Summary
在这里，我们描述了学习的海马神经发生产后使用的器官切片培养技术的技术。此方法允许在体外操纵成年神经发生，并允许直接应用的药剂的培养海马。
Abstract
在这里，我们描述了使用器官切片培养技术研究海马神经发生产后的啮齿类动物的大脑的技术。该方法保持了海马的特征地形的形态，同时允许直接应用的药剂给显影海马齿状回。此外，切片培养物可维持4周，因此，允许一个研究新生儿颗粒神经元的成熟过程。切片培养允许有效药理操纵海马切片的同时排除复杂的变量，例如与海马的深解剖位置，以及血脑屏障的不确定性。由于这些原因，我们试图专门优化器官切片文化为产后神经研究。
Protocol
注：所有动物的程序符合比较医学系的多伦多大学的动物健康和福利的指导方针。
1.准备海马脑片
- 消毒使用干高压釜以下仪器在125℃：手术刀手柄（＃3）（2），标准模式钳，大（1），小解剖剪（倾斜到另一侧）（1），微勺（勺子和平坦抹刀端）（1），微抹刀（圆形和圆角锥形端）（2）中，细画笔（1），火抛光的巴斯德吸液管（2），纱布正方形，2×2英寸（5）。
- 当无菌的，把工具插入一个无菌容器中，并保持盖直至使用。立即解剖前，浸在70％的乙醇溶液的仪器。
- 通过加入1ml培养基/孔，并存储该板在培养箱中在35℃的开始清扫程序之前准备一个6孔培养板培养插管次5％的CO 2。
2.安排解剖工具在无菌层流罩
- 喷层流罩，用70％的乙醇，并从醇除去灭菌解剖仪器。允许仪表干燥而搁置在无菌培养皿，以避免醇与解剖大脑组织之间的接触。
- 存款5-7毫升的2个大型无菌培养皿消毒冰冷的解剖解决方案。一盘会放松并清洁头（脏），另一种用于冷却和冲洗舀出脑（清洁）。放置无菌滤纸的培养皿盖子解剖出脑之一。
- 放置一个小的，无菌滤纸的小的培养皿盖子解剖出海马中的一个。存款3-5毫升消毒冰冷的解剖解决方案2小，无菌培养皿。一盘将举办挖出海马，一会的海马部分分离时持有的部分解剖显微镜下。
- 由胶带一块无菌滤纸到切割阶段和安装无菌刀片准备组织斩波。湿用无菌解剖溶液的滤纸上。
- 喷雾清洁生物袋用酒精，并将其放置在层流超净工作台。
3.海马解剖
- 喷P7只SD大鼠幼崽，用70％的乙醇的层流净化台的外面，并迅速用层流长凳里面大无菌手术剪刀斩首动物。让头部落入冰冷解剖溶液中的培养皿1。
- 在培养皿中，冲洗过的血液，并迅速转移到头部灭菌滤纸，腹侧下来。
- 使用手术刀，沿背表面在矢状面切割以暴露下面的头骨。切穿皮肤，但不是底层骨，这是软的，很容易穿透大鼠吨的他的年龄。抛开这种“脏”手术刀，也不对脑组织使用。
- 用小剪刀剥离（角度到另一侧）和钳，切开颅骨沿颅骨矢状缝到前囟门，在那里的冠状缝被矢状缝垂直相交的头骨解剖点。使用镊子从头骨的中线拉头骨襟翼起来了。
- 放置在脑的下侧，脑干下方的微勺，轻轻抬起脑出颅骨。提起大脑暴露视神经和嗅球脑基底表面。切开这些结构用小剪刀从头骨完全分离的大脑。删除和完整的大脑转移到含有冰冷的解剖解决方案等大型培养皿。
- 使用微勺，大脑转移到含有无菌滤纸的小培养皿盖。用无菌巴斯德吸管，冲洗大脑用几滴DIS的secting的解决方案，以保持组织的湿润。
- 使用“干净”的手术刀切开两半球分开。转让左半球背到大培养皿微勺子上下放置半球PIA一边为后续使用冰冷的解剖解决方案。
- 查看面对内侧右半球和识别边缘穹窿，白质沿内侧缘海马的一个突出带。用无菌解剖刀，使通过穹窿矢状切，但照顾因为手术刀尖端仅0.5厘米将足以切割穹窿。
- 使用2微抹刀，通过将右手抹刀上脑干和起吊上覆皮质与左手刮刀移除右半球第一海马。轻轻抬起皮质揭示海马侧脑室内侧面。白色曲线，伞端，现在应该是可见的。
- 抹刀的曲率对准看台伞端的自命轻轻按下伞下铲。向左滑动锅铲，沿着喙，尾轴骑，然后抬起铲背的方向，除去海马。
- 海马转移到第二小培养皿用冰冷的解剖溶液。重复左侧半球相同的步骤拆下左海马。
- 用微型抹刀，仔细海马转移到组织菜刀阶段。排列它们相邻并彼此平行并垂直于斩波叶片的轴线。使用画笔来定位组织并在海马的顶部加几滴解剖溶液。
- 削减400微米的切片组织没有停下来删除单个片（通常他们会不会坚持到刀片）。整个海马已被切断后，用画笔来的部分轻轻地转移到第二小的培养皿剥离的解决方案。
- 根据广告issecting显微镜，仔细分离使用amicro，铲和画笔浮动片。
- 取出预先准备好的培养板从培养箱并置于层流罩培养插管。
- 使用火抛光的巴斯德吸管，吸取4-5片放入吸管和转移切片文化插入膜的顶面。接着，调整用画笔的定位和离开的各个部分，并培养插入物的边界之间的空间。
- 用无菌巴斯德吸管，去除膜的顶面多余的解剖解决方案。
注：卸下解决方案避免将组织切片放入吸管。另外，使用常规的移液管（P200或P1000）用灭菌枪头慢慢消除解决方案。 - 放置在培养板用含血清的培养基中，并在海马切片放回培养箱中在35℃和5％的CO 2。
注意：如果实验通话从多个动物产生的文化，彻底清洁夹层之间的层流洁净工作台。返回仪器酒精溶液，并更换所有培养皿，滤纸和之前第二清扫消毒刀片。
4.饲养和维护器官切片
- 饲料文化在无菌层流洁净工作台。
- 执行部分培养后2天解剖的第一馈送。使用消毒的玻璃吸管吸出旧的培养基。
- 使用无菌5毫升血清吸液管来加入1 ml新鲜，无菌的，含有血清的培养基的孔中。
- 轻轻地取代文化插入和照顾，以消除可能已经膜表面之下形成的气泡。
- 第一进给后，介质改变每隔一天。
5.孵化组织切片与胸苷类似物标签新生神经元
- 为了探讨成熟和整合齿状颗粒细胞在海马，孵化器官切片与胸苷类似物，如溴脱氧尿苷（尿嘧啶）或Chlorodeoxyuridine（CldU）。在这里，我们使用，因为在生理盐水中的溶解度较高的CldU。
- 3DIV后，对于10微克/ ml的终浓度加入1微升10毫克/毫升CldU原液在盐水到1ml培养基。如果BrdU的被使用，校正分子量的差异的浓度。与CldU添加培养基培养孔，并培育组织与CldU含培养基2小时，在35℃。
- 以下2小时温育在35℃，除去含CldU培养基并用常规给送介质替换以恢复正常喂养时间表（上面概述的）。
6.组织固定和存储
- 建立的时间表用于施加处理和固定组织样品开始培养实验（图2B）之前。 <li>在预定天后解剖，准备以下在实验室通风柜：含有10-50毫升烧杯4％多聚甲醛（PFA）在磷酸盐缓冲盐水（PBS）;空烧杯丢弃培养基;小镊子;和1000毫升吸管与一次性吸头。
- 去除孵化室和转移培养板（S）到通风橱。倾斜单井板镶钳。接下来，用吸管去除培养基，并转移到处置烧杯中。倾斜培养板以一定角度，以帮助确保所有培养基被除去。
- 散场时间删除介质一种文化板块。当媒体已被删除，加入1 ml 4％PFA的每培养孔和密封孔板封口膜。重复许多培养板作为必要和转移板到冰箱，在4℃下放置24小时。
- 24小时后，准备在通风橱下：10-50毫升烧杯含有0.1％叠氮化钠的PBS中;空烧杯丢弃PFA（遵守安全注意事项丢弃有毒物质时）;小镊子;和吸管一次性吸头千毫升。
- 按照6.4中概述用于添加煤灰的方法，但添加1ml的PBS中与叠氮化钠代替。一旦完全转移，密封孔板供将来使用通过包装边缘封口膜，并在4℃下储存在冰箱中。
7.组织切片的免疫组化
- 执行组织使用振动切片。以下一系列步骤有助于最大限度地从器官型培养可用组织切片的产率。
注：紧随海马解剖和切片的电镀，所述组织的厚度为约400微米。然而，2-3周，在孵育室后，组织切片会开始变平，从而产生最后一节的150-300微米厚。 - 准备好以下项目第培养组织：一个＃11手术刀B拉德和处理，含冰冷PBS，微解剖钳，和一个清洁的vibratome切割阶段装入组织的玻璃培养皿。
- 使用解剖刀小心沿圆形刀片膜的周边切割，以便它可以从塑料插入件壳体上卸下。离开培养切片和手术刀之间的充足的空间。
- 该分离插入膜转移到含PBS的培养皿。漂洗在PBS后，用钳子向膜转移到的vibratome安装阶段。
- 接下来，用手术刀来消除周围的培养切片多余膜切掉多余的材料，以创造清洁的边缘。这个步骤将确保该膜是平坦的，可以很容易地粘附在切割表面。
- 放置1-2滴粘合剂上的vibratome切割阶段和散布在偶数层用22克针。散布粘合剂为矩形形状具有平行于的vibratome的切割刀片的长边。执行此步骤快，以防止干燥的粘合剂。
- 使用镊子包含海马切片修整膜转移至所述切割阶段，并轻轻地定位于胶膜，并确保没有气泡。
- 作为强力胶干燥，用粘膜回的PBS含培养皿转移的vibratome阶段。制备的vibratome刀片和一个48孔平板含有叠氮化钠来存储组织切片。
- 使用的vibratome生成器官切片组织和转移的30微米的部分，以一个48孔板含有叠氮化钠进行存储和随后的免疫组织化学染色。
- 参阅预先存在用于免疫组化染色26,29协议。
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Representative Results
确定是否器官培养物将适合于成年神经研究需要它们满足两个主要标准：1），该片段保持海马切片的特性形态学特征后10-21天内在体外 （DIV），和2），初生DGCS可以量化采用常用于成年神经研究标准的免疫组化技术。关于第一个标准， 图1A和1B突出保存海马形态。特征，如齿状回（DG），CA1和CA3地区是容易辨认。
对于第二准则， 图1C（上图）提供新生DGCS共表达的内源性神经元的标记物，Doublecortin（DCX）的绿色和外源性胸苷类似物，5-氯-2'-脱氧尿苷（CldU）的有代表性的样本红色。这些神经元位于子克海马DG的纤维环区。为了保证生育约会的神经元正确的，我们确定CldU +核的共表达DCX。共焦显微镜，需要在此阶段成功识别双标记神经元，因为候选小区必须共表达感兴趣的标记在整个小区的Z轴。这种双标记收率获得样本数据CldU +细胞中表达的DCX和CldU +细胞中表达钙结合蛋白，在后CldU应用12天的35％的约17％。的DCX值非常相似，而钙结合蛋白值比在体内 26获得可比数字低得多。标准组织培养条件下可以负责的钙结合蛋白+细胞的比例相对较低。
图2A呈现了继续从左至右（1-8）的解剖步骤：开始用动物断头（1）中，去除脑的（2），脑转移到冰冷的夹层溶液（3），解剖离子海马从左，右半球（4），存储解剖海马在冰冷的夹层溶液（5），传送两个海马至Stoelting组织斩波中，并在400微米（6），分离单个切片解剖显微镜下切片（7），和镀覆对细胞培养插入组织（8）。继续以这种方式有助于保持整个培养过程中的无菌环境。
最后，由于时间的发展历程是海马神经发生的一个重要特征，我们选择了孵化培养片与CldU了整整2个小时后，3 DIV标签来划分的神经干细胞。被选择的窄时间窗CldU给药，以提高该标记的神经元构成的同质细胞群以大致相同的成熟阶段（ 图2）的可能性。随着关于CldU标签，用于神经海马功能的一个重要特点是，在GIVEN时候有齿状颗粒细胞在不同的成熟阶段27,28异质群体。
图1.样本荧光显微镜照片高亮保存海马形态。 12天后解剖免疫标记为CldU（绿色）和钙结合蛋白（红色），20倍空气合成图像（A）的器官切片（比例尺= 500微米）。（B）样品切片二十一日显微解剖后免疫标记为CldU（红色）和DCX（绿色） 图1A的（相对颜色方案），20倍的空气（比例尺= 100微米）。（C）的上面板。细胞的代表共聚焦显微镜照片共表达ClXdU和内源性神经元不成熟标志，DCX。 DGCS共表达DCX（绿色）和CldU（红色）都算作新生神经元。箭头表示一个双拉贝导致细胞的发展，40X油浸（比例尺= 10微米）的早期阶段。可比细胞已被观察到的后10天标记在体内 26。较低的面板。细胞的代表性荧光图像共表达CldU（绿色）和钙结合蛋白（红色）。箭头表示一个双标记细胞，40X荧光显微镜照片（比例尺= 10微米）。 DG-齿状回。 GCL-颗粒细胞层。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.（A）插图的层流超净工作台海马切除的顺序步骤 。虚线表示解剖区域的“未消毒”（左）和“无菌”（右）的区域。（B）时间轴有机从P7幼鼠（开始）准备typic切片文化。符号表示应用胸苷模拟，CldU *和“待遇”，其中包括适用于实验问题的各种药物制剂的。文化是从CldU应用程序（修复文化）所需的停留时间固定，多聚甲醛。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 试剂/设备名称 | 公司 | 目录编号 | 评论/说明 |
| 5-氯-2'-脱氧尿苷（CldU） | MP Biomedicals的 | 105478 | 有害，致癌 |
| 细胞培养插入，直径30毫米，0.4微米P矿石大小 | Thermo Scientific的 | 140660 | 在这些插入Nuclon三角洲涂层提供更好的组织粘连，提高切片质量。 |
| 锥形离心管（无菌） | Fisher Scientific公司 | 14-432-22 | |
| 剥离剪刀（角度到另一侧） | 精细的科学工具 | 14082-09 | |
| 极限必需培养基（MEM） | GIBCO | 11095;液体 | 储存在4℃ |
| Eclipse的镍-U荧光显微镜 | 尼康 | ||
| 胶水组织 | 疯狂之胶 | KG585 | 用胶水最低金额达到附着力暴露胶水任何组织将不能用于IHC。 |
| Hank氏平衡盐溶液（HBSS）（500毫升）中 | GIBCO | 14025-092 | 储存在4℃ |
| 马血清热灭活的（500毫升）中 | GIBCO | 16050-122 | 拥有50毫升分装和储存在-20℃ |
| 的Kimwipes | 金佰利 - 克拉克 | TW 31KYPBX | |
| 改性玻璃移液器（巴斯德吸管去除和边缘平滑与本生灯火焰底部） | |||
| 培养皿英寸（100毫米×15毫米），和（60毫米×15毫米） | 费舍尔品牌 | FB0875712和FB0875713A | |
| 手术刀片＃11 | 精细的科学工具 | 10011-00 | |
| 手术刀手柄＃3 | 精细的科学工具 | 10003-12 | |
| 血清学移液器 | Sorfa医用塑料有限公司 | P8050 | |
| 标准模式钳 | 精细的科学工具 | 11000-12 | |
| 无菌真空过滤机 | 热科学 | 565-0020 | |
| 手术剪刀 | 精细的科学工具 | 14054-13 | |
| 注射器驱动过滤装置 | Millipore公司，新型Millex | SLGP033RS | |
| 组织菜刀与可移动舞台 | Stoelting | 51425 | |
| 精尖的画笔 |
表1.耗材和试剂
| 解 | 成分及使用说明 |
| 夹层解决方案 | 一）500毫升汉克＆＃39;平衡盐溶液（HBSS）（Gibco公司-14025-092）。 |
| 二）添加2.2克D-葡萄糖。 | |
| c）增加0.5克蔗糖。 | |
| d）增加1.787克HEPES。 | |
| E）混合30分钟，磁力搅拌板。 | |
| F）使用pH计，以确保溶液的最终pH = 7.4。 | |
| G）使用渗压计，以确保最终的渗透压= 320-330毫渗量。 | |
| h）至0.2微米的过滤器真空过滤消毒的无菌层流罩溶液。 | |
| 含血清培养基：百毫升最低基本培养基（MEM）（Gibco公司11095），将50ml马血清（Gibco公司16050-122），50毫升的HBSS。 | 一）添加以下到50毫升的HBSS在烧杯中，溶解于37℃水浴。混合磁力搅拌器。 |
| 二）1.3克D-葡萄糖。 | |
| C）36毫克的硫酸镁 。 | |
| ð）17.6毫克抗坏血酸。 | |
| 五）5微升2M 氯化钙原液。 | |
| F）加入50微升抗生素 - 抗真菌剂（100倍的股票，不育; Gibco公司15140-062）。 | |
| 克）1μg/ ml的胰岛素。 | |
| 八）消毒上面通过0.2微米的过滤器的溶液进行过滤。 | |
| ⅰ）用100毫升的MEM混合过滤的溶液，并在层流罩50毫升马血清。 | |
| j）条制成50毫升分装在无菌的圆锥形离心管（Fisher Scientific公司，14-432-22），并在4℃下存储。 | |
| 4％多聚甲醛固定液。 | a）加入以下到300毫升蒸馏水的H 2澳和磁搅拌板上搅拌准备磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。 |
| 二）添加2.7克磷酸二氢钠（的NaH 2 PO 4）。 | |
| c）增加11.5克钠phosphatË二元（NaHPO 4）。 | |
| d）增加9.0克氯化钠（NaCl）中。 | |
| E）热约。 700毫升蒸馏水2 O至55°C，并熄火。 | |
| F）加入40克多聚甲醛（PFA），并搅拌成700ml水中，用磁力搅拌板。 | |
| 克）合并PBS（A，B，C，D）和PFA（E，F）的解决方案，将pH调节至7.4并补足至1000 ml终体积。 | |
| 0.1％的叠氮化钠溶液 | 一）添加的粉状叠氮化钠1克（NaN 3的）至1升的PBS溶液。 |
| b）使用混合磁力搅拌板，并储存在4℃。 |
表2.解决方案和食谱
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Discussion
以下CldU（或尿嘧啶）施用，施用药剂的时间轴可以被选择为目标时特定发育窗户新生儿DGCS。例如，一个假想的代理可以在第二星期后CldU注射，这是建议用未成熟的神经元是在发育阶段的GABA被去极化的年龄相一致时被应用。使用该协议的将来的研究可以适应的药理剂和暴露于“量体裁衣”的方法对感兴趣的具体的实验问题的窗口。
用于确定切片文化是产后神经研究的一个有效模式的一个重要标准是染色和量化新生神经元在海马的能力。支持这一假设的两个主要发现是显微镜分析表明免疫反应性CldU和内源性蛋白标记在同一个神经元。当在与内源性神经元的标记物组合使用，胸苷类似物如尿嘧啶和CldU是用于神经发生研究的有力工具。
胸苷类似物，如尿嘧啶的应用，通过腹膜内注射在神经发生研究通常用于标签的神经元经历S相有丝分裂29。类似的方法可以用在器官培养物与某些修改。例如，以前的研究给药的BrdU（0.5μM3天）后14〜18的DIV切片培养物。在回顾了本文提出的数据表明，一些度量的用于定量神经发生不采用在神经发生领域， 即所使用的标准技术，体视量化30。例如，报告的共表达的BrdU和神经细胞 - 核（的NeuN）阳性细胞时，它们表明提供通知的细胞“的培养每”总数代替ATION关于组织区域或体积。
随后的研究由切片培养切片个体10微米的部分，其通过允许抗体更容易渗透的组织样本31改进的可视化和免疫组化协议改进了这种方法。双层等 28报道用BrdU双标记（10μM3天），为每10微米部分共标记的细胞的数目，但没有提供关于在比较区域或特定海马区的研究，即，CA1区，CA3区或信息DG。此外，共焦和荧光显微镜图像的分析不能令人信服地表明，海马形态学被成功保持。
重要的是，这两种研究中所用的3天的BrdU曝光周期，其具有相关联的缺点。 BrdU标记通过允许调查人员跟踪新分裂细胞VA大大的资助，研究神经rious的大脑区域。然而，BrdU的毒性也得到了很好的特点。它的使用已经显示出导致形态学和行为异常32,33和对神经干细胞34-36的细胞周期，分化，迁移和存活的不利影响。的BrdU在前面提到的研究长期施用可以引入了混淆变量，它改变海马生理学和同时从BrdU的施用一定的副作用可能是不可避免的，我们的实验方案的设计是由温育胸苷类似物的组织，以限制一些并发症的2小时。此外，我们选择使用CldU代替尿嘧啶，因为它的时候准备孵化的解决方案表现出比尿嘧啶更好的溶解性。虽然3天协议可以是用于某些实验设计如有用，从而最大限度地增殖细胞的标记，此2小时协议具有的相对小的地区人口脉冲标记的一个优点其可以在期望的存活时间来研究细胞的灰（ 见图2B）。
通过比较神经元产生以下两种不同的BrdU应用，难波等人取得器官切片文化37贴标技术的重要贡献方法的水平。作者比较了腹膜内（IP）注射的BrdU（50毫克/千克）在出生后第5天（P5）大鼠体外接受含有1μM的BrdU的30分钟后立即组织的外植培养基培养物。他们报告无统计学差异显著在体内和早期体外的BrdU注射培养组织。作者并没有给出清晰的影像勾勒出海马结构，但他们报道的BrdU免疫反应的细胞总数的颗粒细胞层的百分比。虽然他们采用的体视学计数，按面积或体积提供了一个措施将是有价值的。大体，引用的研究目前器官文化为彻底，详细产后海马切片的文化，与神经发生和药理扰动的研究应用。使用这种技术，海马切片可维持长达21天的体外 （DIV）和药物可以添加到培养基中，在培养期间的任何点，研究对神经发生的效果。
我们的目标是通过提供2小时CldU简要'脉冲'应用程序标记DGCS的离散，相对同质的群体。一个常用的策略研究神经通过免疫组化染色各种内源性标志物胸苷模拟包括识别神经元的发育成长阶段。共焦和荧光显微镜证实该核掺入的胸苷类似物CldU和培养期间进行，因此积极地进行有丝分裂的存在; 图2 体内组织分析免疫组织化学的协议可以适于切片培养物。
具体地，在神经发生研究一个常用的方法是进行免疫组织化学染色的微管相关蛋白，DCX，这主要是在未成熟的神经元从3-21天，成熟的神经元标记物，钙结合蛋白（钙结合蛋白）表示，这是充分表达以下后28天，有丝分裂。 CldU +细胞的表型，使用这些内源性标志物26来确定。
改进的用于保持切片培养一段较长时间的方法可以具有允许更多CldU +神经元到达成熟，钙结合蛋白+级的额外的好处。目前，器官型培养方法的一个限制是该组织培养期间连续变化。例如，立即片海马解剖和电镀以下，钛ssue具有大约400微米的宽度。然而，2-3周，在孵育室后，组织切片将开始薄，这导致了最终宽度250-350微米之间。这限制了组织可用于免疫组织化学和规划多少动物使用的项目时，应考虑的量。进一步的实验将有助于表征海马生理发生在体外的功能变化。
该协议切片和染色海马的开发是为了分析在培养期间发生的细胞和形态的变化。切片文化提供了一个机会，以测试各种药物制剂的效果海马DGCS成熟过程中通过不同的发展阶段，并代表了未来的成年神经研究的宝贵工具。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
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