelemek için kullanılmıştır. Son olarak, sınırlamalar ve yöntemin gelecekteki uygulamalar tartışılmaktadır.
Introduction
Optik cımbız tekniğinin gelişmesi uzun biyolojik araştırma uygulaması ile eşlik etti. Optik yakalama etkisi ilk keşfedildiği zaman, Arthur Aşkın kirli suda bakteri lazer odak 1 sıkışan olamayacağı görülmektedir. O zamandan beri, bakteri biyofizik öğrenci nesiller için bir kasıtsız, eğlenceli deney yanı sıra mikrobiyal fizyoloji 2,3 incelemek için ciddi bir araştırma aracı haline gelmiştir hapsi. Optik yakalama tekniği mikroskobik 1 nesne hareketsiz hale getirmek için odaklanmış bir lazer ışını kullanır. Pratik olarak, aynı zamanda, tutucu (koyup Dx) merkezinden yer değiştirmesi tarafından tuzağa nesne üzerinde bir kuvvet (F) ölçen bir optik yayı gibi bir lazer tuzak çalışır. Κ kısa bir aralıkta, F = κ x Dx, içindeki tuzak yay sabittir. Optik tuzak MICROS için picoNewton (PN), kesinlik kuvvet uygulamak için kullanılabilirCopic nesne ve nanometre (nm) doğrulukla konumunu ölçmek. Son yirmi yılda, optik cımbız biyofizik en çok kullanılan tek-molekül tekniklerinden biri haline gelmiştir. Tekniği katlama ve DNA 4-6, RNA 7-9 ve proteinlerin 10,11 mekaniğini incelemek için istihdam edilmiştir. Optik cımbız da DNA replikasyonunu 12 RNA transkripsiyonu 13, 14,15 ve protein sentezi, hem de diğer birçok biyomoleküler bir etkinlik 16-18 gözlemlemek için kullanılmıştır.
Tek molekül yaklaşımlar esas RNA engebeli katlama enerji manzara keşfetmek için RNA yapısal araştırma istihdam edilmektedir. Bir RNA dizisi nedeniyle genellikle RNA basit kimyasal bileşimi ve baz soyma kurallarına, birden fazla istikrarlı, birbirini dışlayan yapılar içine kat edebilirsiniz. Uzun RNA yapısal polimorfizm, bu riboswitches 19,20 meydana gelir, örneğin, gen regülasyonunda önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Bir recent genom anket birkaç derece büyük ölçüde hücresel transcriptome 21 büyük bir kısmının yapısı ve protein sentezini etkileyen kadar küçük ki sıcaklık değişimlerini ortaya koymuştur. Bu örnek, daha önce tahmin edilenden daha alternatif RNA katlama biyolojik rolü belki de daha önemli ve yaygın olduğunu ipuçları. Yapısal polimorfizm, ancak birçok moleküllerinin ortalama özelliklerini incelemek geleneksel biyokimyasal ve biyofiziksel yaklaşımlar için bir sorun teşkil etmektedir. Örneğin, "üzerinde" bir riboswitch bir "kapalı" konformasyonlar bağdaşmıyor. Heterojen bir yapı elde edilen bir ortalama yapısı biyolojik ilgili şekillerin ya da benzer olası değildir. Ayrıca, çevrilmemiş RNA ve mRNA genellikle yapılar oluştururlar. Proteinler ve düzenleyici RNA'lar ile etkileşimi yaygın etkileşimin bir parçası olarak mevcut yapının açığa çıkmasını gerektirir. Bu nedenle, RNA açılma / yeniden katlanmasını okuyan bir ilgili olurRNA biyoloji sorunu. Böyle bir sorun karşılamak için, tek-molekül yaklaşımı bir anda 22-27 az bir molekül okuyan RNA yapısal polimorfizmini çözülmeye istihdam edilmiştir.
Popüler tek molekül fluoresans yöntemiyle karşılaştırıldığında, açılma mekanik göre cımbız tek tek moleküller konformasyonları uygulanan kuvveti ile manipüle edilebilir ve nanometre hassasiyetle ölçülebilir bir avantaj sağlar. Bu özellik, büyük nanomanipulation RNA hiyerarşik katlama 28 kesilmiş olabilir, bireysel yapısal alanın açılma / katlanır izlemek için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, bir tek elyaf birçok konformerlerin birine katlanmasına yönelik olabilir; veya mevcut yapıya mekanik olarak farklı bir konformasyona 29 içine yeniden kapatmak için indüklenebilir. Biyolojik şartlar altında, bir RNA yapısı sıcaklık değişimi veya ligand bağlanması üzerine değiştirilebilir. Doğrudan manipüle moleküler s yeteneğikırılmalardan RNA yapısal çalışmanın yeni bir mekan açılıyor. Prensip olarak, böyle bir atomik kuvvet mikroskopu ve manyetik cımbızlar gibi diğer mekanik teknikler de, tek RNA moleküllerinin katlanmasını incelemek için kullanılabilir. Ancak bu gibi uygulamalar, nispeten düşük uzaysal çözünürlüğü 30 büyük ölçüde sınırlıdır.
Optik cımbız iş RNA yapılarının mekanik güç ile katlanmamış sağlar.
Açılımı mekanik avantajı birkaç yönlüdür. Metal iyonları ve ligand uyarılmış katlama ağırlıklı üçüncül yapıları ile sınırlıdır, oysa Kuvvet, ikincil ve üçüncül yapıların her ikisinin de açılmak için kullanılabilir. Sıcaklık ve denatüran önemli ölçüde su ve çözünenlerin faaliyetlerini etkileyebilir. Buna karşılık, kuvvet moleküler yapılarını perturb lokal olarak uygulanır; çevresini üzerine uygulanan kuvvet etkisi ihmal edilebilir düzeydedir. Buna ek olarak, termal erime en küçük RNA yapılarını katlama termodinamik çalışma için kullanılır,optik cımbız yedi temel-çift tetraloop firkete 28 ikinci bir 400-nükleotid ribozim 31 kadar farklı boyutlarda RNA yapılarının incelenmesi için kullanılmıştır gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, RNA yapıları mekanik mezofilik sıcaklıklarda açılabilirler. Buna karşılık, bir termal erime deneyde RNA açılmak için, sıcaklık tipik olarak daha da önemli olarak, özellikle Mg +2 iyonlarının mevcudiyetinde, RNA, hidroliz artar fizyolojik sıcaklıklarda, üzerinde yükseltilir.
Bu kuvvet, bir mekanik etki yapısına tatbik edilir nasıl bağlı olduğunu not etmek önemlidir. Uygulanan kuvvet katlanan enerji manzara tenteli. Örneğin, saç tokası, bir kuvvet uygulandığında, baz çiftleri, sırasıyla, bir zaman (Şekil 1a) bir tane kırılır. Kopyalama çatal uygulanan kuvvete dik helezon ekseni boyunca ilerler. En az bir öpüşme karmaşık bir gerilim altında Bunun tersine, iki öpüşmeUygulanan kuvvet paralel olan baz çifti, bir güç yük paylaşımı (Şekil 1b). İkincil ve üçüncül katlama 28,32 ayırt etmek için kullanılabilir bunların farklı mekanik karşılık olarak uygulanan kuvvet sonucu firketenin ve öpüşme karmaşık ilişkide tutulur, dolayısıyla farklı geometriler. Açılımı mekanik teorik yönü önceden 8,9,30 gözden geçirilmiştir. Bu çalışma kurmak ve bir tek molekül mekanik açılımı analizini gerçekleştirmek için temel yaklaşımları özetliyor.
Deneysel Kurulumu. Bizim mekanik çekme deneyinde, tweezing için RNA numunesi iki çift bükümlü DNA / RNA kolları tarafından sınırlanan, ilgi konusu RNA (Şekil 2) oluşur 7. Tüm molekül sırasıyla streptavidin- biotin ve digoksijenin anti-digoksijenin antikor etkileşimleri, üzerinden iki yüzey kaplı mikron boyutunda boncuk (Spherotech) gergin olabilir. Bir boncuk bir kuvvet ölçme optik tr tarafından düzenlenenAP, diğer ise, bir mikropipet ucunda tutulur. Halkalar arasında göreceli mesafe tutucu direksiyon veya mikropipet ile hareket ya da değiştirilebilir. Bu yaklaşımı kullanarak, tek bir alana sıkıştırılmış boncuklar RNA molekülü gerilip serbest edilebilir.
Numune hazırlanması. Tweezing için RNA örneklerinin sentezi birkaç adımları içerir (Şekil 3) içerir. İlk olarak ilgili RNA'ya karşılık gelen DNA sekansı ilk olarak plazmid vektörüne klonlanır. Daha sonra, üç PCR reaksiyonu, iki kolları ve transkripsiyon için bir şablon üretmek için kullanılmaktadır. Transkripsiyon şablon sap bölümleri ve eklenen dizileri de kapsamına almaktadır. Tam uzunlukta RNA, in vitro transkripsiyon kullanılarak sentezlenir. Son olarak, RNA ve kimyasal olarak modifiye edilmiş kolları tweezing için molekülleri oluşturmak için bir araya tavlanır.
Kalibrasyon ve Cımbızlar Operasyonu. Minitweezers kullanımının temel tasarımBu çalışmada d ki çift-ışın optik cımbız 33 izler. İlk nesil optik cımbız ile karşılaştırıldığında pek iyileştirmelerle, Minitweezers olağanüstü dengeye sahiptirler. Birkaç ülkede araştırma grubu bir tek-molekül araştırmalarına 14,15,34-37 olarak Minitweezers kullanın. Talimat videolar dahil olmak üzere cihazın, inşaat, kalibrasyon ve operasyon bilgilerini, "Cımbız Lab" sitesinde (http://tweezerslab.unipr.it) mevcuttur. Burada, günlük bazda yapılması gereken iyileştirmeler ve kalibrasyon işlemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tek moleküllü tweezing için RNA moleküllerinin hazırlanması 1.
- Ilgi duyulan dizilimi klonlanması. Bir vektör, RNA yapıya tekabül eden DNA dizisini Clone.
- Sentez ve transkripsiyon şablon saflaştırılması. PCR ile bir transkripsiyon şablonu sentezlemek. [Burada yer Tablo 1] Şimdi, bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünlerinin saflaştırılması ve> 200 ng / ul örnek konsantre edilir. Saflaştırılmış DNA, transkripsiyonu için kullanıldığı için, RNazsız su yıkama ve konsantrasyon adımları kullanılmalıdır.
- In vitro transkripsiyonu ile. RNA, verimi maksimize etmek için gece boyunca 37 ° C'de in vitro transkripsiyon RNA sentez. Transkripsiyondan sonra [burada yer tablo 2], I, 37 ° C'de 15 dakika boyunca DNA şablonu sindirimi 1 ul DNase ekleyin. Bir silis kolonu kullanılarak eğirme RNA'yı saflaştırmak.
- Biyotinile edilmiş kol sentezi A. Üretim, astar Af ve Ar ve konsantre kullanılarak PCR ile modifiye edilmemiş kol imaliAmplifiye DNA> 200 ng / | il için entrate. Daha sonra, bir primer uzatma reaksiyonu kullanılarak PCR ürünü içine biyotin modifikasyonlar. [Yer tablo burada 3] Not: biyotinile edilmiş bir kolu (biyotin-HA) saflaştırılmadan doğrudan tavlama kullanılabilir. Biyotin-HA RNA ile tavlanmış edilmesi olduğu için, her iki adımda RNazsız su kullanımı için çok önemlidir.
- Digoksigenin modifiye sapın B. Sentez Sentez astar Bf ve digoksigenin-modifiye oligo Dig-Br (Şekil 3) kullanılarak PCR ile kolu B (kazı-HB) modifiye Digoxigenin. Daha sonra, PCR ürünü saflaştırmak ve> 200 ng / ul örnek konsantre edilir.
- Kolları için tavlama RNA. Kulplu RNA tavlamak. [Burada yer Tablo 4 ve 5]
- Tavlı örnek arındırın. Tavlanmış numunenin 3 hacim etanol ekleyin ve iyice karıştırın. En az 1 saat boyunca -70 ° C'de saklayın karışımı. 15,800 xg'de Spin ve süpernatant atın. Bir toz haline kullanılarak topak ile kurutun. Pelet çözülür100 ul RNazsız su. Not: Örnek kullanılmaya hazırdır ve -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
Optik Cımbızlar 2. Kalibrasyon ve Operasyon
- Video Monitörü Piksel Boyutu kalibre
- Tuzak bilinen çapı (boyut standart) ile bir boncuk optik tuzak kullanın.
- Görüntüleme yazılımı kullanarak bir tuzak boncuk Yakalama görüntüleri (Şekil 4).
- Ağırlık merkezi yöntemine göre görüntüleme yazılımı kullanılarak kordonun çapı belirlenir.
- Farklı boyutta boncukların çapları belirlemek için bu işlemi tekrarlayın.
- Bir pikselin fiziksel boyutunu elde etmek üzere doğrusal regresyon ile boncukların ölçülür ve bilinen çapları takın.
- Mesafe Kalibrasyon doğrulayın
- Tuzak bir boncuk optik tuzak kullanın.
- Görüntü yakalama yazılımı tarafından sentroid piksel konumunu belirlemek ve Minitweezers kullanarak konumunu kaydedin.
- Diffe için boncuk Steer pozisyonları kira ve pozisyon tayinini tekrarlayın.
- Kalibre piksel boyutunu kullanarak m birimine piksel boncuk, X ve Y konumlarını dönüştürün.
- Video ile ve Minitweezers tarafından ölçülen pozisyonları arasındaki X ve Y karşılaştırın. Değerleri iki grup anlaşmalıdır. Görüntü çözünürlüğü> 0.1 mikron olduğu, doğruluğunu sağlamak için ölçümler arasındaki 1 mikron üzerinde boncuk hareket. Mesafe kalibrasyon Minitweezers saklanan bir karşılaştırılabilir değilse, aleti kalibre edin.
- Tuzak Sertlik Kalibrasyon
- Optik tuzak kullanarak boncuk yakalamak ve hala tutun.
- 3 sn için bir oran> 5 kHz bir baypas hızlı veri toplama kullanarak tuzak kuvveti kaydedin.
- Yazılımını kullanarak boncuk hareket kaydından bir güç spektrumu oluşturmak. Lorentz (Şekil 5) 38 güç spektrumu Fit:
542 / 51542eq1.jpg "width =" 200 "/> (Denk. 1)
burada S (f) f frekans gücü, f c köşe sıklığı, ve S 0 asimptotik güçtür. Köşe frekansı, c, f termal hareketinin güç asimptotik değerinin yarısına düşmüştür sıklığıdır. F c lazer güç ve boncuk boyutuna göre değişir gibi, tek tek her bir tuzak boncuk kalibre. - F c tuzak yay sabitini, κ, hesaplayın:
(Denk. 2)
burada γ boncuk (Denk. 3) arasında sürtünme katsayısıdır. Kuvvet değişimi bir RNA uzantısı değişikliklerini saptamak için yay sabitini kullanın.
- Stokes Kanunu Testi
- Optik tuzak kullanarak bir boncuk yakalayın. -Geri kuvvet boncuğu taşı farklı hızlarda.
- Boncuk hareketlerini kaydetmek ve Minitweezers kullanarak zorlamak.
- Boncuk yarıçapını hesaplayın.
Not: sürtünme kuvveti, F d, bir akışkan içinde bir parçacığın küresel hareketi tarafından üretilen Stokes hakları ile tarif edilebilir:
(Denk. 3)
burada r kürenin çapı, v hız ve h referans tabloları bulunabilir, akışkan dinamik viskozitesidir. F d olarak ölçülen kuvvet kullanarak, kordonun uzunluğu Denklem kullanılarak hesaplanabilir. 3 (Şekil 6) ve görüntü alma yazılımı tarafından belirlenen bu kabul edilmelidir. Stokes yasası testi etkili bir genel kalibrasyon ve aracın performansını test eder.
(Denk. 2) 
(Denk. 3) Tek bir RNA molekülünün 3. Nanomanipulation
- Fluidics yapma.
- No 2 kapak camı ile altı delik (2 mm çapında her biri) ile (Şekil 7) ve matkap (7b Şekil) bir lazer gravür kullanarak, çift taraflı bant poliimid üç tane yarık (2 mm kalınlığında) kesilir.
- Çift taraflı bant Kapton iki kat cam tabaka iki sandviç tarzı bir akış bölme yapın. Bant (Şekil 7c) arasında bir mikropipet ve iki baypas tüpleri yerleştirin.
- Akışkan delikleri (Şekil 7d) eşleştirerek bir metal çerçeve üzerine akış odasına monte edin.
- Polietilen boru donanımları (Şekil 7e) ile seçilen tampon ile doldurulmuş 10 ml 'lik şırıngaya bölmenin akışkan kanalları bağlayın.
- İki amaçları arasındaki optik cımbız üzerine tüm odasını monte edin. Akışkan kanalları bölmenin ön sağa baktığından emin olun. Objektif çekin ve t montaj delikleri çerçeve (Şekil 7e) içinde pirinç işaretçilerine fişidiye cımbız. Odacık konumunu düzeltmek için vidaları sıkın.
- Tavlanmış örnek ve boncuk Karıştırma. , Anti-digoksijenin kaplı boncuklar (DIG-boncuklar) ile tavlanmış örnek karıştırın ve karışım 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında kalmak sağlar. Tipik olarak, tavlanmış numunesinin 1 ul, 1 ml tampon içinde 5 ul Kazı-boncuklar ile karıştırılır. Not: boncukların miktarı, akış bölme içine yüklenecek boncukların makul bir miktar baypas boru teslim edilecek sağlamak için seçilmelidir. Tanelere tavlanmış numune oranı kolaylıkla tahmin edilemeyen. İdeal durumda, çoğu boncuk boncuk, sadece küçük bir bölümü boncuk başına sadece bir RNA molekülü olabilir öyle ki herhangi bir RNA sahiptir. Tavlanmış örnekler ve boncuk süspansiyonu ölçmek zor olduğu için, tek yolu, şu anda ve karışım oranını değiştirmek ve cımbız üzerindeki karışımın test etmektir.
- Mil üstüne, yani, (nolu akış odacığı içinde bir reaksiyon sitesi için birkaç mikrometreden boncuk sununcropipette ucu, Şekil 7C).
- 1 ml'lik bir şırınga içine streptavidin kaplı boncuklar (strep boncuklar) bir süspansiyonu yerleştirin.
- Akış odası (Şekil 7a) alt kanalına giden akışkan borusuna enjektörü.
- Odasına strep boncuk akmasına şırınga itin.
- Alt baypas borusunun (Şekil 7b) bir açıklığın yakınında optik tuzağı motor kontrol yazılımı kullanılarak bütün bölmesini hareket ettirin. Sonra bir strep boncuk yakalamak için bir topunu ile optik tuzak çalışır.
- Motor kontrol yazılımı kullanılarak mikropipet ucuna yakın boncuk hareket ettirin.
- Mikropipet üzerine boncuk emmek için mikropipet bağlı şırıngayı çekin.
- Ekstra strep boncuk dışarı atılması için orta kanala şırınga basarak hafifçe akışını uygulayın.
- Benzer şekilde, numunenin karışımını odanın üst kanala kazı-boncuk (adım 3.2) sağlar.
- Bir kazı-boncuk yakalamak ve optik tuzak kullanarak strep boncuğa o yakın getirmek.
- Akışı uygulanmak suretiyle, orta kanal temizleyin. Not: strep- ve mikroskopik altında görsel olarak ayırt edilebilir, böylece boncuklar dig farklı boyutlarda olacak şekilde seçilir (Şekil 4).
- Balıkçılık "bir çift boncuk ile cepheye tek molekülü.
- Strep boncuk (Şekil 4) üzerine dikey olarak DIG-boncuk yerleştirin.
- Tuzak direksiyon aşağı strep boncuk doğru kazı-boncuk taşıyın. Kuvvet değişiklikleri görselleştirmek için bilgisayarda bir kuvvet-mesafe arsa penceresini açın.
- Iki boncuk temas üzerine, dikey olarak uzak strep topuk kazı-boncuk hareket eder.
- Belirli bir temas olursa, kuvvet, neredeyse sıfır kalır. İki molekül boncuklar ile bağlı, kuvvet önemli ölçüde artırır iki boncuk ayrıldığında. Genel olarak "balık" olarak anılacaktır Bu işlem, çoğu zaman perfboncuk her çift ormed birden çok kez etkili bir tek-molekül urgan bulmak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Boşluk ile sınırlıdır, tek RNA moleküllerinin nanomanipulation mekanik olarak saç tokası RNA açılımı örnekleri ve üç boyutlu yapıya sahip bir RNA göstererek gösterilmiştir.
Tek Firkete Moleküller işleyin
Bir ip boncuk arasına kurulduğunda, halata bağlı uzantısı ve kuvvet bir kullanıcı tanımlı protokolü kullanılarak manipüle edilebilir. Dört ortak manipülasyon protokolleri yaygın olarak kullanılmaktadır.
Kuvvet-rampa Deney. Tek bir RNA işlemek için en kolay ve bilinen deney (dikey olarak Şekil 4'te gösterildiği gibi) arka arkaya germek ve kolları sarmal eksen yönünde molekülü gevşemektir. Kuvvet, F ve tuzak pozisyon, Y, zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedilir. Tra yay sabiti olduğu F / κ - molekülü e uzantısı, E = Y tarafından hesaplanabilirs. Sonuç çekme kuvvet-uzama eğrisi (Şekil 8a) olarak gösterilebilir. Çift şeritli kolları uzanan pozitif eğimli yükselen bir eğri ile gösterilir. Kolları gevşeme eğrisi o germe izini. Basit, iki-devlet-katlama firkete yapısal geçiş, tek bir kooperatif açılım geçiş 39 gösteren negatif eğimli bir "rip" görüntüler. Firketenin Yeniden katlama kuvvet-uzama eğrisinde bir "fermuar" ile gösterilir. Önemli olarak, aynı molekülün katlanmış ve farklı kuvvetlerin her zaman tekrar katlanmış olabilir. Böyle bir eğilim geçiş kuvvetleri (Şekil 8b) dağılımları belirgindir. Genel olarak, sabit bir kuvvet yükleme / boşaltma hızında, yani lineer bir zaman fonksiyonu olarak değişir. Sabit bir yükleme / boşaltma hızı altında, kuvvet bağımlı kinetik geçiş güçlerinin 40-42 dağılımları elde edilebilir.
Sabit Kuvvet Deney. Sabit kuvvet modu altında, enstrüman bir set değerinden kuvvet sapmaları telafi etmek için bir geri besleme mekanizması kullanır. Bir RNA molekülünün tanımlanmasına uzantısı molekül yayılma durumlarının gözlenmesi ve ölçülmesini sağlar RNA molekülü özel bir geçiş geçiş kuvveti ya da yakınında kuvveti ayarlanması. Zaman (Şekil 9) bir fonksiyonu olarak kaydedilir. Her durumda molekülün ömürleri yapısal geçiş 7 kinetiklerini hesaplamak için bir araya toplanmış olabilir. Sabit kuvvet deney gibi saç tokası 7,28 olanlar gibi geri dönüşümlü katlama, izlemek için kullanılır.
Kuvvet Jump Deneyi. Bir kuvvet atlama deneyde, kuvvet hızla farklı bir değere değişti ve sabit tutulur; ilk geçiş süresi 43 izlenir. Kuvvet atlama kinetiklerini karakterize etmek için özellikle yararlıdırtersinmez süreçler, İleriye ömürleri ve ters reaksiyonlar doğrudan farklı güçlerin ayrı ayrı ölçülebilir çünkü. Her kuvvet atlama / damla, sadece bir ömür boyu görülmektedir. Bu nedenle, bu deney, çok sayıda mermi kinetiğini çıkarmak için yeterli gözlemler toplamak için yapılması gerekir.
Pasif Deneyler. Pasif modu altında, tuzak ve mikropipet pozisyonları ikisi (Şekil 10) sabittir. Bir firkete kendi geçiş kuvvetlerinin yakın katlanmamış ve katlanmış RNA'ya karşılık iki durumu sergiler. Sabit kuvvet Deney, kuvvet ve yapısal geçişte molekül değişikliği farklı bir uzantısı. Moleküler geçişler feedback kontrolü sağlar ortadan kaldırarak doğrudan dış müdahale olmaksızın izlenecek. Bununla birlikte, pasif mod ortaya altında sabit bir kuvvet sağlamak zordur. Optik tuzak tuzağa boncuk diffüz, kuvvet ona göre değişir. ThE pasif modu önemli ölçüde değiştirildiği zorlamak sırasında uzun bekleme süresi ile moleküler durumlarını ölçmek için uygun değildir. Sabit kuvvet ve pasif modları artılarını ve eksilerini kapsamlı okudu ve 44 tartışılmıştır.
İkincil ve Üçüncül Yapıların unravel Katlanır
Makine iki bağlantılı GACG tetraloop saç tokası ile oluşturulan, iki baz çifti öpüşme RNA gelişmemiş bir Burada örnek (Şekil 11) olarak kullanılır. Kök dizileri farklı olsa ikisi de bir 9-baz-çifti kök saç tokaları. RNA (Şekil 11) mekanik kuvvet yolu açılma yöntemleri rampa 34 ile karakterize edilmiştir. Kuvvet çağrılınca, öpüşme kompleksi ilk saç tokaları açılması sıralı ardından bozuldu. Yeniden katlama üzerine, toka düşük kuvvet bir öpüşme etkileşim ardından ilk katlayın. Bu geçişler kuvvet-uzama eğrisi üzerinde görülebilir (Şekil11b). Saç tokası geçişler atama doğrulamak için, saç tokası her biri tek tek ele alınabilir. Unkissing / öpüşme geçişlerin atama tetraloops öpüşme etkileşim 28 oluşumunu önlemek için mutasyona uğratıldığı bir mutant RNA, incelenmesiyle doğrulanabilir. Seçenek olarak ise, en düşük güç öpüşme kuvvetlerinden daha yüksektir 10 pN, ayarlanabilir. Beklendiği gibi, bu koşullar altında, kuvvet-uzatma eğrisi saç tokası (Şekil 11 c), 34 sadece açılması / tekrar katlanmasını gösterir. Bu nedenle, farklı kuvvetler bağımsız iki saç tokası bir öpüşme etkileşim ve her katlama araştırılması mümkün olmaktadır.
Bu iki saç tokası katlama öpüşme etkileşim çok farklı unkissing ve öpüşme güçler tarafından gibi belirgin, son derece geri döndürülemez iken, geri dönüşümlü, ve büyük histerezis ile dikkati çekiyor. Bu nedenle, saç tokası katlanabilen kinetiği incelenebilir directly sabit kuvvet deneyleri kullanılmıştır. Öpüşme etkileşimin kinetik Ancak kuvvet atlama yöntemi kullanılarak ölçülmelidir. Şekil 12a, tipik bir kuvvet atlama deneyi 28 gösterir. 3. PN, tam RNA katlanır. Bu güç daha sonra hızlı bir şekilde 22 ° C'ye yükseltilmiştir ve pN sabit tutulur. Birkaç saniye sonra, bütün RNA, 30 nm ~ uzatılması ani bir artış ile belirgin olarak, tek bir büküm halinde katlanmış bir vaziyettedir. Bu 13 pN düşürülürken önce kuvveti, bundan başka, RNA'yı germek için 30 pN yükseltilir. Saç tokaları katlanması sonra, kuvvet hızla 8 pN bırakılır. Öpüşme kompleks oluşumu ~ 7-8 nm uzatma kısaltılması ile gösterilir. Bu kullanım süresi çok ölçüm toplama unkissing sabit kuvvetlerine kinetiklerini öpüşme tarafından hesaplanabilir.
Tüm deney koşulları altında, öpüşme kompleks her zaman önce katlanmış bir vaziyettedir. Tokalar kendileri tarafından kararsız güçlerine, öpüşme etkileşimiyon çözülmesini saç tokası yapıları korur. Böyle bir hız sınırlayıcı etkisi de kuvvet atlama deneylerle ortaya çıkar. Kuvvet 16 PN atlandığı Şekil 12b 28, gösterildiği gibi, molekülün geri uzantı 20 nm ile ~, açılabilir bir artan bir uzatma uygulandı, bir kaç saniye için büyük ölçüde değişmeden kalır. Uzantısı değişiklikler zayıf yedi-baz çifti saç tokası öpüşme kompleksinin bozacak hemen sonra gelişeceğini edilir belirtti. Firketenin metastabilite ömürleri ile belirgindir. Öpüşme kırık sonra, saç tokası hızla katlanmış ve katlanmamış devletler arasında transit; yaşam süreleri 1 saniye daha az. Esasen, bu gözlem saç tokası açılması için sabit bir kuvvet deneydir. Buna karşılık, firkete ile birlikte öpüşme kompleksi açmak için 10 saniye boyunca sürer. Benzer şekilde, güç tüm RNA, in tarafından açık olarak, tek bir büküm halinde katlanmamış edildiği 17.7 pN (Şekil 12c) 'e atlandığı~ 30 nm uzantısında kırışık. Uzatma iki değer arasındaki atlama gibi büyük, 11-baz-çifti firketenin İki sabit durum görülebilir. Yine, firkete kısa ömürleri metastable devlet uzun ömrü keskin bir karşıtlık vardır. / Katlanır adımları açılımı kuvvet rampa ve kuvvet atlama deneyler, termodinamik ve bireysel kinetik bir kombinasyonu kullanılarak 28 ölçülebilir. Öpüşme kompleksinin kırılması ve oluşumu doğrudan gözlemler az öpüşme kompleksi 34 üslerini komşu enerjik katkılarını analiz etmek ve öpüşme etkileşim 45 tuz bağımlılığını ölçmek için bize sağlar.
Uygulanan kuvvete göre Şekil 1. RNA yapıları. gerilme altında) bir saç tokası. b), iki baz-Çekmeçifti kompleksi öpüşme. İki saç tokası döngüler kırmızı ve sarı renklidir.
Şekil 2. Deneysel kurulum. RNA yapısı iki DNA / RNA kolları ile çevrili. Kolları uçlarındaki kimyasal modifikasyonlar sayesinde, tüm molekül proteini kaplı mikron büyüklüğünde bir çift boncuk ile bağlanabilir. Küreciklerin bir döndürülebilir bir kuvvet ölçme optik tuzak tarafından düzenlenmektedir. Diğer bir piezoelektrik flexture aşaması tarafından tahrik edilen bir mikropipet, yerleştirilir. Çizim ölçekli değildir.
Şekil 3. kulplu RNA molekülleri sentezlemek için genel bir plan. Kolu A, B kolu ve transcription şablon klonlanmış RNA dizisine sahip bir plasmid PCR ile üretilmiştir. Sap bir 3 'uçlarında digoxigenins (DIG) ile modifiye edilir. Sap B, bir telin 5 'ucunda bir biyotin modifikasyona sahiptir. Tam uzunluktaki RNA transkripsiyon şablonundan transkribe olmaktadır. RNA ve modifiye kolları karışık ve tavlanır. Uygun moleküller streptavidin ve anti-digoksijenin antikoru ile kaplanmış bir çift boncuk ile gergin olabilir. Çizim ölçekli değildir.
Video tarafından yakalanan iki boncuk arasında bir tek molekülü balıkçılık 4. Görüntüleri Şekil kart. Biri boncuk emilerek bir mikropipet ucu yerleştirilir. Diğer bekletilen ve bir kuvvet ölçme optik tuzak tarafından yönlendirilir. Tuzak hareketlerin yönleri oklarla gösterilmiştir. Tuzağa boncuk ilk hamledikey mikropipet boncuk doğru. Kişiler üzerine, tuzağa boncuk yukarı taşır. Bir ip halkalar arasında kurulması durumunda, molekül genişletilmiş olarak, boncuk ayırma molekülü ve kuvvet artar çeker. İki taneleri, herhangi bir molekülü ile bağlantılı değildir ise, geri çekme hareketi bir kuvvet üretir.
Şekil 5. Bir tuzağa boncuk Brown hareketi bir güç spektrumu. Katı eğrisi insert gösterilen Lorentz denklemi (Eşitlik. 1), bir seçimdir. Tuzak yay sabiti köşe frekansı (Denk. 2) hesaplanabilir.
Şekil 6. Stokes yasa test örneği.
Şekil 7. tweezing için bir akış odası. a) Altı adet delik, 2 mm'lik bir çapa sahip, her biri üç 2 mm genişliğinde çift taraflı yarıklar poliimid bantlar halinde kesilir. b) lazer gravür ile bir No. 2 kapak camı içine delinir. c) yakın bir bakış Mikropipet ve iki baypas tüp içeren deneysel bölgede. Üst ve alt kanalları Boncuklar cen için ilgili baypas boruların (mavi ve yeşil) aracılığıyla çaprazoklarla gösterilen doğrultularda tral kanal d.) akışkan bir delik ile eşleştirerek metal bir çerçeve üzerine monte akışkan odasını e.) akış boruları bağlanmış bir üç-kanallı haznesi. Orta kanal RNA çekilmesi için kullanılır. Üst (mavi) ve alt (yeşil) kanalları, boncuklar verilmesi için kullanılmaktadır. Deneysel bölge kırmızı bir kare ile gösterilir.
8. Kuvvet rampa Şekil. mekanik bir firkete açılımı a) kuvvet-uzama eğrisi. Çekme kırmızı, mavi ve gevşeme gösterilmiştir. Firketenin katlanmasının açılması / tekrar katlama oklarla gösterilmiştir. B) (mavi) açılması ve firketenin (kırmızı) kuvvetleri yeniden katlama Dağılımı. Şekil 39, bir metinin uyarlanmıştır.
Şekil 9. sabit kuvvet altında bir RNA firkete. Deney a) diyagramı. Saç tokası. B sabit bir kuvvet koruyacak şekilde tuzak pozisyonu firkete un / katlama için zamana karşı) geribildirim ile Kuvvet ve pozisyon değiştirilir. Kuvvet sabit tutulur gibi, tuzak konumu kuvvette firketenin İki sabit gösteren, iki değer arasında gidip gelir. Tuzak dağılımı binom dağılımı 19.4 ± 0.2 nm açılımı firketenin üzerine uzantı değişikliğini verir. Şekil 39, bir metinin uyarlanmıştır.
Bir saç tokası 10. Pasif modu Şekil. a) uzatma) kuvveti. B artırarak, uzak tuzak merkezinden tuzak boncuk getiren, kısaltır Kuvvet ve pasif modu altında bir saç tokası zamana karşı uzantısı.
İki-baz-çifti öpüşme RNA Şekil 11. Rampa. mekanik gerilme. b altında iki-baz-çifti öpüşme RNA) Hiyerarşik katlama) Kuvvet-uzatma eğrisi. Yapısal geçişler oklar c.) En düşük kuvveti öpüşme etkileşimi önlemek için 10 pN ayarlanır, kuvvet-uzatma eğrisi ile gösterilir. FiGüre Journal of American Chemical Society 34 izni ile uyarlanmıştır.
İki-baz-çifti öpüşme RNA Şekil 12. Kuvvet atlama. a) kuvvet atlama / damla çevrimi, iki farklı güçlerine unkissing ve öpüşme ömür ölçmek için. Üst panel kuvvetin zaman izini gösterir. Alt panel molekülün göreceli uzantısını gösterir. Kuvvet ilk 22 pN de öpüşme kompleksinin ömrünü ölçmek için 22 pN 3 pN atladı edilir. Unkissing tek bir büküm halinde katlanmış olan bütün RNA gösteren, ~ 30 nm uzatma hızlı bir artış olarak belirlenir. Rahatlama, gücü iki firkete katlanamayan izin 14 pN için düşürülür. Güç daha sonra pN 8'e düştü. Öpüşme etkileşim oluşumu ~ 7-8 nm uzantısında azalma ile gösterilir. B) 'Kuvvet 16 pN atladı gibi, zaman uzatma izlemesi firkete yaşanıyor ve hızla refolds. C) tüm öpüşme karmaşık olduğu sonra açılmak öpüşme kompleksi ve yedi-baz-çifti firkete, birkaç saniye sürdüğünü gösterir kuvvet birkaç saniye sonra 17.7 pN atladı tek bir iplikçik halinde gelişeceğini. Geri kalan iz 11-baz-çifti firketenin İki sabit göstermektedir. Öpüşme RNA açılmasıyla yapısal geçişler Her rakam Bilimler 28 Ulusal Akademisi Tutanakları izni ile uyarlanmıştır farklı X'i gösterir.
| Reaktif | ul |
| Plazmid (10 ng / ml) | 10 |
| Astar T7f (100 mM) | 10 |
| Astar Br (100 mM) | 10 |
| dNTP karışımı (25 mM) | 10 |
| 10xPCR tamponu | 100 |
| H2O | 850 |
| Taq DNA polimeraz | 10 |
| Toplam | 1.000 |
Not: 3 kbp'lik DNA sentezi için tipik bir termal döngü, 95 ° C 45 saniye, 53 ° C'de 1 dakika, 72 ° C 3 dakika.
Tablo 1. transkripsiyon şablon sentezlenmesi için PCR örneği.
| Reaktif | ul |
| Şablon (> 200 ng / ml) | 8 |
| NTP'ler | 8 (2 mL) ekstrakte |
| 10x reaksiyon tamponu | 2 |
| T7 RNA polimerazı | 2 |
| Toplam | 20 |
Not: 37 ° C de overni reaksiyon inkübeGHT.
Vitro transkripsiyon Tablo 2..
| Reaktif | ul |
| A (~ 10 mg) Saplı | 50 |
| Biotin-11UTP | 5 |
| T4 pol reaksiyon tamponu | 5 |
| BSA çözeltisi | 1 |
| T4 DNA polimerazı | 5 |
| Toplam | 66 |
Not: 20 dakika boyunca oda sıcaklığında reaksiyon inkübe edin. Oda sıcaklığına kadar yavaş soğutma ile, ardından 20 dakika boyunca 70 ° C'de ısıtılarak enzim etkisiz hale getirirler.
Tablo 3. Primer uzatma reaksiyonu.
| Reaktif | ul |
| Formamide | 800 |
| EDTA (0.5 M, pH 8.0) | 2 |
| BORU (1 M, pH 6.3) | 40 |
| NaCI (5M) | 80 |
| Toplam | 922 |
Tavlama tampon Tablo 4. Tarif.
| Reaktif | |
| Biotin-HA | 1.000 ng |
| Dig-HB | 1.000 ng |
| RNA | 1.000 ng |
| Tavlama tampon | 80 mi |
Not: tavlama için tipik bir ısıl döngü, 4 ° C'ye kadar rampa, ardından 95 ° C'de 10 dakika, 62 ° C 1 saat, 52 ° C 1 saat.
Kulplu Tablo 5. Tavlama RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tweezing Örnekleri Hazırlanmasında Modifikasyonu ve Sorun Giderme
Klonlama Vektör seçimi. Burada tarif edilen genel şema (Şekil 3), özel bir klonlama vektörü gerektirmese de, vektör, bir promotör istenilen pozisyonlarda durmasıyla PCR yoluyla dahil edilebilir şekilde transkripsiyonun kolaylığı için içsel T7 veya T3 için tercih edilmemektedir.
Dizi ve Kolları Uzunlukları. Kolları için özel dizi gereksinim yoktur. Bununla birlikte, en oranına yakın bir GC homopolimer ve yüksek oranda tekrarlanan diziler kaçınılmalıdır ise, tercih edilir. Yayınlanan çalışmalarda, iki adet tutamaçları ilgi RNA yapısı yaklaşık olarak ortasından yerleştirilmiştir, öyle edilene benzer boylara tutulur. Önceki iş kurnazca ölçülen kinetik 46,47 etkiler kolları toplam uzunluğu 500 10.000 baz çifti değiştiğini göstermektedir.
Tavlanmış Karışımın ve_content "> Kalite kontrol edin ve kantitasyonu. kolları ile amaçlanan RNA Bunun yanı sıra, son ürün, aynı zamanda, DNA kolları ve tavlanmamış RNA, diğerlerinin yanı sıra içerir. bu tweezing molekülleri saflaştırmak için zordur ve ekonomik değildir. Bunun yerine, tavlanmış Sadece uygun nükleik asitler, iki yüzey kaplı boncuklar gergin olabilir, çünkü karışımı, direkt olarak, tweezing için kullanılabilir. uygun şekilde tavlanmış ürünün, aynı zamanda, kulp ve agaroz jel elektroforezi üzerinde RNA ayırt edilmesi çok zordur. iyi şekilde test etmek için Kalite ve tavlanmış ürünün konsantrasyonunu ölçmek için cımbız üzerinde test etmektir. Bununla birlikte, kontrol ve çeşitli moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak, her adımda PCR ve transkripsiyon ürünlerini ölçmek için yararlıdır.Beads Urgan RNA Alternatif Yaklaşımlar. Kovalent olarak veya kovalent olmayan bir şekilde yüzeylerine 48 RNA molekülleri bağlamak için düşünülebilen birçok yöntem vardır
Tek vs Çoklu molekül Urgan. Kazı-strep- ve bir çift boncuk ile bağlantılı çok sayıda molekülün edilebilir. Boncuk cepheye birden Moleküllerin böylesi bir olasılığı didiklemek, kuvvet-mesafe eğrileri yakından incelenmesi gerekir. Tek molekül urgan çok molekül hayvan iplerini genellikle görünmeyen bir solucan benzeri zincir elastikiyetini 4 gösterilecek. Her bir sistem özel ek kontrol deneyleri, tek moleküllü bir zincire doğrulanması için gerekli olabilir.
Minitweezers İyileştirmeler
Hızlı ve Yavaş Veri Kaydı. Minitweezers yerleşik bir bu çalışmada işletme bilgisayar olarak anılacaktır bir bilgisayarda 200 Hz hızında 21 enstrümantal parametreler kadar kayıt veri toplama. Bununla birlikte, bazı Uygons ve kalibrasyonları hızlı bir veri toplama hızı gerektirir. Bu amaçla, kuvvet ve mesafe elektronik sinyalleri işletim bilgisayarda veri toplama ek olarak, yeni bir bilgisayara, "fast-kayıt" bilgisayara kaydedilmesini ayrılır. Hızlı kayıt bilgisayar 1 MHz'e kadar çoklu kanal veriyor, ayrı bir veri toplama kartı ve yazılım aracılığıyla verileri okur. Yeni bir bilgisayar ve veri elde etme sadece işletim bilgisayar tarafından kontrol edilir enstrüman, bir operasyon ile karışmaz. Bir deneyde, veri aynı anda farklı hızlarda iki bilgisayarda kaydedilir. Zaman senkronizasyonu ilgili veri dosyaları karşılaştırarak veri analizi sırasında gerçekleştirilir.
Video Görüntü Kaydı. Bir video kartı ve görüntüleme yazılımı reaksiyonun canlı görüntüleri yakalamak ve video görüntülerini analiz etmek hızlı kayıt bilgisayara yüklenir. Bu gelişme, t uygulamak mümkün kılaro piksel boyutu ve mesafe kalibrasyonları yukarıda tarif.
Sınırlamalar ve Yöntem Gelecek Uygulamalar
Tam olarak bir tek RNA molekülü yapısal değişiklikleri işlemek ve ölçmek için çeşitli yöntemler tartışılmıştır. Bu tür özellikler mümkün gerçek zamanlı bir RNA ipliğinin yapısal yeniden düzenlenmesini izlemek için yapmak. Bundan başka, kuvvet az ve / veya daha az uygun yapılar kapandı izin vererek, RNA yapısı ve katlama yollarının etkilemek için kullanılabilir.
Ancak, mekanik yaklaşımın sınırlamalar vardır. En önemlisi, uygun değişikliklere yorumlamak için kullanılan uzatma, üç-boyutlu yapıların tek boyutlu bir çıkıntıdır. Bazı yapısal değişiklikler 49-52 ölçülen olamaz, ve / veya kinetik engeller gözlem 53 gizlidir mümkündür. Çeşitli enstrümantal etkileri ve sınırlamalar da vardır ki olabilir, birffect gözlenen termodinamik ve kinetik 44,46,47.
Genom araştırmalarda 54 önerdiği çok transkript ile karşılaştırıldığında optik cımbız, RNA yapılarını sınırlı sayıda çalışma uygulanmıştır. Tekniği farklı yapısal motifleri ve büyük RNA'lar incelemek için kullanılacaktır. Buna ek olarak, bu yöntem, RNA araştırmalarında yeni uygulamalar bulacaksınız. Örneğin, ligand bağlama RNA ve proteinler ya da stabilize mekanik yaklaşımı kullanılarak ölçülebilir RNA yapısı değişebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minitweezers | Steven B. Smith Engineering | http://tweezerslab.unipr.it | |
| Data acquisition card | National Instruments | USB-6351 | |
| Video card | National Instruments | PCI-1407 | |
| Labview programming software | National Instruments | ||
| NI Vision Builder | National Instruments | ||
| Laser engraver | Epilogue laser systems | Zing-16 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MEGAscript T7 kit | Life Technologies | AM1334 | |
| MEGAclear kit | Life Technologies | AM1908 | |
| Biotin-11-UTP | Thermo Fisher | FERR0081 | |
| T4 DNA polymerase | New England Labs | M0203 | |
| Streptavidin coated microsphere | Spherotech | SVP-20-5 | |
| Antidigoxigenin coated microsphere | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| Size standard microspheres | Spherotech | PPS-6K | |
| Kapton tape | Kaptontape.com | KPPTDE-1 | |
| No. 2 cover glass | Thermo Fisher | 12-543D |
References
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
- Maier, B. Using laser tweezers to measure twitching motility in Neisseria. Current opinion in microbiology. 8, 344-349 (2005).
- Wang, S., Arellano-Santoyo, H., Combs, P. A., Shaevitz, J. W. Measuring the bending stiffness of bacterial cells using an optical trap. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. 271, Science. New York, N.Y. 795-799 (1996).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. 271, Science. New York, N.Y. 1835-1837 (1996).
- Bryant, Z., et al. Structural transitions and elasticity from torque measurements on DNA. Nature. 424, 338-341 (2003).
- Liphardt, J., Onoa, B., Smith, S. B., Tinoco, I., J,, Bustamante, C. Reversible unfolding of single RNA molecules by mechanical force. 292, Science. New York, N.Y. 733-737 (2001).
- Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA unfolds and refolds. Annu Rev Biochem. 77 (27), 21-24 (2008).
- Woodside, M. T., Garcia-Garcia, C., Block, S. M. Folding and unfolding single RNA molecules under tension. Current opinion in chemical biology. 12, 640-646 (2008).
- Cecconi, C., Shank, E. A., Bustamante, C., Marqusee, S. Direct observation of the three-state folding of a single protein molecule. 309, Science. New York, N.Y. 2057-2060 (2005).
- Shank, E. A., Cecconi, C., Dill, J. W., Marqusee, S., Bustamante, C. The folding cooperativity of a protein is controlled by its chain topology. Nature. 465, 637-640 (2010).
- Morin, J. A., et al. Active DNA unwinding dynamics during processive DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 8115-8120 (2012).
- Larson, M. H., Landick, R., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase one singular sensation every little step it takes. Molecular cell. 41, 249-262 (2011).
- Wen, J. D., et al. Following translation by single ribosomes one codon at a time. Nature. 452, 598-603 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Pease, P. J., et al. Sequence-directed DNA translocation by purified FtsK. 307, Science. New York, N.Y. 586-590 (2005).
- Dumont, S., et al. RNA translocation and unwinding mechanism of HCV NS3 helicase and its coordination by ATP. Nature. 439, 105-108 (2006).
- Greenleaf, W. J., Woodside, M. T., Block, S. M. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 36, 171-190 (2007).
- Serganov, A., Nudler, E.
- Breaker, R. R. Prospects for riboswitch discovery and analysis. Molecular cell. 43, 867-879 (2011).
- Wan, Y., et al. Genome-wide measurement of RNA folding energies. Molecular cell. 48, 169-181 (1016).
- Dalgarno, P. A., et al.
- Wood, S., Ferre-D'Amare, A. R., Rueda, D. Allosteric tertiary interactions preorganize the c-di-GMP riboswitch and accelerate ligand binding. ACS chemical biology. 7, 920-927 (2012).
- Brenner, M. D., Scanlan, M. S., Nahas, M. K., Ha, T., Silverman, S. K. Multivector fluorescence analysis of the xpt guanine riboswitch aptamer domain and the conformational role of guanine. Biochemistry. 49, 1596-1605 (2010).
- Greenleaf, W. J., Frieda, K. L., Foster, D. A., Woodside, M. T., Block, S. M. Direct observation of hierarchical folding in single riboswitch aptamers. 319, Science. New York, N.Y. 630-633 (2008).
- Frieda, K. L., Block, S. M. Direct observation of cotranscriptional folding in an adenine riboswitch. 338, Science. New York, N.Y. 397-400 (2012).
- Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39, 7677-7687 (2011).
- Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Unusual Mechanical Stability of A Minimal RNA Kissing Complex. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15847-15852 (2006).
- Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Real-time control of the energy landscape by force directs the folding of RNA molecules. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 7039-7044 (2007).
- Tinoco Jr, I., Li, P. T. X., Bustamante, C. Determination of ther modynamics and kinetics of RNA reactions by force. Q Rev Biophys. 39, 325-360 (2006).
- Onoa, B., et al. Identifying kinetic barriers to mechanical unfolding of the T thermophila ribozyme. 299, Science. New York, NY. 1892-1895 (2003).
- Li, P. T., Tinoco Jr, I. Mechanical unfolding of two DIS RNA kissing complexes from HIV-1. J Mol Biol. 386, 1343-1356 (2009).
- Smith, S., Cui, Y., Bustamante, C. Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum. Methods Enzymol. 361, 134-162 (2003).
- Stephenson, W., et al. The essential role of stacking adenines in a two-base-pair RNA kissing complex. J Am Chem Soc. 135, 5602-5611 (2013).
- Kaiser, C. M., Goldman, D. H., Chodera, J. D., Tinoco Jr, I., Bustamante, C. The ribosome modulates nascent protein folding. 334, Science. New York, NY. 1723-1727 (2011).
- Bizarro, C. V., Alemany, A., Ritort, F. Non-specific binding of Na+ and Mg2+ to RNA determined by force spectroscopy methods. Nucleic acids research. 40, 6922-6935 (2012).
- Bosaeus, N., et al. Tension induces a base-paired overstretched DNA conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15179-15184 (2012).
- Berg-Sørensen, K., Power Flyvbjerg, H. spectrum analysis for optical tweezers. Rev Sci Instrum. 75, 594-612 (2004).
- Stephenson, W., et al. Combining temperature and force to study folding of an RNA hairpin. Phys Chem Chem Phys. 16, 906-917 (2014).
- Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys J. 72, 1541-1555 (1997).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic rates and activation free energies from single-molecule pulling experiments. Phys Rev Lett. 96, 108101 (2006).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proc. Natl Acad Sci USA. 105, 15755-15760 (2008).
- Li, P. T. X., Collin, D., Smith, S. B., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Probing the Mechanical Folding Kinetics of TAR RNA by Hopping, Force-Jump and Force-Ramp Methods. Biophys J. 90, 250-260 (2006).
- Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S.
- Li, P. T. X. Analysis of Diffuse K+ and Mg2+ Ion Binding to a Two-Base-Pair Kissing Complex by Single-Molecule Mechanical Unfolding. Biochemistry. 52, 4991-5001 (2013).
- Wen, J. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophys J. 92, 2996-3009 (2007).
- Manosas, M., et al. Force Unfolding Kinetics of RNA using Optical Tweezers II. Modeling Experiments Biophys J. 92, 3010-3021 (2007).
- Vilfan, I. D., et al. An RNA toolbox for single-molecule force spectroscopy studies. Nucleic acids research. 35, 6625-6639 (2007).
- Li, P. T. X. Formation of a metastable intramolecular RNA kissing complex by nanomanipulation. Soft Matter. 9, 3246-3254 (2013).
- Chen, G., Chang, K. Y., Chou, M. Y., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Triplex structures in an RNA pseudoknot enhance mechanical stability and increase efficiency of -1 ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 12706-12711 (2009).
- Chen, G., Wen, J. D., Tinoco Jr, I. Single-molecule mechanical unfolding and folding of a pseudoknot in human telomerase RNA. 13, RNA. New York, N.Y. 2175-2188 (2007).
- Tinoco, I., Chen, G., Qu, X. RNA reactions one molecule at a time. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2, a003624 (2010).
- Dudko, O. K., Graham, T. G., Best, R. B. Locating the barrier for folding of single molecules under an external force. Physical review letters. , 107-208301 (2011).
- Djebali, S., et al.
