Summary
Her beskriver vi en teknik til at studere hippocampus postnatal neurogenese anvendelse af organotypisk skive dyrkningsteknik. Denne metode giver mulighed for in vitro-manipulation af voksne neurogenese og giver mulighed for en direkte anvendelse af farmakologiske midler til den dyrkede hippocampus.
Abstract
Her beskriver vi en teknik til at studere hippocampus postnatal neurogenese i gnaverhjerne hjælp af organotypisk skive dyrkningsteknik. Denne metode bevarer den karakteristiske topografiske morfologi af hippocampus, samtidig med at direkte anvendelse af farmakologiske midler til udviklingslandene hippocampus gyrus dentatus. Derudover kan skive kulturer opretholdes i op til 4 uger og dermed tillader en at studere modningsprocessen af nyfødte granula neuroner. Skivekulturer mulighed for effektiv farmakologisk manipulation af hippocampusskiver mens undtagelse af sammensatte variabler som usikkerheder omkring den dybe anatomiske placering af hippocampus samt blodhjernebarrieren. Af disse grunde har vi forsøgt at optimere organotypiske skive kulturer specielt til postnatale neurogenese forskning.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med de for dyresundhed og -velfærd retningslinjer for Afdeling for Medicin ved universitetet i Toronto.
1. Fremstilling af hippocampusskiver
- Steriliseres følgende instrumenter ved hjælp af tørre autoklave ved 125 ° C: Skalpel håndtag (# 3) (2), standardmønster pincet, store (1), Lille dissektoren saks (vinklet til side) (1), Micro ske (skeen og flad spatel ender) (1), mikro-spatler (afrundet og afrundede tilspidsede ender) (2), fine pensel (1), Fire poleret Pasteur pipette (2), Gaze pladser, 2 x 2 inches (5).
- Når sterile, sætte instrumenterne i en steril beholder og holde dækket indtil brug. Umiddelbart før dissektion, fordybe instrumenter på en 70% ethanol opløsning.
- Forbered en 6-brønds kultur plade med kultur insert før du begynder dissektion procedure ved godt at tilsætte 1 ml dyrkningsmedium / og lagring af pladen i inkubatoren ved 35 ° C and 5% CO 2.
2. Arranger Dissektion Tools i sterile Laminar Flow hætte
- Spray laminar flow hætte med 70% ethanol og fjern steriliseret dissektion instrumenter fra alkohol. Lad instrumenterne tørre mens de hviler på en steril petriskål at undgå kontakt mellem alkohol og det dissekerede hjernevæv.
- Depositum 5-7 ml steriliseret iskold dissekere opløsning i 2 store sterile petriskåle. En skål vil chill og rense hovedet (beskidte), den anden til køling og skylle vundet ud hjernen (ren). Placer en steriliseret filtrerpapir i en af petriskålen låg til dissekere ud hjernen.
- Placer en lille steriliseret filterpapir i en af den lille petriskål låg til dissekere ud hippocampus. Depositum 3-5 ml steriliseret iskold dissekere opløsning i 2 små, sterile petriskåle. En skål vil holde vundet ud hippocampus, vil man holde sektioner under adskillelse af hippocampus sektionerunder dissektionsmikroskop.
- Forbered vævshakker ved at tape et stykke steriliseret filtrerpapir til skæretrinnet og montering af en steril barberblad. Fugt filtrerpapir med steriliseret dissekere opløsning.
- Spray en ren bio-pose med alkohol og placere den i laminar strømning ren bænk.
3. Hippocampal Dissektion
- Spray P7 Sprague Dawley rotteafkommets med 70% ethanol uden for laminar strømning ren bænk og hurtigt halshugge dyret ved hjælp af store sterile kirurgiske sakse inde i laminar flow bænk. Lad hovedet falde i iskoldt dissekere opløsning i en af petriskåle.
- I petriskålen, skylle blodet og hurtigt overføre hovedet til steriliseret filterpapir, ventral side nedad.
- Ved hjælp af skalpel skæres langs den dorsale overflade i sagittalplanet at eksponere den underliggende kraniet. Skær gennem huden, men ikke den underliggende knogle, som er blød og let gennemtrængelige i rotter thans alder. Braklægning denne "beskidte" skalpel og ikke bruger på hjernevæv.
- Brug de små dissektoren saks (vinklet til side) og pincet, skåret åbne kraniet langs sagittale sutur af kraniet til bregma, anatomiske punkt på kraniet, hvor koronale sutur skæres vinkelret med sagittale sutur. Brug pincet til at trække kraniet flapper op og væk fra midterlinjen af kraniet.
- Placer micro skeen på undersiden af hjernen under hjernestammen, forsigtigt løfte hjernen ud af kraniet. Løft hjernen for at blotlægge de optiske nerver og lugtekolben på basale overflade af hjernen. Skær disse strukturer med en lille saks til fuldt ud at frigøre hjerne fra kraniet. Fjern og overføre den intakte hjerne til den anden store petriskål indeholdende iskold dissekere løsning.
- Brug af micro-spoon, overføre hjernen til en lille petriskål låg indeholdende sterilt filterpapir. Med en steril Pasteur-pipette, skylles hjernen med et par dråber dissecting løsning til at holde væv fugtig.
- Ved hjælp af en "ren" skalpelblad skære de to halvkugler fra hinanden. Overfør venstre hjernehalvdel tilbage til stor petriskål med micro ske og læg halvkugle pia nedad i iskold dissekere løsning til senere brug.
- Se den mediale flade af den højre hemisfære og identificere kant fornix, en fremtrædende bånd af hvid substans langs den mediale kant af hippocampus. Ved hjælp af en steril skalpel skæres et sagittale snit gennem fornix, men passe fordi kun 0,5 cm af skalpel tip vil være tilstrækkelig til at skære fornix.
- Anvendelse af 2 mikro-spatler, fjerne den første hippocampus fra højre hemisfære ved at placere højre-spatel på hjernestammen og løfte den overliggende cortex med venstre spatel. Løft forsigtigt cortex at afsløre den laterale ventrikel og mediale overflade af hippocampus. En hvid buet linje, den fimbria, nu skal være synlig.
- Juster krumning spatel med curvastilling af den fimbria og tryk forsigtigt spatel under fimbria. Skub spatel til venstre og ride langs rostral-caudale akse og løft spatel i dorsal retning for at fjerne hippocampus.
- Overfør hippocampus til en 2 nd lille petriskål med iskold dissekere opløsning. Gentag samme procedure på den venstre hjernehalvdel til at fjerne venstre hippocampus.
- Ved hjælp af en mikro spatel forsigtigt overføre hippocampi til vævshakker fase. Arrangere dem tilstødende og parallelt med hinanden og vinkelret på aksen af hakkekniven. Brug en pensel til at placere væv og tilføje et par dråber af dissekere løsning oven på hippocampi.
- Skær vævet i 400 um skiver uden at holde pause for at fjerne enkelte skiver (normalt vil de ikke holde sig til bladet). Efter hele hippocampus er blevet skåret, skal du bruge pensel til forsigtigt overføre afsnittene til en 2. lille petriskål med dissektion løsning.
- Under annonceissecting mikroskop, omhyggeligt adskille flydende skiver ved hjælp amicro-spatel og pensel.
- Fjern forberedte kultur plade med kultur insert fra inkubatoren og sted i en laminar strømning hætte.
- Ved hjælp af en brand-poleret Pasteur pipette trække 4-5 skiver ind i pipetten og overføre skiver til den apikale overflade af kultur insert membran. Dernæst justere placeringen med en pensel og giver plads mellem de enkelte sektioner og grænsen til kulturen indsatsen.
- Ved hjælp af en steril Pasteur-pipette, fjerne den overskydende dissekere løsning fra apikale overflade membran.
BEMÆRK: Når du fjerner løsning undgå at trække vævssnit i pipetten. Alternativt kan du bruge en almindelig pipette (P200 eller P1000) med steriliseret pipettespidser til langsomt fjerne løsning. - Placer agarplade med serumholdigt kulturmedium og hippocampale skiver tilbage i inkubatoren ved 35 ° C og 5% CO2.
BEMÆRK: Hvis eksperimentet opkaldtil generering af kulturer fra flere dyr, grundigt rense laminar strømning ren bænk mellem dissektioner. Retur instrumenter til alkohol-opløsning og erstatte alle petriskåle, filter papirer og sterile barberblade før anden dissektion.
4. fodring og bevarelse af organotypisk Slices
- Feed kulturer i en steril laminar strømning ren bænk.
- Udfør den første fodring af de dyrkede afsnit 2 dage efter dissektion. Aspirer gamle kultur medium ved anvendelse af steriliseret glaspipette.
- Brug sterile 5 ml serologisk pipette for at tilføje 1 ml frisk, steril, serum-holdigt medium til brøndene.
- Forsigtigt erstatte kultur indsatsen og sørge for at fjerne eventuelle luftbobler, der kan have dannet under membranoverflade.
- Efter den første fodring, ændre medium hver anden dag.
5. Inkubering vævssnit med thymidinanaloger til Label Newborn neuroner
- For at studeremodning og integration af gyrus granulceller i hippocampus inkuberes de organotypiske skiver med en thymidin-analog, såsom bromdeoxyuridin (BrdU) eller Chlorodeoxyuridine (CldU). Her anvender vi CldU grund af dets højere opløselighed i saltvand.
- Efter 3DIV tilsættes 1 ml af 10 mg / ml CldU stamopløsning i saltvand til 1 ml dyrkningsmedium til en slutkoncentration på 10 ug / ml. Hvis der anvendes BrdU, korrigere koncentrationen for forskelle i molekylvægt. Tilføj medium med CldU til dyrkningsbrønde og inkuberes væv med CldU-holdigt medium i 2 timer ved 35 ° C.
- Efter 2 timer af inkubation ved 35 ° C, skal du fjerne CldU medium og erstatte med regelmæssig fodring medium for at genoptage normal fodring tidsplan (skitseret ovenfor).
6. vævsfiksering og opbevaring
- Etablere en tidsplan for anvendelse af behandlinger og fastsættelse af vævsprøver før start kultur eksperimenter (figur 2B). <li> ved en forudbestemt dag efter dissektion, forberede følgende i et laboratorium stinkskab: a 10-50 ml bægerglas indeholdende 4% paraformaldehyd (PFA) i phosphatbufret saltvand (PBS); en tom bæger for kasseret dyrkningsmedium; små tang; og en 1.000 ml pipette med engangsspidser.
- Fjern dyrkningsplade (r) fra rugekammeret og overførsel til et stinkskab. Vip de enkelte såvel plade skær med en pincet. Brug derefter en pipette til at fjerne dyrkningsmedium og overførsel til en afhændelse bæger. Vip dyrkningsplade i en vinkel til at sikre, at alle dyrkningsmediet fjernes.
- Afslut fjerne medium for en dyrkningsplade ad gangen. Når mediet er fjernet, tilsættes 1 ml 4% PFA til hver kultur godt og forsegler godt tallerken med parafilm. Gentag for så mange kultur plader som nødvendige og overføre plader til køleskab ved 4 ° C i 24 timer.
- Efter 24 timer forberede følgende i et stinkskab: 10-50 ml bægerglas indeholdende 0,1% natriumazid i PBS; en tombægerglas for kasseret PFA (følg sikkerhedsforanstaltninger, når de skiller giftige stoffer); små tang; og 1000 ml pipette med engangsspidser.
- Følg proceduren beskrevet i 6.4 til at tilføje PFA, men tilføjer 1 ml PBS med natriumazid i stedet. Når helt overført, sæl brønde til fremtidig brug ved indpakning kanter i parafilm og lagring i køleskab ved 4 ° C.
7. Skæring Væv for Immunohistokemi
- Udfør vævssektionering hjælp af en vibratome. Følgende række trin at maksimere udbyttet af brugbare vævssnit fra organotypiske kulturer.
BEMÆRK: Umiddelbart efter hippocampus dissektion og plettering af skiver, vævet har en tykkelse på ca. 400 um. Men efter 2-3 uger i rugekammeret vil vævssnit begynder at flade, hvilket resulterer i et sidste afsnit tykkelse på 150-300 um. - Forbered følgende afsnit dyrket væv: en # 11 skalpel BLade og håndtag, et glas petriskål indeholdende iskold PBS, en mikro-dissektion pincet, og en ren vibratome opskæring fase at montere væv.
- Brug en skalpel til omhyggeligt skåret langs omkredsen af den cirkulære insert membranen, således at det kan frigøres fra plastindsatsen huset. Efterlad rigelig plads mellem dyrkede skive og skalpel.
- Overfør fritliggende insert membran til en petriskål indeholdende PBS. Efter skylning i PBS pincet til at overføre membranen til vibratome montering fase.
- Brug dernæst skalpel til at fjerne overskydende membran, der omgiver dyrkede skiver og skære væk overskydende materiale til at skabe rene kanter. Dette trin sikrer, at membranen er flad og kan let klæbe til skærefladen.
- Placer 1-2 dråber af klæbemiddel på vibratome skæretrinnet og spredes i jævnt lag under anvendelse af en 22 G nål. Spred klæbemiddel i en rektangulær form med den lange kant parallelt med skærekniven af vibratome. Udfør dette trinhurtigt, for at forhindre at klæbemidlet tørring.
- Brug pincet til at overføre den trimmede membran indeholdende hippocampusskiver til skæretrinnet og forsigtigt placere membran på lim og sikre, at der ikke er nogen luftbobler.
- Som superlim tørrer, overføre vibratome scenen med den limede membran tilbage til PBS indeholdende petriskål. Forbered vibratome bladet og en 48-brønds plade indeholdende natriumazid at gemme vævssnit.
- Brug vibratome at generere 30 um sektioner af organotypisk skive væv og overføres til en plade med 48 brønde indeholdende natriumazid til opbevaring og efterfølgende immunohistokemisk farvning.
- Se allerede eksisterende protokoller for immunhistokemisk farvning 26,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1) at skiver opretholde karakteristiske morfologiske træk hippocampusskiver efter 10-21 dage in vitro (DIV), og 2) at nyfødte DGCs kan kvantificeres: at de opfylder to hovedkriterier Bestemmelse om organotypiske kulturer ville være egnet til voksne neurogenese forskning kræves anvendelse af standard immunhistokemiske teknikker almindeligvis anvendes i voksen neurogenese forskning. Hvad angår det første kriterium, figur 1A og 1B fremhæve bevarede hippocampus morfologi. Karakteristiske funktioner såsom gyrus dentatus (GD), CA1 og CA3 regioner er lette at identificere.
Hvad angår det andet kriterium, figur 1C (øverste panel) giver et repræsentativt udsnit af nyfødte DGCs co-udtrykker det endogene neuronal markør, Doublecortin (DCX) i grøn og den eksogene thymidinanalogen, 5-chlor-2'-deoxyuridin (CldU) i rød. Disse neuroner er placeret i sub-GRanular zone i hippocampus GD. For at sikre korrekt fødsel datering af neuroner, vi identificerer CldU + kerner, der co-express DCX. Konfokal mikroskopi er nødvendig på dette trin til at identificere dobbelt-mærkede neuroner, fordi kandidat celler skal co-udtrykker markør af interesse i hele Z-aksen af cellen. Sample data opnås med en sådan dobbelt-mærkning udbytte ca. 17% af CldU + -celler, som udtrykte DCX og 35% af CldU + -celler, som udtrykte BBLP på 12 dage efter CldU ansøgning. Den DCX værdi er meget ens mens BBLP værdi er betydeligt lavere end tilsvarende tal opnået in vivo 26. Vævskulturbetingelser Standard kan være ansvarlig for en forholdsvis lav procentdel af de BBLP + celler.
Figur 2A viser dissektion trin, fortsætte fra venstre til højre (1-8): startende med halshugning af dyr (1), fjernelse af hjernen (2) overførsel af hjernen til iskold dissektion opløsning (3), dissekereion af hippocampus fra venstre og højre halvkugle (4), lagring af dissekeret hippocampi i iskold dissektion opløsning (5), overførsel af begge hippocampi til Stoelting vævshakker og sektionering ved 400 um (6), adskillelse af de enkelte skiver under dissektionsmikroskop (7), og udpladning væv på cellekultur indsatse (8). Gå frem på denne måde bidrager til at opretholde et sterilt miljø i hele kulturen processen.
Endelig da tidsforløbet for udvikling er en vigtig del af hippocampus neurogenese, valgte vi at inkubere de dyrkede skiver med CldU for præcis 2 timer efter 3 DIV til etiket dividere neurale stamceller. Den snævre tidsvindue for CldU administration blev valgt for at forbedre sandsynligheden for, at mærkede neuroner udgjorde en homogen population af celler på omtrent samme maturational trin (figur 2). Med hensyn til CldU mærkning, en kritisk funktion i neurogenese for hippocampus funktion er, at på et giVen gang der er en heterogen population af gyrus granulceller på forskellige modningsbegivenheder stadier 27,28.
Figur 1. Sample fluorescensmikroskop fotografier Fremhævelse bevaret hippocampus morfologi. (A) organotypiske skive fra 12 dage efter dissektion immunolabeled for CldU (grøn) og BBLP (rød), 20x komposit luft billede (Scale bar = 500 um). (B) Sample mikrograf af skive fra 21 dage efter dissektion immunolabeled for CldU ( rød) og DCX (grøn) (modsatte farve-ordningen i figur 1A), 20x luft (Scale bar = 100 um). (C) Overpanel. Repræsentant konfokalt mikroskop fotografi af celler co-udtrykkende ClXdU og endogene umodne neuronal markering, DCX. DGCs co-udtrykkende DCX (grøn) og CldU (rød) tælles som nyfødte neuroner. Pil angiver en dobbelt-Labeførte celle på tidligt udviklingstrin, 40X olie-nedsænkning (Scale bar = 10 um). Sammenlignelige celler er blevet observeret 10 døgn efter mærkning in vivo 26. Lavere panel. Repræsentative fluorescerende billeder af celler co-udtrykkende CldU (grøn) og BBLP (rød). Pil angiver en dobbelt-mærket celle, 40X fluorescerende micrograph (Scale bar = 10 um). DG-gyrus dentatus. GCL-granulat cellelag. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. (A) Illustration af de sekventielle trin til hippocampus dissektion i laminar strømning ren bænk. Stiplet linje angiver "usterile" (venstre) og "sterile" (højre) zoner i dissektion området. (B) Tidsfrist for organotypic skivekulturer fremstillet fra P7 rotteunger (Start). Notation angiver anvendelse af thymidinanalog, CldU *, og "behandling", som kan omfatte forskellige farmakologiske midler, der er tilpasset den eksperimentelle spørgsmål. Kulturer er fastgjort med paraformaldehyd ved ønskede opholdstider fra CldU ansøgning (Fix kulturer). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Navn på reagens / udstyr | Firma | Catalog Number | Kommentarer / Beskrivelse |
| 5-chlor-2'-deoxyuridin (CldU) | MP Biomedicals | 105.478 | Farligt, Kræftfremkaldende |
| Cellekultur indsætter, 30 mm i diameter, 0,4 um pmalm størrelse | Thermo Scientific | 140.660 | Nuclon delta belægning på disse skær giver bedre vævsadhæsion og forbedrer skive kvalitet. |
| Konisk centrifugerør (sterilt) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissektoren saks (vinklet til side) | Fin Science Tools | 14082-09 | |
| Minimalt essentielt medium (MEM) | Gibco | 11095; væske | Opbevares ved 4 ° C |
| Eclipse Ni-U fluorescensmikroskop | Nikon | ||
| Lim til væv | Krazy Lim | KG585 | Brug minimum af lim for at opnå vedhæftning som enhver væv udsat for lim vil være ubrugelig for IHC. |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Opbevares ved 4 ° C |
| Horse Serum varmeinaktiveret (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Lav 50 ml portioner og opbevares ved -20 ° C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modificerede glas pipetter (nederst i Pasteur pipette fjernet og kant udglattet med bunsenbraender) | |||
| Petriskålen (100 mm x 15 mm) og (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 og FB0875713A | |
| Skalpelblade # 11 | Fin Science Tools | 10011-00 | |
| Skalpel håndtag # 3 | Fin Science Tools | 10003-12 | |
| Serologiske pipetter | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standardmønster pincet | Fin Science Tools | 11000-12 | |
| Sterilt vakuumfilter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Operationssaks | Fin Science Tools | 14054-13 | |
| Sprøjte drevet filterenhed | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Vævshakker med bevægelige trin | Stoelting | 51.425 | |
| Fin spids pensel |
Tabel 1. Forbrugsvarer og reagenser
| Opløsning | Ingredienser og instruktioner |
| Dissektion løsning | a) 500 ml af Hank &# 39; s Balanced Salt Solution (HBSS) (Gibco-14025-092). |
| b) Tilsæt 2,2 g D-glucose. | |
| c) Tilsæt 0,5 g saccharose. | |
| d) Tilføj 1,787 g HEPES. | |
| e) Bland i 30 minutter med magnetomrører. | |
| f) Anvendelse pH-meter for at sikre opløsning har en endelig pH = 7,4. | |
| g) Brug osmometer at sikre den endelige osmolalitet = 320-330 mOsm. | |
| h) steriliseres opløsning i steril laminar flow hætte ved hjælp af vakuumfiltrering gennem 0,2 um filter. | |
| Serumholdigt kulturmedium: 100 ml Minimum Essential Medium (MEM) (Gibco 11095), 50 ml Horse serum (Gibco 16050-122), 50 ml HBSS. | a) Der tilføjes følgende til 50 ml HBSS i bæger og opløses i 37 ° C vandbad. Bland med magnetomrører. |
| b) 1,3 g D-glucose. | |
| c) 36 mg MgSO4. | |
| d) 17,6 mg ascorbinsyre. | |
| e) 5 pi 2M CaCl2 stamopløsning. | |
| f) Der tilsættes 50 pi Antibiotika-antimykotisk (100x bestand, steril, Gibco 15140-062). | |
| g) 1 pg / ml insulin. | |
| h) steriliseres ovenstående opløsning ved filtrering gennem et 0,2 um filter. | |
| i) Mix filtrerede opløsning med 100 ml MEM og 50 ml Horse serum i laminær strømning. | |
| j) Lav 50 ml portioner i sterile koniske centrifugerør (Fisher Scientific-14-432-22) og opbevares ved 4 ° C. | |
| 4% paraformaldehyd fikseringsopløsning. | a) Forbered phosphatbufret saltvand (PBS) ved at tilføje følgende til 300 ml destilleret H2O og blanding på magnetomrører. |
| b) Tilsæt 2,7 g monobasisk natriumphosphat (NaH 2 PO 4). | |
| c) Tilsæt 11,5 g natrium Phosphate dibasisk (NaHPO 4). | |
| d) Tilsæt 9,0 g natriumchlorid (NaCl). | |
| e) opvarmes ca.. 700 ml destilleret H2O til 55 ° C og slukke varmen. | |
| f) Tilsæt 40 g paraformaldehyd (PFA) og omrøres i 700 ml vand ved hjælp af magnetisk omrøringsplade. | |
| g) Kombiner PBS (a, b, c, d) og PFA (e, f) løsninger, justere pH til 7,4 og top op til slutvolumen på 1.000 ml. | |
| 0,1% natriumazid Solution | a) Tilføj 1 g pulveriseret natriumazid (NaN3) til 1 L af PBS-opløsning. |
| b) Bland med en magnetisk omrøringsplade og opbevares ved 4 ° C. |
Tabel 2. Løsninger og opskrifter
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efter CldU (eller BrdU) administration, kan tidslinjen for anvendelse af farmakologiske midler vælges til at målrette nyfødte DGCs i bestemte udviklingsmæssige vinduer. For eksempel kan en hypotetisk middel påføres i den anden uge efter CldU injektion, der foreslås at falde sammen med en alder af umodne neuroner, der er på et udviklingstrin, hvor GABA depolariserende. Fremtidige undersøgelser med anvendelse af denne protokol kan tilpasse det farmakologiske middel og vinduet for eksponering for "skræddersyet" tilgang til det konkrete eksperimentelle spørgsmål af interesse.
Et vigtigt kriterium for at fastslå, at skive kulturer er en gyldig model for postnatal neurogenese forskning er evnen til at plette og kvantificere nyfødte neuroner i hippocampus. De to vigtigste resultater til støtte for denne hypotese var, at mikroskopisk analyse afslørede immunhistokemisk reaktivitet for CldU og endogene protein markører i de samme neuroner.Ved anvendelse i kombination med endogene neuronale markører, thymidin analoger, såsom BrdU og CldU er stærke værktøjer til neurogenese forskning.
Anvendelsen af thymidin-analoger, såsom BrdU via intraperitoneale injektioner er almindeligt anvendt i neurogenese forskning label neuroner undergår S-fasen af mitosen 29. Lignende metoder kan anvendes i organotypiske kulturer med visse modifikationer. For eksempel tidligere undersøgelser administreret BrdU (0,5 uM i 3 dage) for at skære kulturer efter ~ 14 DIV 18. Gennemgang data i at papir viser, at nogle af de målinger, der anvendes til at kvantificere neurogenese ikke anvender standard teknikker, der anvendes i neurogenese område, dvs Stereologisk kvantificering 30. For eksempel, når rapportering af co-ekspression af BrdU og Neuronal-kerner (NeuN) positive celler, de angiver et samlet antal celler "per kultur" i stedet for at give informereation om vævsareal eller volumen.
Efterfølgende undersøgelser forbedret på denne metode ved at inddele de dyrkede skiver til individuelle 10 um sektioner, som forbedrede visualisering og immunhistokemi protokoller ved at tillade antistoffer mod lettere gennemtrænge vævsprøverne 31. Bunk et al. 28 rapporterede dobbelt mærkning med BrdU (10 uM i 3 dage) som antallet af co-mærkede celler pr 10 um sektion, men har ikke givet oplysninger om den sammenlignende område eller specifikke hippocampus region studerede dvs. CA1, CA3 eller GD. Derudover har analysen af konfokale og fluorescens mikroskopi billeder ikke overbevisende viser, at hippocampus morfologi held blev opretholdt.
Vigtigere er det, begge undersøgelser anvendes en BrdU eksponering periode på 3 dage, som er tilknyttet ulemper. BrdU mærkning har i høj grad hjulpet neurogenese undersøgelser ved at tillade efterforskere til at spore nyligt opdelte celler i various hjerneregioner. Imidlertid BrdU toksicitet er også blevet godt karakteriseret. Har vist, at anvendelsen forårsage morfologiske og adfærdsmæssige abnormiteter 32,33 og negative virkninger på cellecyklus, differentiering, migration og overlevelse af neurale stamceller 34-36. Den forlængede administration af BrdU i de tidligere nævnte undersøgelser kan have indført forstyrrende variable, ændrede hippocampus fysiologi og mens nogle bivirkninger fra BrdU administration kan være uundgåelig, vores forsøgsprotokol til formål at begrænse nogle af disse komplikationer ved at inkubere vævet med thymidin analoger til 2 timer. Derudover valgte vi at bruge CldU stedet for BrdU fordi det viste bedre opløselighed end BrdU ved udarbejdelsen af inkubere løsning. Selvom 3 dag-protokollen kan være nyttige for visse eksperimentelle designs f.eks maksimere mærkning af prolifererende celler, dette 2 hr protokol har en fordel af puls-mærkning af et relativt lille popuning af celler, som kan studeres ved ønskede overlevelsestid (se figur 2B).
Ved at sammenligne niveauet for neuronal produktion efter to forskellige metoder til BrdU ansøgning, ydet et vigtigt bidrag til mærkningsteknikker i organotypiske skive kulturer 37 Namba et al.. Forfatterne sammenlignet intraperitoneal (IP) injektion af BrdU (50 mg / kg) i postnatal dag 5 (P5) rotter med in vitro-kulturer, der modtog dyrkningsmedium indeholdende 1 uM BrdU i 30 minutter umiddelbart efter eksplantation af væv. De rapporterer ingen statistisk signifikant forskel mellem in vivo og tidligt vitro BrdU injektion i dyrkede væv. Forfatterne har ikke præsentere klare billeder skitserer hippocampus struktur, men de rapporterer BrdU immunoreaktivitet i procent af de samlede celler i granulatet cellelag. Mens de ansætter Stereologisk optælling, ville give en foranstaltning efter område eller volumen være værdifuldt. Generelt, De citerede undersøgelser tilstedeværende organotypiske kulturer som en grundig detaljering af postnatale hippocampus skivekulturer, med ansøgninger om studiet af neurogenese og farmakologiske forstyrrelser. Ved hjælp af denne teknik kan hippocampusskiver opretholdes i op til 21 dage in vitro (DIV) og stoffer kan tilsættes til mediet på ethvert punkt i dyrkningsperioden for at studere virkningen på neurogenese.
Vores mål var at mærke et diskret, relativt homogen population af DGCs ved at give en kort 'puls' anvendelse af CldU i 2 timer. En almindeligt anvendt strategi for at studere neurogenese involverer identifikation af en neuron s maturational fase via immunhistokemisk farvning for forskellige endogene markører med en thymidin-analog. Konfokal og fluorescensmikroskopi bekræftede tilstedeværelsen af kerner, der er indarbejdet thymidinanalogen CldU og blev derfor aktivt undergår mitose under dyrkningsperioden. Figur 2 in vivo væv analyse kan tilpasses til slice kulturer.
Specifikt, en almindeligt anvendt metode neurogenese forskning er at udføre immunhistokemisk farvning for mikrotubulus-associeret protein, DCX, der overvejende udtrykkes i umodne neuroner fra dag 3-21 og den modne neuronal markering, calbindin (BBLP), som er fuldt udtrykt efter 28 dage efter mitose. Fænotypen af CldU + celler blev bestemt ved hjælp af disse endogene markører 26.
Forbedrede metoder til opretholdelse af skivekulturer for længere perioder, kan have den yderligere fordel at tillade flere CldU + neuroner til at nå den modne, BBLP + fase. På nuværende tidspunkt en begrænsning af organotypisk kultur tilgang er, at vævet konstant forandring i dyrkningsperioden. For eksempel umiddelbart efter hippocampus dissektion og plettering af skiver, TIssue har en bredde på ca. 400 um. Men efter 2-3 uger i rugekammeret vil vævssnit begynde at tynde, hvilket resulterer i en endelig bredde mellem 250-350 um. Dette begrænser mængden af væv, der kan bruges til immunhistokemi og bør overvejes, når de planlægger, hvor mange dyr der skal bruges til et projekt. Yderligere forsøg vil hjælpe karakterisere de funktionelle ændringer i hippocampus fysiologi, der forekommer in vitro.
Protokollen for sektionering og farvning hippocampusskiver blev udviklet til at analysere cellulære og morfologiske ændringer, der finder sted i løbet af dyrkningsperioden. Skivekulturer giver mulighed for at afprøve effekten af forskellige farmakologiske midler som hippocampus DGCs passerer gennem forskellige udviklingsstadier under modning og udgør et værdifuldt værktøj for fremtidige voksne neurogenese studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Opitz-Araya, X., Barria, A.
- Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
- Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
- Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
- Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
- Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
- Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
- Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
- Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
- Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271 (2012).
- Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
- Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
- Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H.
- Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
- Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
- Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
- Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
- Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409 (2006).
- McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
- Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
- Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
- Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
- Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
- Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
- Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
- Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).
