Summary
Aquí se describe una técnica para el estudio de la neurogénesis postnatal del hipocampo mediante la técnica de cultivo de cortes organotípicos. Este método permite la manipulación in vitro de la neurogénesis adulta y permite la aplicación directa de agentes farmacológicos para el hipocampo cultivadas.
Abstract
Aquí se describe una técnica para el estudio de la neurogénesis postnatal del hipocampo en el cerebro de roedores mediante la técnica de cultivo de cortes organotípicos. Este método mantiene la morfología característica topográfica del hipocampo al tiempo que permite la aplicación directa de agentes farmacológicos a las desarrollo giro dentado del hipocampo. Además, los cultivos de cortes se pueden mantener durante un máximo de 4 semanas y por lo tanto, permiten a uno a estudiar el proceso de maduración de las neuronas granulares nacidos. Cultivos de cortes permiten la manipulación farmacológica eficaz de los cortes de hipocampo excluyendo variables complejas tales como las incertidumbres relacionadas con la localización anatómica profunda del hipocampo, así como la barrera hematoencefálica. Por estas razones, hemos tratado de optimizar cultivos de cortes organotípicos específicamente para la investigación neurogénesis postnatal.
Protocol
NOTA: Todos los animales procedimientos se ajustaban a las normas de salud y bienestar de los animales del Departamento de Medicina Comparada en la Universidad de Toronto.
1. Preparación del hipocampo rebanadas
- Esterilizar los siguientes instrumentos utilizando el autoclave seco a 125 ° C: mango de bisturí (# 3) (2), fórceps patrón estándar, grande (1), pequeña tijera de disección (angulado a lado) (1), Micro cuchara (cuchara y plana extremos espátula) (1), Micro-espátulas (redondeadas y redondeados extremos afilados) (2), Cena de pincel (1), Fuego pulido pipeta Pasteur (2), plazas de gasa, 2 x 2 pulgadas (5).
- Cuando estéril, poner los instrumentos en un recipiente estéril y mantener cubierto hasta su uso. Inmediatamente antes de la disección, sumergir los instrumentos en una solución de etanol al 70%.
- Preparar una placa de cultivo de 6 pocillos con inserto de cultivo antes de comenzar el procedimiento de disección mediante la adición de 1 ml de medio de cultivo / pocillo y el almacenamiento de la placa en la incubadora a 35 ° C unand 5% de CO 2.
2. Organizar herramientas de disección en la campana estéril de Flujo Laminar
- Pulverizar la campana de flujo laminar con etanol al 70% y eliminación de instrumentos de disección esterilizadas de alcohol. Permita que los instrumentos se sequen mientras descansa en una placa de Petri estéril para evitar el contacto entre el alcohol y el tejido cerebral diseccionado.
- Depósito 5-7 ml de solución de disección helada esterilizado en 2 grandes placas de Petri estériles. Un plato enfriará y limpiar la cabeza (sucio), el otro para la refrigeración y enjuagar el cerebro excavado (limpio). Colocar un papel de filtro esterilizado en una de las tapas de los recipientes de Petri para la disección de cerebro.
- Coloque un filtro de papel pequeña, esterilizada en una pequeña tapa de la placa de Petri para disecar el hipocampo. Depósito 3-5 ml de solución de disección helada esterilizado en 2 pequeños platos, Petri estériles. Un plato celebrará el hipocampo excavado, uno se mantenga secciones durante la separación de secciones de hipocampobajo el microscopio de disección.
- Preparar el cortador de tejidos con cinta adhesiva un trozo de papel de filtro esterilizado a la etapa de corte y el montaje de una hoja de afeitar estéril. Mojar el papel de filtro con una solución de disección esterilizado.
- Rocíe una bio-bolsa limpia con alcohol y lo coloca en el flujo laminar banco limpio.
3. Disección del hipocampo
- Rocíe la cría de rata P7 Sprague Dawley con etanol al 70% fuera del flujo laminar banco limpio y decapitar rápidamente al animal utilizando grandes tijeras quirúrgicas estériles dentro de la cabina de flujo laminar. Dejó caer la cabeza en la solución de disección enfriado con hielo en una de las placas de Petri.
- En la placa de Petri, enjuagar la sangre y rápidamente transferir la cabeza a un papel de filtro esterilizado, lado ventral hacia abajo.
- Utilizando el bisturí, corte a lo largo de la superficie dorsal en el plano sagital para exponer el cráneo subyacente. Cortar a través de la piel, pero no el hueso subyacente, que es suave y fácilmente penetrable en ratas de tsu edad. Ponga a un lado este bisturí "sucio" y no utilizar en el tejido cerebral.
- Usando las tijeras pequeñas disector (ángulo a lado) y pinzas, corte abierto el cráneo a lo largo de la sutura sagital del cráneo para bregma, el punto anatómico en el cráneo donde la sutura coronal se cruza perpendicularmente por la sutura sagital. El uso de fórceps para tirar de las aletas del cráneo arriba y lejos de la línea media del cráneo.
- Coloque la cuchara micro en la parte inferior del cerebro, debajo del tronco cerebral, para levantar suavemente el cerebro fuera del cráneo. Levantar el cerebro para exponer los nervios ópticos y bulbo olfatorio en la superficie basal del cerebro. Cortar estas estructuras con unas tijeras pequeñas para separar completamente el cerebro del cráneo. Retire y transferir el cerebro intacto a la otra placa de Petri grande que contiene solución de disección enfriado con hielo.
- El uso de la cuchara micro, transferir el cerebro a una pequeña tapa placa de Petri que contiene papel de filtro estéril. Con una pipeta Pasteur estéril, enjuague el cerebro con unas pocas gotas de dispreo solución para mantener el tejido húmedo.
- Usando una hoja de bisturí "limpia" cortar las dos hemisferios separados. Transferir el hemisferio izquierdo de nuevo a gran placa de Petri con micro cuchara y colocar lado pia hemisferio en solución de disección helada para su uso posterior.
- Ver la cara medial del hemisferio derecho e identificar el fondo de saco de borde, una banda prominente de la materia blanca a lo largo del borde medial del hipocampo. Con un bisturí estéril, hacer un corte sagital a través del fondo de saco, pero tenga cuidado porque sólo 0,5 cm de la punta de bisturí serán suficientes para reducir el fondo de saco.
- Usando 2 micro-espátulas, retire la primera hipocampo del hemisferio derecho, colocando la mano derecha-espátula en el tronco cerebral y el levantamiento de la corteza que recubre con la espátula de la izquierda. Levante suavemente la corteza para revelar el ventrículo lateral y la superficie medial del hipocampo. Una línea curva blanco, la fimbria, ahora debe ser visible.
- Alinear la curvatura de la espátula con la curvatura de la fimbria y presionar suavemente la espátula bajo la fimbria. Deslice la espátula a la izquierda y viajar a lo largo del eje rostral-caudal y luego levantar la espátula en dirección dorsal para eliminar hipocampo.
- Transferir el hipocampo a un plato pequeño nd 2 Petri con solución de disección enfriado con hielo. Repita el mismo procedimiento en el hemisferio izquierdo para eliminar el hipocampo izquierdo.
- Usando una espátula micro, transferir cuidadosamente el hipocampo a la etapa de cortador de tejidos. Arréglelos adyacentes y paralelos entre sí y perpendiculares al eje de la cuchilla de corte. Utilice un pincel para colocar el tejido y añadir unas gotas de la solución de disección en la parte superior de los hipocampos.
- Cortar el tejido en 400 micras rodajas sin detenerse para eliminar cortes individuales (por lo general no se unirán a la hoja). Después de todo el hipocampo se ha cortado, utilice el pincel para transferir suavemente las secciones a un nd plato pequeño 2 Petri con solución de disección.
- Bajo anuncioissecting microscopio, separar cuidadosamente las rodajas flotantes utilizando amicro-espátula y pincel.
- Retire la placa de cultivo previamente preparada con la cultura de inserción de la incubadora y el lugar en una campana de flujo laminar.
- Utilizando una pipeta Pasteur pulida al fuego, dibujar 4-5 rebanadas en las rebanadas de pipeta y transferir a la superficie apical de la membrana de inserción del cultivo. A continuación, ajustar la posición con un pincel y dejar espacio entre las secciones individuales y de la frontera de la inserción de la cultura.
- Utilizando una pipeta Pasteur estéril, eliminar la solución de disección exceso de la superficie apical de la membrana.
NOTA: Al retirar solución no llamar la secciones de tejido en la pipeta. Alternativamente, utilice una pipeta regular (P200 o P1000) con puntas de pipeta estériles para eliminar lentamente solución. - Coloque la placa de cultivo con medio de cultivo que contiene suero y las rodajas de hipocampo de nuevo en el incubador a 35 ° C y 5% de CO 2.
NOTA: Si las llamadas de experimentaciónpara generar culturas de varios animales, limpiar a fondo el flujo laminar banco limpio entre disecciones. Instrumentos Regreso a solución de alcohol y reemplazar todas las placas Petri, filtros de papel y hojas de afeitar estéril antes de la segunda disección.
4. Alimentación y mantenimiento organotípicos rodajas
- Culturas de alimentación en un banco limpio de flujo laminar estéril.
- Realizar la primera alimentación de las secciones de cultivo 2 días después de la disección. Aspirar medio de cultivo de edad con una pipeta de vidrio esterilizado.
- Utilice estériles 5 ml pipeta serológica para añadir 1 ml de medio fresco, estéril, que contiene suero a los pocillos.
- Reemplazar suavemente el inserto de cultivo y tener cuidado para eliminar las burbujas de aire que puedan haberse formado debajo de la superficie de la membrana.
- Después de la primera alimentación, cambio de medio cada dos días.
5. La incubación de cortes de tejido con timidina Análogos para etiquetar recién nacido neuronas
- Con el fin de estudiarla maduración y la integración de las células granulares dentadas en el hipocampo, se incuban las rebanadas organotípicos con un análogo de timidina, tales como bromodesoxiuridina (BrdU) o Chlorodeoxyuridine (CldU). Aquí, nosotros usamos CldU debido a su mayor solubilidad en solución salina.
- Después de 3div, añadir 1 l de 10 mg ml de solución madre / CldU en solución salina a 1 ml de medio de cultivo para una concentración final de 10 mg / ml. Si se utiliza BrdU, corregir la concentración de las diferencias en el peso molecular. Añadir medio con CldU a pocillos de cultivo e incubar el tejido con medio CldU contienen durante 2 horas a 35 ° C.
- Después de 2 horas de incubación a 35 ° C, se elimina el medio CldU contienen y reemplazar con medio de alimentación regular para reanudar el horario de alimentación normal (descrito anteriormente).
6. Fijación de tejidos y almacenamiento
- Establecer un calendario para la aplicación de los tratamientos y la fijación de las muestras de tejido antes de comenzar los experimentos de cultivo (Figura 2B). <li> En un post-disección día predeterminado, a preparar el siguiente en un extractor de laboratorio: un vaso de precipitados de 10 a 50 ml que contiene 4% de paraformaldehído (PFA) en tampón fosfato salino (PBS); un vaso de precipitados vacío para medio de cultivo desechado; pequeñas pinzas; y una pipeta 1.000 ml con puntas desechables.
- Retire la placa de cultivo (s) de la cámara y la transferencia de incubación a una campana de humos. Incline los accesorios para placas de pozos individuales con fórceps. A continuación, utilice una pipeta para eliminar medio y transferencia cultura a un vaso de precipitados disposición. Incline la placa de cultivo en un ángulo para ayudar a asegurar que haya salido todo medio de cultivo.
- Termine de retirar medio de una placa de cultivo a la vez. Al medio se ha eliminado, añadir 1 ml de PFA al 4% a cada pocillo de cultivo y sellar bien la placa con parafilm. Repita para tantas placas de cultivo como las placas necesarias y traslado al refrigerador a 4 ° C durante 24 horas.
- Después de 24 horas, prepare la siguiente en una campana de humos: 10-50 vaso ml contiene 0,1% de azida sódica en PBS; un vacíovaso de precipitados de PFA descartado (las medidas de seguridad cuando no funcione sustancias tóxicas); pequeñas pinzas; y 1.000 ml pipeta con puntas desechables.
- Siga el procedimiento descrito en 6.4 para añadir PFA, pero añadir 1 ml de PBS con azida de sodio en su lugar. Una vez que las placas así sellar completamente transferido, para uso futuro por envolver bordes en Parafilm y almacenar en el refrigerador a 4 ° C.
7. seccionar los tejidos para inmunohistoquímica
- Realizar el tejido seccionado usando un vibratome. La siguiente serie de pasos ayudan a maximizar el rendimiento de las secciones de tejidos utilizables de cultivos organotípicos.
NOTA: Inmediatamente después de la disección del hipocampo y de las planchas de las rebanadas, el tejido tiene un espesor de aproximadamente 400 micras. Sin embargo, después de 2-3 semanas en la cámara de incubación, rodajas de tejido comenzarán a aplanar, resultando en un espesor sección final de 150-300 micras. - Prepare los siguientes elementos a la sección tejido cultivado: un bisturí nº 11 blade y manejar, una placa de Petri de vidrio que contiene el hielo frío PBS, una pinza de micro-disección, y una etapa de corte vibratome limpio para montar el tejido.
- Utilice un bisturí para cortar cuidadosamente a lo largo del perímetro de la membrana de inserción circular de modo que se puede extraer de la carcasa de inserción de plástico. Deje un amplio espacio entre la rebanada culta y el bisturí.
- Transferir la membrana de inserción individual de una placa de Petri que contiene PBS. Después de lavado en PBS, el uso de fórceps para transferir la membrana a la etapa de montaje vibratome.
- A continuación, utilice el bisturí para eliminar el exceso de membrana que rodea las rebanadas cultivadas y cortar el exceso de material para crear bordes limpios. Este paso se asegurará de la membrana es plana y se puede adherir fácilmente a la superficie de corte.
- Coloque 1-2 gotas de adhesivo en la etapa de corte vibratome y extendido en capa uniforme usando una aguja 22 G. Extender el adhesivo en una forma rectangular con el borde largo paralelo a la cuchilla de corte de la vibratome. Realice este pasorápidamente, para evitar que el adhesivo se seque.
- El uso de fórceps para transferir la membrana recortada contiene rodajas de hipocampo a la etapa de corte y con cuidado colocar la membrana en la cola y asegurarse de que no haya burbujas de aire.
- A medida que el pegamento se seque, transferir la etapa vibratome con la membrana pegada de nuevo al plato que contiene PBS Petri. Preparar la hoja vibratome y que contiene azida de sodio 48 placa de pocillos para almacenar las secciones de tejido.
- Utilice la vibratome para generar 30 micras secciones de tejido de cortes organotípicos y la transferencia a una que contiene azida de sodio 48 placa de pocillos para el almacenamiento y posterior tinción inmunohistoquímica.
- Consulte preexistentes protocolos de 26,29 tinción inmunohistoquímica.
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Representative Results
Determinar si los cultivos organotípicos serían adecuadas para la investigación neurogénesis adulta requiere que cumplan dos criterios principales: 1) que las rebanadas mantienen rasgos morfológicos característicos de rodajas de hipocampo después de 10 a 21 días in vitro (DIV), y 2) que los PED recién nacidos pueden ser cuantificados mediante técnicas de inmunohistoquímica convencionales empleados habitualmente en la investigación neurogénesis adulta. Con respecto al primer criterio, la Figura 1A y 1B ponen de relieve la morfología del hipocampo conservado. Los rasgos característicos como el giro dentado (DG), las regiones CA1, CA3 y son fácilmente identificables.
En cuanto al segundo criterio, la Figura 1C (panel superior) proporciona una muestra representativa de los PED recién nacidos co-expresan el marcador neuronal endógeno, Doublecortin (DCX) en verde y el análogo de timidina exógena, 5-cloro-2'-desoxiuridina (CldU) en rojo. Estas neuronas se encuentran en el sub-grzona anular de la Dirección General del hipocampo. Con el fin de asegurar la correcta datación nacimiento de neuronas, identificamos CldU + núcleos que co-expresan DCX. La microscopía confocal se necesita en esta etapa para identificar con éxito las neuronas doble etiquetado porque las células candidatos deben co-expresar el marcador de interés a lo largo del eje Z de la célula. Datos de la muestra obtuvieron con tal rendimiento de doble etiquetado aproximadamente el 17% de las células CldU + que expresaban DCX y el 35% de las células CldU + que expresaban CaBP a los 12 días de la aplicación CldU. El valor DCX es muy similar mientras que el valor CaBP es considerablemente menor que la cifra obtenida comparable in vivo 26. Las condiciones de cultivo de tejidos estándar pueden ser responsables de un porcentaje relativamente bajo de las células CaBP +.
La Figura 2A presenta los pasos de disección que proceden de izquierda a derecha (1-8): comenzando con la decapitación de los animales (1), la eliminación del cerebro (2), la transferencia de cerebro a la solución de disección enfriado con hielo (3), diseccionarion de hipocampo de hemisferios izquierdo y derecho (4), el almacenamiento de hipocampos diseccionado en solución disección enfriado con hielo (5), la transferencia de ambos hipocampos a Stoelting cortador de tejidos y seccionando a 400 micras (6), la separación de las rebanadas individuales bajo el microscopio de disección (7), y enchapado tejido en insertos de cultivo celular (8). Procediendo de esta manera ayuda a mantener un ambiente estéril en todo el proceso de cultivo.
Por último, ya que el curso de tiempo de desarrollo es una característica importante de la neurogénesis del hipocampo, que elegimos para incubar las rodajas cultivadas con CldU exactamente 2 horas después de 3 DIV etiquetar dividir las células madre neurales. La estrecha ventana de tiempo para la administración CldU fue elegido para mejorar la probabilidad de que las neuronas marcadas constituían una población homogénea de células en aproximadamente la misma etapa de maduración (Figura 2). Con respecto a etiquetado CldU, una característica crítica de la neurogénesis para la función del hipocampo es que en un gitiempo ven hay una población heterogénea de células granulares dentadas en varias etapas de maduración 27,28.
Figura 1. Muestra fotografías de microscopio de fluorescencia destacando conservan la morfología del hipocampo. (A) rebanada organotípicos a partir de 12 días después de la disección immunolabeled para CldU (verde) y CaBP (rojo), 20x imagen compuesta de aire (barra de escala = 500 micras). (B) Micrografía de la muestra del sector a partir de 21 días después de la disección immunolabeled para CldU ( rojo) y DCX (verde) (opuesto esquema de color de la Figura 1A), 20x de aire (barra de escala = 100 m). (C) Panel superior. Representante confocal fotografía de microscopio de las células que expresan co-ClXdU y marcador neuronal inmaduro endógeno, DCX. PED co-expresión de DCX (verde) y CldU (rojo) se cuentan como las neuronas recién nacidas. La flecha indica un doble-labellevado celular en la etapa temprana de desarrollo, 40X de inmersión en aceite (barra de escala = 10 micras). Células comparables se han observado 10 días después de etiquetado in vivo 26. Panel inferior. Imágenes fluorescentes representativos de las células co-expresión de CldU (verde) y CaBP (rojo). La flecha indica una célula de doble etiquetado, 40X micrografía fluorescente (barra de escala = 10 micras). Circunvolución DG-dentado. GCL-gránulo capa de células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. (A) Ilustración de los pasos secuenciales para la disección del hipocampo en el flujo laminar banco limpio. La línea punteada indica (derecha) zonas "estériles" (izquierda) y "estériles" de la zona de disección. (B) Plazo para órganocultivos de corte typic preparados a partir de las crías de ratas P7 (iniciar). Las anotaciones indican aplicación del análogo de la timidina, CldU *, y "tratamiento", que puede incluir diversos agentes farmacológicos adecuados a la pregunta experimental. Los cultivos se fijaron con paraformaldehído en tiempos de permanencia deseados de aplicación CldU (Fix Culturas). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre del reactivo / Equipo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios / Descripción |
| 5-cloro-2'-desoxiuridina (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Peligrosos, carcinógeno |
| Cultivo de células inserta, 30 mm de diámetro, 0,4 m ptamaño de mineral | Thermo Scientific | 140660 | Nuclon recubrimiento delta en estos insertos ofrece una mejor adherencia del tejido y mejora la calidad del corte. |
| Cónica Centrifugar los tubos (estéril) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tijeras de disección (angulado a lado) | Ciencia Herramientas de Bellas | 14082-09 | |
| Medio esencial mínimo (MEM) | Gibco | 11095; líquido | Almacenar a 4 ° C |
| Eclipse Ni-U microscopio de fluorescencia | Nikon | ||
| Pegamento para el tejido | Krazy Glue | KG585 | Use la cantidad mínima de pegamento para lograr la adhesión como cualquier tejido expuesto al pegamento no se podrá utilizar para IHC. |
| Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Almacenar a 4 ° C |
| Suero de caballo inactivado por calor (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Hacer 50 ml alícuotas y almacenar a -20 ° C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Pipetas de vidrio modificados (fondo de pipeta Pasteur eliminado y el borde alisado con Bunsen llama) | |||
| Placa de Petri (100 mm x 15 mm) y (60 mm x 15 mm) | Fisher Marca | FB0875712 y FB0875713A | |
| Las hojas de bisturí # 11 | Ciencia Herramientas de Bellas | 10011-00 | |
| Bisturí mango # 3 | Ciencia Herramientas de Bellas | 10003-12 | |
| Pipetas serológicas | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Fórceps patrón estándar | Ciencia Herramientas de Bellas | 11000-12 | |
| Filtro de vacío estéril | Thermo Scientific- | 565-0020 | |
| Tijeras quirúrgicas | Ciencia Herramientas de Bellas | 14054-13 | |
| Jeringa impulsado unidad de filtro | Millipore Millex- | SLGP033RS | |
| Cortador de tejidos con etapa móvil | Stoelting | 51425 | |
| Pincel de punta fina |
Tabla 1. Suministros y Reactivos
| Solución | Ingredientes e Instrucciones |
| Solución de disección | a) 500 ml de Hank y# 39; s Solución salina equilibrada (HBSS) (Gibco-14025-092). |
| b) Añadir 2,2 g de D-glucosa. | |
| c) Añadir 0,5 g de sacarosa. | |
| d) Añadir 1,787 g de HEPES. | |
| e) Mezclar durante 30 minutos con placa de agitación magnética. | |
| f) Uso pH metro para garantizar solución tiene un pH final = 7,4. | |
| g) Utilice osmómetro para garantizar la osmolaridad final = 320-330 mOsm. | |
| h) Esterilizar solución en campana de flujo laminar estéril utilizando filtración al vacío a través de 0,2 micras filtro. | |
| Suero que contienen medio de cultivo: 100 ml Medio Esencial Mínimo (MEM) (Gibco 11095), 50 ml de suero de caballo (Gibco 16050-122), 50 ml de HBSS. | a) Añadir el siguiente a 50 ml de HBSS en el vaso y disolver en 37 ° C baño de agua. Mezclar con agitador magnético. |
| b) 1,3 g D-glucosa. | |
| c) 36 mg MgSO4. | |
| d) 17,6 mg de ácido ascórbico. | |
| e) 5 l de solución de CaCl2 2M de valores. | |
| f) Añadir 50 l antibiótico-antimicótico (100x acciones, estéril; Gibco 15140-062). | |
| g) 1 mg / ml de insulina. | |
| h) Esterilizar por encima de la solución por filtración a través de un filtro de 0,2 micras. | |
| i) Mezcle la solución filtrada con 100 ml de MEM y 50 ml de suero de caballo en campana de flujo laminar. | |
| j) Hacer 50 ml alícuotas en tubos de centrífuga cónicos estériles (Fisher Scientific-14-432-22) y se almacena a 4 ° C. | |
| Solución de fijación de paraformaldehído al 4%. | a) Preparar tampón fosfato salino (PBS), añadiendo la siguiente a 300 ml de H2O destilada y mezclar en la placa de agitación magnética. |
| b) Añadir 2,7 g de fosfato monobásico de sodio (NaH 2 PO 4). | |
| c) Añadir 11,5 g de sodio Phosphate dibásico (NaHPO 4). | |
| d) Añadir 9,0 g de cloruro de sodio (NaCl). | |
| e) Calentar aprox. 700 ml de H2O destilada a 55 ° C y apagar el fuego. | |
| f) Añadir 40 g de paraformaldehído (PFA) y se agita en 700 ml de agua utilizando la placa de agitación magnética. | |
| g) Combine la PBS (a, b, c, d) y soluciones de PFA (e, f), ajustar el pH a 7,4 y la parte superior hasta el volumen final de 1000 ml. | |
| 0,1% de sodio Solución azida | a) Añadir 1 g de azida de sodio en polvo (NaN 3) a 1 l de solución de PBS. |
| b) Mezclar con placa de agitación magnética y se almacena a 4 ° C. |
Tabla 2. Soluciones y Recetas
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Discussion
Después de CldU (o BrdU) administración, la línea de tiempo de aplicación de agentes farmacológicos puede ser elegido para dirigir PED recién nacido durante particulares ventanas de desarrollo. Por ejemplo, un agente hipotético se puede aplicar durante la segunda semana post-inyección CldU, que se propone para coincidir con la edad de las neuronas inmaduras que se encuentran en una etapa de desarrollo en que se GABA despolarizante. Futuros estudios que utilizan este protocolo podrían adaptar el agente farmacológico y la ventana de exposición a "adaptar" el enfoque de la cuestión experimental específica de interés.
Un criterio importante para determinar que los cultivos de corte son un modelo válido para la investigación neurogénesis postnatal es la capacidad de manchar y cuantificar las neuronas recién nacidas en el hipocampo. Las dos conclusiones principales en apoyo de esta hipótesis eran que el análisis microscópico reveló reactividad inmunohistoquímica para CldU y marcadores de proteínas endógenas en las mismas neuronas.Cuando se utiliza en combinación con marcadores neuronales endógenas, tales como los análogos de timidina y BrdU CldU son herramientas poderosas para la investigación neurogénesis.
La aplicación de los análogos de timidina, tales como BrdU, a través de inyecciones intraperitoneales se utiliza comúnmente en la investigación neurogénesis a las neuronas de la etiqueta se someten a la fase S de la mitosis 29. Enfoques similares se pueden emplear en cultivos organotípicos con ciertas modificaciones. Por ejemplo, los estudios anteriores administran BrdU (0,5 M durante 3 días) para rebanar cultivos después de 14 ~ 18 DIV. Revisión de los datos presentados en ese documento revela que algunos de los indicadores utilizados para cuantificar la neurogénesis no emplean las técnicas estándar utilizadas en el campo de la neurogénesis, es decir, la cuantificación estereológico 30. Por ejemplo, al informar sobre la co-expresión de BrdU y neuronales-núcleos (NeuN) células positivas, indicarán el número total de células "por la cultura" en lugar de proporcionar informaración con respecto área de tejido o volumen.
Estudios posteriores mejoraron en este método seccionando las rodajas cultivadas a 10 micras secciones individuales, que mejoraron los protocolos de visualización y de inmunohistoquímica permitiendo anticuerpos penetren más fácilmente las muestras de tejido 31. Bunk et al. 28 reportaron el doble etiquetado con BrdU (10 mM durante 3 días) como el número de co-etiquetados células por 10 micras sección, pero no proporcionaron información sobre la zona comparativa o región del hipocampo específico estudiado es decir, CA1, CA3 o DG. Además, el análisis de los confocal de fluorescencia y las imágenes de microscopía no muestra convincentemente que la morfología del hipocampo se mantuvo con éxito.
Es importante señalar que ambos estudios utilizaron un período de exposición BrdU de 3 días, que se ha asociado inconvenientes. Etiquetado BrdU ha contribuido enormemente a los estudios de la neurogénesis, permitiendo a los investigadores a rastrear células recién divididas en VAregiones cerebrales rias. Sin embargo, la toxicidad BrdU también ha sido bien caracterizado. Su uso se ha demostrado que causa anomalías morfológicas y de comportamiento 32,33 y los efectos negativos sobre el ciclo celular, la diferenciación, la migración y la supervivencia de las células madre neurales 34-36. La administración prolongada de BrdU en los estudios mencionados anteriormente puede haber introducido variables de confusión que alteraron la fisiología del hipocampo y mientras algunos efectos secundarios de la administración BrdU pueden ser inevitables, nuestro protocolo experimental fue diseñado para limitar algunas de estas complicaciones incubando el tejido con análogos de la timidina para 2 hr. Además, se optó por utilizar CldU lugar de BrdU, ya que mostró una mejor solubilidad que BrdU en la preparación de la solución de incubación. Aunque el protocolo 3 días puede ser útil para ciertos diseños experimentales, por ejemplo, maximizando el etiquetado de las células proliferantes, este protocolo hr 2 tiene una ventaja de pulso-etiquetado de una población relativamente pequeñación de las células que se pueden estudiar en los tiempos de supervivencia deseados (ver Figura 2B).
Al comparar el nivel de producción neuronal después de dos métodos diferentes de aplicación BrdU, Namba et al. Hizo una importante contribución a las técnicas de etiquetado en cultivos de cortes organotípicos 37. Los autores intraperitoneal comparación (IP) la inyección de BrdU (50 mg / kg) en días 5 (P5) ratas postnatales con cultivos in vitro que recibieron medio de cultivo que contiene 1 mM de BrdU durante 30 minutos inmediatamente después de la explantación de tejido. Ellos reportan una diferencia estadísticamente significativa entre los in vivo e in vitro temprana inyección de BrdU en en tejido cultivado. Los autores no presentan imágenes claras que describen la estructura del hipocampo pero informan inmunorreactividad BrdU como porcentajes del total de células en la capa de células granulares. Mientras que emplean conteo estereológico, proporcionando una medida por área o volumen sería valioso. En general, Los estudios citados presentes cultivos organotípicos como un minucioso detalle de los cultivos de cortes de hipocampo postnatales, con aplicaciones para el estudio de la neurogénesis y perturbaciones farmacológicos. Usando esta técnica, rebanadas de hipocampo se pueden mantener durante hasta 21 días in vitro (DIV) y las drogas se pueden añadir al medio en cualquier punto en el período de cultivo para estudiar el efecto sobre la neurogénesis.
Nuestro objetivo era marcar una discreta población, relativamente homogénea de los PED, proporcionando un escrito de demanda "pulso" de CldU durante 2 horas. Una estrategia comúnmente empleada para el estudio de la neurogénesis implica la identificación de la etapa de maduración de una neurona a través de la tinción inmunohistoquímica para diversos marcadores endógenos con un análogo de timidina. Confocal y microscopía de fluorescencia confirmó la presencia de núcleos que incorporan los CldU análogos de timidina y por lo tanto fueron sometidos activamente la mitosis durante el período de cultivo. Figura 2 in vivo se pueden adaptar para cultivos de cortes.
Específicamente, un método comúnmente utilizado en la investigación neurogénesis es llevar a cabo la tinción inmunohistoquímica para la proteína asociada a microtúbulos, DCX, que se expresa predominantemente en neuronas inmaduras del día 3-21 y el marcador neuronal maduro, Calbindin (CaBP), que se expresa plenamente siguiente 28 días después de la mitosis. El fenotipo de las células CldU + se determinó utilizando estos marcadores endógena 26.
Los métodos mejorados para el mantenimiento de cultivos de corte por períodos más largos pueden tener el beneficio adicional de permitir más CldU + neuronas para llegar a la madurez, CaBP + etapa. En la actualidad, una de las limitaciones del enfoque de la cultura organotípico es que el tejido está cambiando continuamente durante el período de cultivo. Por ejemplo, inmediatamente después de la disección del hipocampo y de las planchas de las rebanadas, la TIDICIÓN tiene una anchura de aproximadamente 400 micras. Sin embargo, después de 2-3 semanas en la cámara de incubación, rodajas de tejido comenzarán a delgada, que se traduce en una anchura final entre 250-350 micras. Esto limita la cantidad de tejido que se puede utilizar para la inmunohistoquímica y se debe considerar en la planificación de cuántos animales a utilizar para un proyecto. Experimentos adicionales ayudarán a caracterizar los cambios funcionales en la fisiología del hipocampo que se producen in vitro.
El protocolo para el seccionamiento y tinción de cortes de hipocampo fue desarrollado para analizar los cambios celulares y morfológicos que tienen lugar durante el periodo de cultivo. Cultivos de corte ofrecen la oportunidad de probar el efecto de diversos agentes farmacológicos como los PED hipocampo pasan por etapas de desarrollo distintas durante la maduración y representan una herramienta valiosa para futuros estudios de la neurogénesis adulta.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
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