Summary
Her beskriver vi en teknikk for å studere hippocampus postnatal neurogenesis bruker organotypic skive kultur teknikk. Denne metoden gjør det mulig for in vitro-manipuleringen av voksen nevrogenesen og tillater direkte anvendelse av farmakologiske midler til den kultiverte hippocampus.
Abstract
Her beskriver vi en teknikk for å studere hippocampus postnatal neurogenesis i gnager hjernen bruker organotypic skive kultur teknikk. Denne metoden opprettholder den karakteristiske topografiske morfologi av hippocampus, samtidig som direkte anvendelse av farmakologiske midler til utviklings hippocampus dentate gyrus. I tillegg kan skive kulturer opprettholdes i opp til 4 uker, og således tillate en å studere modningsprosess av nyfødte granule neuroner. Skive kulturer tillate effektiv farmakologisk manipulering av hippokampale skiver under utelukkelse av komplekse variable slik som usikkerheter relatert til den dype anatomiske plassering av hippocampus, så vel som blod-hjerne-barrieren. For disse grunner, forsøkte vi å optimalisere organotypic skive kulturer spesielt for postnatal neurogenesis forskning.
Protocol
MERK: Alle dyr prosedyrer dannet til dyrehelse og dyrevelferd retningslinjer ved Institutt for komparativ medisin ved Universitetet i Toronto.
1. Utarbeidelse av Hippokampale Slices
- Sterilisere følgende instrumenter ved hjelp av tørr autoklav ved 125 ° C: Scalpel håndtaket (# 3) (2), standardmønster tang, store (1), Small dissector sakse (vinklet til side) (1), Micro skje (skje og flat slikkepott endene) (1), Micro-spatler (avrundede og avrundede koniske ender) (2), Fine pensel (1), polert Brann Pasteur pipette (2), Gasbind firkanter, 2 x 2 inches (5).
- Når steril, sette instrumentene i en steril beholder og holde dekket inntil bruk. Umiddelbart før disseksjon, fordype instrumenter i en 70% etanol løsning.
- Forberede en 6-brønn kultur plate med kultur vedlegget før du begynner disseksjon prosedyren ved å tilsette 1 ml av kultur medium / godt og lagring av platen i inkubator ved 35 ° C ennd 5% CO 2.
2. Ordne Disseksjonskurs Tools i Sterile Laminar Flow hette
- Spray laminær hette med 70% etanol og fjerne steriliserte disseksjon instrumenter fra alkohol. Tillat instrumenter tørke mens de hviler på en steril petriskål for å unngå kontakt mellom alkohol og dissekert hjernevevet.
- Innskudd 5-7 ml sterilisert iskald dissekere løsning i to store sterile petriskåler. En tallerken vil slappe av og rense hodet (dirty), den andre for kjøling og skylle den øses ut hjernen (ren). Plasser en sterilisert filterpapir i en av petriskålen lokk for å dissekere ut hjernen.
- Plassere en liten, sterilisert filterpapir i en av de små petriskål lokk til å dissekere ut hippocampus. Innskudd 3-5 ml sterilisert iskald dissekere løsning i to små, sterile petriskåler. En tallerken vil holde øses ut hippocampus, en vil holde seksjonene under separasjon av hippocampus seksjoneretter disseksjon mikroskop.
- Forberede vev chopper av taping et stykke sterilisert filter papir til skjære scenen og montere en steril barberblad. Fukt filterpapiret med sterilisert dissekere løsning.
- Spray en ren bio-pose med alkohol og plasser den i laminærstrømning ren benk.
3. hippocampus Dissection
- Spray P7 Sprague Dawley rotteunge med 70% etanol utsiden av laminær strømning ren benk og raskt decapitate dyret ved hjelp av store sterile kirurgiske sakser inne i laminær strømning benken. La hodet slippe inn i iskald dissekere oppløsning i en av petriskåler.
- I petriskålen, skyll av blod og raskt overføre hodet til sterilisert filterpapir, ventrale side ned.
- Ved hjelp av skalpell, kutt langs ryggflate i sagittalplanet avsløre underliggende skallen. Skjære gjennom huden, men ikke den underliggende ben, som er myk og lett gjennomtrengelig i rotter av thans alder. Avsette denne "skitne" skalpell og ikke bruke på hjernevev.
- Ved hjelp av de små Dissector saks (vinklet til side) og tang, kutte åpne skallen langs sagittal sutur av skallen til bregma, den anatomiske punkt på hodeskallen, hvor den koronale sutur krysses vinkelrett ved sagittal sutur. Bruk tang for å trekke skull klaffene opp og vekk fra midtlinjen av skallen.
- Plasser mikro skje på undersiden av hjernen, under hjernestammen, å forsiktig løftes hjernen ut av skallen. Løft hjernen til å eksponere de optiske nervene og luktelappen på basal overflaten av hjernen. Skjær disse strukturene med liten saks til fullt koble hjernen fra skallen. Fjerne og overføre den intakte hjerne til den andre store petriskål inneholdende iskald dissekere løsning.
- Med micro skje, overføre hjernen til en liten petriskål lokk som inneholder sterilt filter papir. Med en steril Pasteur pipette, skyll hjernen med noen dråper dissecting løsning for å holde vevet fuktig.
- Ved hjelp av en "ren" skalpell blad kutte de to halvkulene fra hverandre. Overføre den venstre hjernehalvdelen tilbake til stort petriskål med mikro skje og legg halvkule pia siden ned i iskaldt dissekere løsning for senere bruk.
- Vis den mediale ansiktet av den høyre hjernehalvdelen og identifisere kanten fornix, en fremtredende band av hvit substans langs mediale kanten av hippocampus. Ved hjelp av en steril skalpell, lage en sagittal kutt gjennom fornix, men ta vare fordi bare 0,5 cm av skalpell spissen vil være tilstrekkelig til å kutte fornix.
- Ved hjelp av to mikro spatler, fjerne den første hippocampus fra høyre hjernehalvdelen ved å plassere den høyre-spatel på hjernestammen og løfte overliggende cortex med venstre slikkepott. Løft forsiktig cortex for å avdekke den laterale ventrikkel og mediale overflate av hippocampus. En hvit buet linje, fimbria, skal nå være synlig.
- Justere krumningen av slikkepott med curvature av fimbria og trykk forsiktig spatelen under fimbria. Skyv sparkel venstre og sykle langs rostrokaudale aksen og løft spatel i rygg retning for å fjerne hippocampus.
- Overfør hippocampus til en 2 nd liten petriskål med iskald dissekere løsning. Gjenta samme prosedyre på den venstre hjernehalvdelen for å fjerne venstre hippocampus.
- Ved hjelp av en mikro spatel, nøye overføre hippocampi til vevet chopper trinnet. Ordne dem tilstøtende og parallelle med hverandre og vinkelrett på aksen til kutteren bladet. Bruk en pensel til å posisjonere vev og tilsett noen dråper av dissekere løsning på toppen av hippocampi.
- Skjær vevet i 400 mikrometer skiver uten pause for å fjerne enkelt skiver (vanligvis vil de ikke følge bladet). Etter hele hippocampus har blitt kuttet, bruker pensel til å forsiktig overføre deler til en 2 nd liten petriskål med disseksjon løsning.
- Under annonseissecting mikroskop, nøye skille de flytende skiver som bruker amicro-spatel og pensel.
- Ta av pre-forberedt kultur plate med kultur innsats fra inkubatoren og plasser i en laminær hette.
- Ved hjelp av en brann-polert Pasteur pipette, tegne 4-5 skiver inn i pipetten og overføre skiver til den apikale overflaten av kulturinnsats membran. Deretter justere plasseringen med en pensel og la det være plass mellom individuelle seksjoner og grensen av innsatsen kultur.
- Ved hjelp av en steril Pasteur pipette, fjerne overflødig dissekere løsning fra apikale overflaten av membranen.
MERK: Når du tar løsning unngå å trekke vevssnitt inn i pipetten. Alternativt kan du bruke en vanlig pipette (P200 eller P1000) med steriliserte pipettespisser å sakte fjerne løsning. - Plasser kulturplate med serumholdig dyrkningsmedium, og de hippokampale skiver tilbake i inkubatoren ved 35 ° C og 5% CO2.
MERK: Hvis eksperimentet samtalerfor generering av kulturer fra flere dyr, rengjør laminærstrømning ren benk mellom disseksjoner. Tilbake instrumenter til alkohol løsning og erstatte alle petriskåler, filterpapir og sterile barberblader før andre disseksjon.
4. Fôring og Vedlikehold organotypiske Slices
- Strøm kulturer i en steril laminær strømning ren benk.
- Utføre den første foring av dyrkede seksjoner 2 dager etter disseksjon. Aspirer gamle kulturen medium med sterilisert glass pipette.
- Bruke sterile 5 ml serologisk pipette for å legge til en ml friskt, sterilt, serumholdig medium til brønnene.
- Forsiktig Innsetting kultur og ta vare å fjerne eventuelle luftbobler som kan ha blitt dannet under membranoverflaten.
- Etter den første fôring, endre medium annenhver dag.
5. rugende vevssnitt med tymidinanaloger i etikett Newborn Nevroner
- For å studeremodningen og integrering av dentate granule celler i hippocampus, inkuber organotypiske skiver med en tymidin-analog, så som bromdeoksyuridin (BrdU) eller Chlorodeoxyuridine (CldU). Her anvendes CldU på grunn av dets høyere oppløselighet i saltoppløsning.
- Etter 3DIV, tilsett 1 pl av 10 mg / ml stamløsning i CldU saltvann til 1 ml kulturmedium til en sluttkonsentrasjon på 10 ug / ml. Hvis BrdU brukes, korrigere konsentrasjonen for forskjeller i molekylvekt. Legg medium med CldU til dyrkningsbrønner og inkuberes vevet med CldU-holdig medium i 2 timer ved 35 ° C.
- Etter to timers inkubasjon ved 35 ° C, fjerner CldU holdig medium og erstatte med regelmessig fôring medium for å gjenoppta normal fôring tidsplan (beskrevet ovenfor).
6. Tissue Fiksering og lagring
- Etablere en tidslinje for å bruke behandlinger og fikse vevsprøver før eksperimenter kultur (figur 2B). <li> Ved en forutbestemt dag etter disseksjon, fremstilles følgende i et laboratorium avtrekksskap: en 10 til 50 ml begerglass inneholdende 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbufret saltvann (PBS); et tomt beger for kasserte kultur medium; små tang; og en 1000 ml pipette med engangsspisser.
- Ta av kultur plate (r) fra inkubasjon kammer og overføring til en avtrekkshette. Vippe de enkelte brønnplateinnsatser med tang. Deretter bruker du en pipette for å fjerne kulturmedium og overføring til en disposisjon beger. Vipp kultur plate i en vinkel for å sikre at all kultur medium er fjernet.
- Ferdig med å fjerne medium for en kultur plate om gangen. Når medium har blitt fjernet, tilsett 1 ml 4% PFA til hver kultur godt og forsegle brønnen plate med Parafilm. Gjenta for så mange kulturplater som er nødvendige og overføre platene til kjøleskap ved 4 ° C i 24 timer.
- Etter 24 timer forberede følgende i en avtrekkshette: 10-50 ml beger inneholder 0,1% natriumazid i PBS; en tomBeaker for utrangert PFA (følge sikkerhetsregler når du skal kaste giftige stoffer); små tang; og 1000 ml pipette med engangsspisser.
- Følg prosedyren beskrevet i 6.4 for tilsetning av PFA, men legger til 1 ml PBS med natriumazid i stedet. Når fullstendig overført, tetning brønners plater for fremtidig bruk ved innpakning kanter i parafilm og lagring i kjøleskap ved 4 ° C.
7. Seksjonering Tissue for Immunohistokjemi
- Utføre vev seksjonering ved hjelp av en vibratome. Den følgende serie av trinn å maksimere utbyttet av brukbare vevssnitt fra organotypiske kulturer.
MERK: Umiddelbart etter hippocampus disseksjon og plettering av skiver, har vevet en tykkelse på omtrent 400 pm. Imidlertid, etter 2-3 uker i inkubasjonen kammeret, vil vevssnitt begynne å flate, noe som resulterer i en endelig seksjon tykkelse på 150-300 mikrometer. - Forbered følgende elementer § kultivert vev: en # 11 skalpell bLade og håndtere, et glass petriskål med iskald PBS, en mikro-disseksjon tang, og en ren vibratome cutting scenen for å montere vev.
- Bruke en skalpell til å nøye kutt langs omkretsen av den sirkulære innsats membranen slik at den kan løsnes fra plastinnsatshuset. Forlate rikelig plass mellom den kultiverte skive og skalpell.
- Overfør den frittliggende innsats membranen til en petriskål inneholdende PBS. Etter skylling i PBS ved å bruke tenger til å overføre membranen til vibratome monteringstrinn.
- Deretter bruker skalpell for å fjerne overflødig membran som omgir dyrkede skiver og skjær vekk overflødig materiale til å lage rene kanter. Dette trinnet vil sikre at membranen er plan og kan lett holder seg til skjæreflate.
- Plassere 1-2 dråper lim på vibratome cutting scenen og spre seg i jevnt lag ved hjelp av en 22 G nål. Spre lim inn i en rektangulær form med langsiden parallelt med skjæreblad av vibratome. Utføre dette trinnetraskt, for å hindre at klebemidlet tørker.
- Bruk pinsett til å overføre den trimmede membran som inneholder hippocampus skiver til skjære scenen og forsiktig plassere membran på lim og sikre at det ikke er luftbobler.
- Som superlim tørker, overføre vibratome scenen med den limte membran tilbake til PBS som inneholder petriskål. Klargjør vibratome blad og en 48 brønners plate som inneholder natriumazid å lagre vevssnitt.
- Bruk vibratome å generere 30 pm seksjoner av organotypiske stykke vev og overføring til en 48-brønners plate inneholdende natriumazid for lagring og påfølgende immunhistokjemisk farging.
- Refererer til pre-eksisterende protokoller for immunhistokjemisk farging 26,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avgjøre om organotypiske kulturer ville være egnet for voksen neurogenesis forskning er nødvendig at de tilfredsstiller to hovedkriterier: 1) at skiver opprettholde karakteristiske morfologiske funksjoner i hippocampus skiver etter 10-21 dager in vitro (DIV), og 2) at nyfødte DGCs kan kvantifiseres ved bruk av standard immunhistokjemiske teknikker som vanligvis anvendes i voksen nevrogenesen forskning. Når det gjelder det første kriteriet, figur 1A og 1B markere bevart hippocampus morfologi. Karakteristiske trekk som dentate gyrus (DG), CA1, og CA3 regioner er lett identifiserbare.
Figur 1C (øvre panel) om andre kriteriet, gir et representativt utvalg av nyfødte DGCs samuttrykker den endogene nevronale markør, Doublecortin (DCX) i grønt og eksogene tymidinanalogen, 5-klor-2'-deoksyuridin (CldU) i rødt. Disse neuroner er plassert i under grringformet sone av hippocampus DG. For å sikre korrekt fødsel datering av nevroner, identifiserer vi CldU + atomkjerner som co-express DCX. Konfokalmikroskopi er nødvendig på dette stadiet å kunne identifisere dobbel-merket nevroner fordi kandidat celler må samtidig uttrykke markør av interesse i hele Z-aksen av cellen. Prøvedata oppnådd med en slik dobbeltmerking utbytte ca. 17% av CldU + celler som uttrykte DCX og 35% av CldU + celler som uttrykte CaBP på 12 dager etter CldU søknad. Den DCX verdi er svært lik mens CaBP verdien er betydelig lavere enn tilsvarende tall erholdt in vivo 26. Standard vevskulturbetingelser kan være ansvarlig for en relativt lav andel av CaBP + celler.
Figur 2A viser de disseksjon trinn som går fra venstre til høyre (1-8): starter med hodekapping av dyr (1), fjerning av hjernen (2), overføring av hjernen til iskald disseksjon oppløsning (3), dissekereion av hippocampus fra venstre og høyre hjernehalvdel (4), lagring av dissekert hippocampi i iskald disseksjon løsning (5), overføring av både hippocampi til Stoelting vev kjøttøks og seksjonering på 400 mikrometer (6), separasjon av enkeltsektorer i henhold dissekere mikroskop (7), og plette vev på celledyrkningsinnsatser (8). Ved å gå frem på denne måte bidrar til å opprettholde et sterilt miljø i hele dyrkningsprosessen.
Til slutt, siden den tid-løpet av utviklingen er en viktig funksjon i hippocampus neurogenesis, valgte vi å ruge de dyrkede skiver med CldU for nøyaktig 2 timer etter at 3 DIV til etiketten dele nevrale stamceller. Den tidsvinduet for å CldU administrering ble valgt for å forbedre sannsynligheten for at merkede nevroner utgjorde en homogen populasjon av celler i omtrent samme modningstrinn (figur 2). Med hensyn til CldU merking, er en kritisk funksjon i neurogenesis for hippocampus funksjon som på en GIven gang det er en heterogen populasjon av dentate granule celler på ulike modningsstadier 27,28.
Figur 1. Eksempel på fluorescens mikroskop fotografier utheving bevart hippocampus morfologi. (A) organotypic skive fra 12 dager etter disseksjon immunolabeled for CldU (grønn) og CaBP (rød), 20x luft sammensatt bilde (Scale bar = 500 mikrometer). (B) Prøvemikrograf av skive fra 21 dager etter disseksjon immunolabeled for CldU ( rød) og DCX (grønn) (motsatt farge-ordningen i figur 1A), 20x luft (Scale bar = 100 mikrometer). (C) Øvre panel. Representant konfokal mikroskop fotografi av celler co-uttrykke ClXdU og endogen umoden nevronale markør, DCX. DGCs samuttrykker DCX (grønn) og CldU (rød) regnes som nyfødte nerveceller. Pil viser en dobbel-labeledet celle på tidlig stadium i utviklingen, 40X olje-immersion (Scale bar = 10 mikrometer). Sammenlign celler har blitt observert 10 dager etter merking in vivo 26. Nedre panel. Representative fluorescerende bilder av celler samtidig uttrykker CldU (grønn) og CaBP (rød). Pil viser en dobbel-merket celle, 40X fluorescerende mikrograf (Scale bar = 10 mikrometer). DG-dentate gyrus. GCL-granulat celle laget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 (A) Illustrasjon av de sekvensmessige trinn for hippocampus disseksjon i laminær strømning ren benk. Stiplede linjen viser "gasbind" (til venstre) og "sterile" (høyre) soner av disseksjon området. (B) Tidslinje for organotypic skive kulturer fremstilt fra P7 rotteunger (start). Notasjoner tyder på bruk av tymidinanalogen, CldU *, og "behandling", som kan inkludere ulike farmakologiske stoffer som passer til den eksperimentelle spørsmålet. Kulturer er festet med paraformaldehyde ved ønskede holdetider fra CldU søknad (Fix kulturer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Navn av Reagens / Utstyr | Selskap | Catalog Number | Kommentarer / beskrivelse |
| 5-klor-2'-deoksyuridin (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Farlig, kreftfremkallende |
| Cellekultur inserts, 30 mm diameter, 0,4 mikrometer pmalm størrelse | Thermo vitenskapelig | 140660 | Nuclon delta belegg på disse inserts gir bedre vevsadhesjon og forbedrer skive kvalitet. |
| Konisk sentrifugerør (sterilt) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector saks (vinklet til side) | Fin Science Verktøy | 14082-09 | |
| Minimum essensielt medium (MEM) | Gibco | 11095; væske | Oppbevares ved 4 ° C |
| Eclipse Ni-U fluorescerende mikroskop | Nikon | ||
| Lim for vev | Krazy Glue | KG585 | Bruk minst mulig lim for å oppnå heft som helst vev utsettes for lim vil være ubrukelig for IHC. |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Oppbevares ved 4 ° C |
| Hesteserum varmeinaktivert (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Lage 50 ml prøver og butikk ved -20 ° C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modifiserte glass pipetter (bunn av Pasteur pipette fjernet og kanten glattet med bunsenbrenner) | |||
| Petri-skål (100 mm x 15 mm) og (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 og FB0875713A | |
| Skalpellblader # 11 | Fin Science Verktøy | 10011-00 | |
| Skalpell håndtak # 3 | Fin Science Verktøy | 10003-12 | |
| Serologiske pipetter | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standardmønster tang | Fin Science Verktøy | 11000-12 | |
| Sterilt vakuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Kirurgiske saks | Fin Science Verktøy | 14054-13 | |
| Sprøyte drevet filterenhet | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Vev chopper med bevegelig scene | Stoelting | 51425 | |
| Fin spiss pensel |
Tabell 1. Forsyninger og reagenser
| Oppløsning | Ingredienser og instruksjoner |
| Disseksjon løsning | a) 500 ml av Hank &# 39; s Balanced Salt Solution (HBSS) (Gibco-14025-092). |
| b) Tilsett 2,2 g D-glukose. | |
| c) Tilsett 0,5 g sukrose. | |
| d) Legg 1,787 g HEPES. | |
| e) Bland i 30 minutter med magnetisk røreplate. | |
| f) Anvendelse pH-meter for å sikre at løsningen har en endelig pH-verdi = 7,4. | |
| g) Bruk osmometer å sikre endelig osmolalitet = 320-330 mOsm. | |
| h) Steriliser løsning i sterile laminær hetten med vakuumfiltrering gjennom 0,2 mikrometer filter. | |
| Serumholdig dyrkningsmedium: 100 ml Minimum Essential Medium (MEM) (Gibco 11095), 50 ml hesteserum (Gibco 16050-122), 50 ml HBSS. | a) Tilsett etter 50 ml HBSS i begerglass og oppløst i 37 ° C vannbad. Bland med magnetrører. |
| b) 1.3 g D-glukose. | |
| c) 36 mg MgSO4. | |
| d) 17,6 mg askorbinsyre. | |
| e) 5 mL 2M CaCI2 stamløsning. | |
| f) Legg 50 mL Antibiotikasopp (100x lager, steril, Gibco 15140-062). | |
| g) 1 pg / ml insulin. | |
| h) Sterilovennevnte løsning ved filtrering gjennom et 0,2 um filter. | |
| i) Bland filtrerte løsning med 100 ml MEM og 50 ml hesteserum i laminær strømningshette. | |
| j) Lag 50 ml porsjoner i sterile koniske sentrifugerør (Fisher Scientific-14-432-22) og oppbevares ved 4 ° C. | |
| 4% Paraformaldehyde fiksativ løsning. | a) Tilbered fosfatbufret saltvann (PBS) ved tilsetning av følgende i 300 ml destillert H2O og blanding på magnetisk røreplate. |
| b) Tilsett 2,7 g monobasisk natriumfosfat (NaH 2PO 4). | |
| c) til 11,5 g natrium phosphate tobasisk (NaHPO 4). | |
| d) Tilsett 9,0 g natriumklorid (NaCl). | |
| e) Varm ca. 700 ml destillert H 2 O til 55 ° C og slå av varmen. | |
| f) Legg 40 g paraformaldehyde (PFA) og rør inn 700 ml vann ved hjelp av magnetisk oppsikt plate. | |
| g) Kombiner PBS (a, b, c, d) og PFA (e, f) løsninger, justere pH til 7,4 og topp opp til sluttvolum på 1000 ml. | |
| 0,1% natriumazid Løsning | a) til 1 g pulverisert natriumazid (NaN3) til 1 liter PBS-løsning. |
| b) Mix bruker magnetisk røreplate og oppbevares ved 4 ° C. |
Tabell 2. Solutions og oppskrifter
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Etter CldU (eller BrdU) administrasjon, kan velges tidslinjen for anvendelse av farmakologiske midler til å målrette nyfødte DGCs under spesielle utviklings vinduer. For eksempel kan en hypotetisk middel påføres under den andre uken etter CldU injeksjon, som er foreslått for å sammenfalle med en alder av umodne nerveceller som er på et utviklingsstadium der GABA er depolariserende. Fremtidige studier ved bruk av denne protokollen kan tilpasses det farmakologiske middel og vinduet for eksponering for "skreddersy" tilnærming til den spesifikke eksperimentelle spørsmål av interesse.
Et viktig kriterium for å bestemme at skive kulturer er en gyldig modell for postnatal neurogenesis forskning er evnen til å farge og kvantifisere nyfødte nerveceller i hippocampus. De to viktigste funnene i støtte for denne hypotesen var at mikroskopisk analyse avslørte immunohistokjemisk reaktivitet for CldU og endogene proteinmarkører i de samme nerveceller.Når den brukes i kombinasjon med endogene nevrale markører, tymidinanaloger som BrdU og CldU er kraftige verktøy for neurogenesis forskning.
Anvendelse av tymidin-analoger, slik som BrdU, via intraperitoneale injeksjoner blir vanligvis benyttet i nevrogenesen forskning for å etikett neuroner som gjennomgår S-fasen av mitose 29. Lignende metoder kan anvendes i organotypiske kulturer med visse modifikasjoner. For eksempel har tidligere studier administreres BrdU (0,5 mikrometer i 3 dager) for å skjære kulturer etter ~ 14 DIV 18. Gjennomgå data som presenteres i den avisen avslører at noen av de beregninger som brukes for å kvantifisere neurogenesis ikke ansette de vanlige teknikker som brukes i neurogenesis feltet, dvs. stereological kvantifisering 30. For eksempel ved rapportering co-uttrykk for BrdU og Nevronale-kjerner (Neun) positive celler, indikerer de et totalt antall celler "per kultur" i stedet for å gi beskjedasjon om vevsområdet eller volum.
Senere studier forbedret på denne metoden ved seksjonering de dyrkede skiver til individuelle 10 mikrometer seksjoner, som forbedret visualisering og immunhistokjemi protokoller ved at antistoffer mot lettere gjennomsyre vevsprøver 31. Bunk et al. 28 rapporterte dobbel merking med BrdU (10 mikrometer for 3 dager) som antall co-merkede celler per 10 mikrometer delen, men ikke gi informasjon om den sammenlignende område eller en bestemt hippocampus regionen studert dvs. CA1, CA3 eller DG. I tillegg gjør analyse av konfokale og fluorescens mikroskopi bilder ikke overbevisende måte viser at hippocampus morfologi ble vellykket opprettholdt.
Viktigere, begge studiene benyttet en BrdU eksponeringsperiode på 3 dager, noe som er forbundet ulemper. BrdU merking har sterkt hjulpet nevrogenesen studier ved at etterforskere å spore nylig delt celler i various hjerneregioner. Men BrdU toksisitet har også blitt godt karakterisert. Dens bruk er blitt vist å forårsake morfologiske og unormal oppførsel 32,33 og negative effekter på cellesyklus, differensiering, migrering og overlevelse av nevrale stamceller 34-36. Den langvarig administrering av BrdU i de tidligere nevnte studiene kan ha introdusert konfunderende variabler som endret hippocampus fysiologi og mens noen bivirkninger fra BrdU administrasjon kan være uunngåelig, ble vår eksperimentell protokoll utviklet for å begrense noen av disse komplikasjonene ved inkubasjon vevet med tymidinanaloger for 2 timer. I tillegg valgte vi å bruke CldU istedenfor BrdU fordi det viste bedre oppløselighet enn BrdU ved utarbeidelse av rugende løsning. Selv om tre dagers protokollen kan være nyttig for visse eksperimentelle design f.eks maksimere merking av prolifererende celler, har denne to timers protokollen et nytte av puls-merking av en forholdsvis liten bestandsjon av celler som kan studeres ved ønskede overlevelsestider (se figur 2B).
Ved å sammenligne nivået av nevronale produksjon etter to ulike metoder for BrdU søknad, Namba et al. Gitt et viktig bidrag til merking teknikker i organotypic skive kulturer 37. Forfatterne sammen intraperitoneal (IP) injeksjon av BrdU (50 mg / kg) i postnatal dag 5 (P5) rotter og in vitro-kulturer som mottok kulturmedium inneholdende 1 mM BrdU i 30 minutter umiddelbart etter explantation av vev. De rapporterer ingen statistisk signifikant forskjell mellom in vivo og in vitro tidlig BrdU injeksjon i dyrkede vevet. Forfatterne ikke presentere klare bilder som beskriver hippocampus struktur, men de rapporterer BrdU immunoreaktivitets som prosenter av total celler i granulat celle laget. Mens de benytter stereological telling, vil gi et mål ved område eller volum være verdifull. Generelt, De siterte studier stede organotypiske kulturer som en grundig detaljering av postnatal hippocampus skive kulturer, med programmer for studier av neurogenesis og farmakologiske forstyrrelser. Ved hjelp av denne teknikken, kan hippokampale skiver opprettholdes i opp til 21 dager in vitro (DIV) og medikamenter kan tilsettes til mediet til hvilket som helst punkt i dyrkningsperiode for å studere effekten på nevrogenesen.
Vårt mål var å merke en diskret, relativt homogen befolkning på DGCs ved å gi en kort 'puls' søknad av CldU for 2 timer. En vanlig ansatt strategi for å studere neurogenesis innebærer identifisering av et nevron er maturasjonelle scenen via immunhistokjemisk farging for ulike endogene markører med en tymidinanalogen. Konfokal og fluorescens mikroskopi bekreftet tilstedeværelsen av kjerner som er inkorporert tymidinanalogen CldU og ble derfor aktivt som gjennomgår mitose i løpet av dyrkningsperioden. Figur 2 in-vivo vev analyse kan tilpasses skive kulturer.
Spesielt er en mye brukt metode i neurogenesis forskning for å utføre immunhistokjemisk farging for microtubule assosiert protein, DCX, som hovedsakelig er uttrykt i umodne nerveceller fra dag 3-21 og den modne nevronale markør, Calbindin (CaBP), som er fullt uttrykt følgende 28 dager etter mitose. Fenotypen til CldU + celler ble bestemt ved hjelp av disse endogene markører 26.
Bedre metoder for å opprettholde skive kulturer for lengre perioder kan ha den ekstra fordelen av å la flere CldU + nevroner å nå moden, CaBP + scenen. I dag er en begrensning av organotypiske kultur tilnærming at vevet endres kontinuerlig i løpet av dyrkningsperioden. For eksempel, umiddelbart etter hippocampus disseksjon og plating av skiver, den tissue har en bredde på ca 400 um. Imidlertid, etter 2-3 uker i inkubasjonen kammeret, vil vevssnitt begynne å tynne, noe som resulterer i en endelig bredde mellom 250 til 350 um. Dette begrenser mengden av vev som kan brukes for immunhistokjemi og bør vurderes når du planlegger hvor mange dyr som skal brukes til et prosjekt. Ytterligere eksperimenter vil bidra til å karakterisere de funksjonelle endringer i hippocampus fysiologi som forekommer in vitro.
Protokollen for seksjonering og farging hippokampale skiver ble utviklet for å analysere cellulære og morfologiske forandringer som finner sted i løpet av dyrkningsperioden. Skive kulturer gir en mulighet til å teste effekten av ulike farmakologiske midler som hippocampus DGCs passere gjennom forskjellige utviklingsstadier under modning og representerer et verdifullt verktøy for fremtidige voksen neurogenesis studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Opitz-Araya, X., Barria, A.
- Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
- Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
- Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
- Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
- Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
- Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
- Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
- Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
- Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271 (2012).
- Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
- Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
- Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H.
- Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
- Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
- Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
- Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
- Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409 (2006).
- McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
- Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
- Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
- Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
- Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
- Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
- Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
- Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).
