Introduction
عامل النسخ Nurr1 وhomologs لها (Nur77 وNor1) تنتمي إلى فصيلة 4A مستقبلات النووي (NR4A) 1. بل هي أيضا مستقبلات اليتيمة لأنه لم يتم التعرف على بروابط الذاتية حتى الآن. تم استنساخ Nurr1 لأول مرة في عام 1992، وعلى الرغم من أن المعروف أن أعرب في الدماغ 2، تم الكشف عن دورها الأساسي للتنمية وصيانة الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط من الدراسات الماوس خروج المغلوب 3. بالإضافة إلى ذلك، دورها المهم في الحفاظ على الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط وقد تجلى مؤخرا دراسة خروج المغلوب الشرطية 4. ونتيجة لهذه الدراسات أنيقة تظهر الأدوار Nurr1 الحاسمة لالخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط، وركزت العديد من الدراسات اللاحقة إلى حد كبير على الخلايا العصبية الدوبامين والمرتبطة الدوبامين اضطراب الاعصاب الدماغ المتوسط، ومرض باركنسون (PD) 5.
والجدير بالذكر، وأعرب عن Nurr1 ليس فقط في الدماغ المتوسط الدوبامين (MDA) الخلايا العصبية، ولكن أيضا في ديمناطق الدماغ الآية 2، مما يشير إلى أنه قد يكون الأدوار الوظيفية في كثير من المجالات غير DA، الذي يحظى بدعم قوي من الدراسات الحديثة تبين أن Nurr1 يلعب دورا هاما في وظائف المخ المختلفة. فعلى سبيل المثال، تبين أن الأنشطة يحفز الذاكرة مثل التعلم، أو غيرها من المهام التابعة الحصين، يؤدي إلى ما يصل تنظيم Nurr1 التعبير في الحصين 6،7. بالإضافة إلى ذلك، نهدم من Nurr1 التعبير في قرن آمون كانت كافية ليضعف الذاكرة على المدى الطويل و / أو اللدونة متشابك 11/08، مما يوحي بقوة بأن Nurr1 تلعب أدوارا متنوعة في العديد من مناطق الدماغ. وبالتالي، إلى زيادة فهم التعبير خلية من نوع معين والتحت خلوية من Nurr1، فمن المستحسن استخدام الأجسام المضادة Nurr1 محددة، الذي لا يحمل أي-التفاعل عبر لhomologs لها Nur77 أو Nor1. وتصف هذه الورقة بروتوكول قبل الامتزاز لتوليد الأجسام المضادة Nurr1 محددة وبيانات إضافية الحالية تظهر خصوصيته.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تكوين جميع الحلول المذكورة أدناه يمكن العثور عليها في جدول المواد / المعدات.
1. البروتين عمود جسم تنقية
- تتوازن بروتين A عمود الدوران وجميع المخازن المطلوبة لدرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل البدء في إجراء.
- تمييع الدم المناعي 1: 1 مع بروتين A مفتش الاحتياطي ملزم. (5 مل من الدم ويوصى).
- بلطف استفادة من البروتين وعمود الدوران على رأس مقاعد البدلاء لطرد أي راتنج التي قد تكون عالقة في الحد الأقصى. إزالة الغطاء العلوي وبرفق قبالة إغلاق أسفل. وضع عمود في أنبوب جمع 15 مل والسماح حلول التخزين لاستنزاف.
- إضافة 5 مل من البروتين A مفتش الاحتياطي ملزم والسماح للحل لاستنزاف.
- تطبيق المصل المناعي المخفف إلى العمود وجمع من خلال تدفق. للحصول على أفضل النتائج، إضافة حجم العينة التي تحتوي على تركيز الأجسام المضادة تقل عن 80٪ من الأجسام المضادة ملزم capacit العمودذ.
- غسل العمود مع 15 مل من البروتين A مفتش الاحتياطي ملزم أو حتى الامتصاصية في 280 نانومتر هو أقل من 0.1.
- إضافة 100 ميكرولتر من تحييد مؤقت لخمسة أنابيب جمع المسمى.
- إضافة 5 مل من مفتش شطف العازلة للبروتين عمود وجمع 1 مل الكسور في كل من الأنابيب التي تحتوي على 100 ميكرولتر من تحييد العازلة.
- قياس الامتصاصية من كل جزء في 280 نانومتر كسور وتجمع مع الامتصاصية أكبر من 0.5. الحفاظ على الكسور المجمعة على الجليد لتصبح جاهزة للغسيل.
- تجديد العمود بإضافة 8 مل من مفتش الاحتياطي شطف والسماح للحل لتتدفق من خلال العمود.
- شطف العمود مع البروتين A مفتش حل ملزم حتى يعود شاطف الرقم الهيدروجيني إلى 7.4.
- تخزين العمود عن طريق إضافة 5 مل من محلول التخزين (0.02٪ أزيد الصوديوم في PBS). عندما تبقى حوالي 3 مل في العمود، أسفل الغطاء وتأمين الغطاء العلوي. تخزين العمود في 4 ° C.
- تحديد طول سو أنابيب غسيل الكلى حاجة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. باستخدام 16 مم شقة أنابيب استخدام 5.47 سم من طول الأنبوب الواحد مل من محلول أن مدال. قطع الأنابيب وشطف مع PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 لمدة 15 إلى 30 دقيقة.
- اضعاف ومشبك واحدة من نهاية الأنبوب غسيل الكلى، ونقل مفتش المجمعة التي تحتوي على كسور لغسيل الكلى أنابيب معايرتها في برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة وإغلاق الطرف الآخر.
- Dialyze في درجة حرارة الغرفة ضد 200 مجلدا من PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 لمدة 2 ساعة.
- تغيير العازلة غسيل الكلى (الطازجة PBS درجة الحموضة 7.4) وdialyze للساعة 2 آخر في درجة حرارة الغرفة.
- تغيير العازلة غسيل الكلى (الطازجة PBS درجة الحموضة 7.4) وdialyze بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- الحفاظ على حل الضد مدال في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للشروع في اتخاذ مزيد من الخطوات لتنقية.
- تقييم تركيز الأجسام المضادة باستخدام الامتصاصية له عند 280 نانومتر، ومعامل الامتصاص المولي من الأجسام المضادة في 280 نيوتن متر من 210000 M -1 سم -1 12.
2. اقتران من الائتلاف الحزبي البروتينات إلى AminoLink اقتران الراتنج
- إعداد عمودين، واحدة للNor1 والآخر للNur77. اتبع نفس البروتوكول لكل من البروتينات.
- ذوبان الجليد البروتين إلى أن يقترن إلى الراتنج على الجليد. تحديد تركيز البروتين باستخدام لها معامل الانقراض المولي والامتصاصية لها عند 280 نانومتر 12.
- بدلا من ذلك، استخدم فحص تقرير البروتين مثل فحص الحمض bicinchoninic 13. إذا تم حل البروتين في تبادل المحتوية على أمين المخزن dialyze أو رادع ضد العازلة اقتران. إذا كان البروتين هو في منطقة عازلة مناسبة (لا الأمينات الحرة) تمييع 4 أضعاف في اقتران العازلة.
- استخدام 2 مل من الراتنج ل2 ملغ من البروتين. جميع الخطوات التي تتبع هي لراتنج 2 مل في العمود 10 مل. ما يصل إلى 10 ملغ من البروتين يمكن أن تكون مرتبطة لكل 1 مل من الراتنج (2 مل 1: 1 الطين).
- يعد العمود 10 مل عن طريق دفع فريت الى الاسفل، وتشغيل PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 من خلال ذلك. كاب ركان الجزء السفلي من العمود وإضافة 2 مل من اقتران العازلة.
- إضافة حجم المطلوب من الطين (4 مل من الحصول على 2 مل من الراتنج) إلى العمود، وإزالة الغطاء السفلي والسماح للاستنزاف العمود. شطف العمود مع ما مجموعه 6 مل (حجم 3 الراتنج سرير) من اقتران العازلة والسماح العمود إلى استنزاف. بعد أن استنزفت المخزن المؤقت اقتران، استبدال الغطاء السفلي.
- إضافة 2-4 مل من البروتين معلقة في مخزن توصيلات إلى العمود (الحفاظ على قسامة من الحل البروتين لتقييم كفاءة اقتران بمقارنة تركيز البروتين من شطافة في الخطوة 2.11 باستخدام إما الامتصاصية في 280 نانومتر أو مقايسة bicinchoninic) . سقف وتخلط نهاية على نهاية لدينا حل متجانس.
- تزن فارغة 1.8 مل أنبوب microcentrifuge والانتقال إلى غطاء الدخان. نقل بعناية NaCNBH 3 (حوالي 0.05 غ) في أنبوب وزنه قبل. إغلاق الأنبوب وتزن الأنبوب الذي يحتوي NaCNBH 3. لا تقم بفتح أنبوب خارج غطاء محرك السيارة.
- بناء على وزنNaCNBH 3 نقل في أنبوب، وجعل 5 M حل عن طريق إضافة 1 M هيدروكسيد الصوديوم. الوزن الجزيئي للNaCNBH 3 هو بالتالي 62.84 ز ز 0.05 يساوي (0.05 / 62.84 = 7.96 × 10 -4 الشامات) 7.96 × 10 -4 الشامات. لجعل 5 M حل الاعلان (7.96 × 10 -4/5) 159 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم.
- قياس إجمالي حجم رد الفعل وأخذ حجم الراتنج بعين الاعتبار. إضافة 10 ميكرولتر من 5 M NaCNBH 3 في مل من رد الفعل.
- على سبيل المثال: لحجم رد الفعل 4 مل إضافة 40 ميكرولتر من 5 M NaCNBH 3. ل1 مل من الراتنج و 3 مل من البروتين وأضاف، أن إجمالي حجم هو 4 مل.
- تتويج العمود وتخلط نهاية على نهاية. تأمين عمود على محور دوار أنبوب وترك يستمر التفاعل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- في الصباح، وجلب العمود إلى غطاء الكيميائية وبعناية إزالة الغطاء عن بعض الغاز قد شكلت. استنزاف العمود في أنبوب نظيفة وحفظ شطافة لقياس البروتين يخدعوحدانية التركيز باستخدام الامتصاصية في 280 نانومتر طريقة 12 أو فحص الحمض bicinchoninic ومقارنتها مع تركيز البروتين بدء في الخطوة 2.6.
- غسل الراتنج مع 4 مل من اقتران العازلة والسماح للاستنزاف العمود.
3. حجب المواقع المتبقية
- غسل الراتنج مع 4 مل من التبريد العازلة. استنزاف واستبدال الغطاء السفلي. إضافة 2 مل من التبريد العازلة ووقف الراتنج.
- تقييم إجمالي حجم رد الفعل من خلال قياس حجم الراتنج وحجم العازلة التبريد ثم إضافة 10 ميكرولتر من 5 M NaCNBH 3 في مل من حجم رد الفعل.
- المزيج بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة نهاية الإفراط في نهاية المطاف. بعد 30 دقيقة، وجلب العمود في غطاء الدخان. إزالة بعناية الاعلى و من ثم إزالة الغطاء السفلي والسماح للاستنزاف عمود في أنبوب النفايات.
- يغسل العمود مع 5 مجلدات الراتنج من غسل الحل. مراقبة يغسل عن وجود البروتينات المتبقية عن طريق قياس abso شطافة لrbance في 280 نانومتر. يتم غسلها البروتينات وفكت بها تركيز عال الملح.
- غسل الراتنج مع 6 مل من نزع الغاز PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 يحتوي على 0.02٪ أزيد الصوديوم. الحفاظ على العمود في 4 ° C لحين الحاجة إليها.
4. تنقية Nurr1 الاجسام المضادة المحددة
- شطف جانب العمود Nur77 الائتلاف الحزبي مع 10 مل من PBS الرقم الهيدروجيني 7.4، والسماح للاستنزاف العمود. سقف الجزء السفلي من العمود ووضع Nur77 الائتلاف الحزبي العمود جانب ينضب في جديد 15 مل أنبوب جمع.
- إضافة 5 مل من البروتين وتنقية الأجسام المضادة لمكافحة Nurr1، وكأب العمود ومكان على محور دوار عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تنزع الأغطية العلوية والسفلية وجمع التدفق من خلال. توضع جانبا على الجليد حتى جاهزة للإضافة إلى العمود جانب Nor1 الائتلاف الحزبي.
- شطف جانب العمود Nor1 الائتلاف الحزبي مع 10 مل من PBS الرقم الهيدروجيني 7.4، والسماح للاستنزاف العمود. سقف الجزء السفلي من العمود ووضع Nor1 الائتلاف الحزبي العمود جانب في أنبوب جمع 15 مل.
- إضافة تدفق من خلال من الانقلاب Nur77 الائتلاف الحزبيالعمود أدى، وكأب العمود ومكان على محور دوار عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تنزع الأغطية العلوية والسفلية وجمع التدفق من خلال.
- قياس تركيز الأجسام المضادة عن طريق قياس الامتصاصية في 280 نانومتر.
التحليل الذي يعتمد ELISA 5. من تنقية مكافحة Nurr1 جسم
- إضافة 100 ميكرولتر من البروتين (2،5 ميكروغرام / مل) إلى الآبار من 96 لوحة جيدا. إذا اختبار 3 البروتينات المختلفة، إضافة 100 ميكرولتر من البروتين 1 إلى الآبار A1 إلى H4، 100 ميكرولتر من البروتين 2، لآبار A5 إلى H8 و 100 ميكرولتر من البروتين 3 إلى الآبار A9 إلى H12. تغطية لوحة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- غسل الآبار المغلفة مرتين مع 300 ميكرولتر لكل بئر من PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 وإضافة 300 ميكرولتر من ELISA عازلة عرقلة للمستضد كامل الآبار المغلفة واحتضان 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- في حين أن لوحة يتم حظر إعداد التخفيف بدءا المطلوب من تنقية مكافحة Nurr1 الأجسام المضادة (تتراوح بين 10 و 100 ميكروغرام / مل) في ELISA عازلة حظر.
- بعد 2 ساعة من حظر، استبدال كتلة عازلة ELISA مع 100 ميكرولتر من الطازجة كتلة عازلة ELISA لجميع الآبار.
- إضافة 100 ميكرولتر من المخفف تنقية مكافحة Nurr1 أجسام مضادة لجميع الآبار في الصف A. مخفف تسلسليا الأجسام المضادة عن طريق نقل 100 ميكرولتر من محلول من الصف ألف من الآبار في الصف B يليه نقل 100 ميكرولتر من محلول من صف إلى صف B C مواصلة السير إلى صف G. بعد خلط الحلول في الآبار في الصف G تجاهل الإضافية 100 ميكرولتر. الآبار في الصف H يحصلون إلا على 100 ميكرولتر الأولية من عرقلة العازلة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- غسل لوحة ثلاث (3) مرات مع 300 ميكرولتر لكل بئر من توين 20 بنسبة 0.05٪ في PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 وصمة عار لوحة لإزالة غسل العازلة الزائد.
- إضافة 100 ميكرولتر من الفجل البيروكسيد (HRP) مترافق الماعز مفتش المضادة للأرنب الواحد في ELISA كتلة عازلة (1: 8000 تخفيف، ومدى محدد من 1: 5000 إلى 1: 25000). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- غسل عشر لوحةري (3) مرات كما هو موضح في 5.6. شطف جميع الآبار عن طريق ملء لهم مع 300 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. وصمة عار الماء الزائد عن طريق لوحة للقلب على امتصاص الورق.
- إضافة 100 ميكرولتر من 3، 3، 5، 5 'tetramethylbenzidine (تحسنت إلى درجة حرارة الغرفة) لجميع الآبار واحتضان 15-30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- وقف رد الفعل من خلال إضافة 50 ميكرولتر من 2 NH 2 SO 4.
- قراءة الامتصاصية في 450 نانومتر طرح الخلفية في 650 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مقارنة بين البروتين عمود تنقية الأجسام المضادة Nurr1 محددة مع البروتين المنقى أضداد Nurr1 تليها المرور عبر Nur77 الائتلاف الحزبي والأعمدة Nor1 الائتلاف الحزبي هو مبين في الشكل 1. كما يمكن أن يرى، البروتين المنقى A Nurr1 الأجسام المضادة أظهرت ملزم قوية لNurr1 الائتلاف الحزبي. ومع ذلك، فإنه أظهر أيضا كبير ملزمة لNur77 الائتلاف الحزبي وNor1 الائتلاف الحزبي. عندما تم تنقية البروتين المنقى A Nurr1 الأجسام المضادة أيضا ضد Nur77 الائتلاف الحزبي وNor1 الائتلاف الحزبي، وتقارب النهائي تنقية الأجسام المضادة Nurr1 أظهرت محددة ملزمة لNurr1 الائتلاف الحزبي مع غير قابلة للكشف ملزم لNur77 الائتلاف الحزبي أو Nor1 الائتلاف الحزبي، مما يدل على أن لها عبر التفاعل لNur77 وNor1 كان إزالتها بالكامل.
وقد تجلى هذا التحديد أيضا عن طريق تحليل لطخة غربية مقتطفات من CHO الخلية مع transfected ناقلات التعبير يحمل تنصهر كامل طول Nurr1، Nor1، أو Nur77 إلى MYC علامات البروتين (الشكل 2). كما هو متوقع، antib مكافحة MYCكشفت odies الذي تم التعبير عنه كل بروتين كامل طول في الوزن الجزيئي المتوقعة. بالاتفاق مع النتائج ELISA، البروتين المنقى A Nurr1 الأجسام المضادة المحددة الكشف بقوة بالطول Nurr1 ولكن أيضا الكشف عن Nor1 وNur77 وإن كانت أقل كفاءة. في المقابل، فإن Nurr1 الأجسام المضادة تنقيته تماما لا يحمل أي اكتشافها عبر التفاعل لNor1 وNur77 بواسطة ELISA أو تحليل لطخة غربية.
وأخيرا، تم استخدام الأجسام المضادة Nurr1 النقي تماما لتحليل المناعى للخلايا العصبية نجمة داود الحمراء. تم توثيقه جيدا أن Nurr1، ولكن ليس homologs الوطيدة Nor1 وNur77، وأعرب عن بارز في القوارض والخلايا العصبية نجمة داود الحمراء الإنسان في كل مرنا ومستويات البروتين 14،15. وأكد استخدام Nurr1 الأجسام المضادة تنقيته تماما أن Nurr1 يتم التعبير بشكل حصري تقريبا في نواة الخلايا العصبية نجمة داود الحمراء في منطقة المادة السوداء (الشكل 3).
الشكل 1: مقارنة ELISA من نشاطية عبر الأجسام المضادة لمكافحة Nurr1 قبل وبعد تنقية قبل المرور عبر Nur77 وNor1 LBDs الأعمدة إلى جانب البروتين المنقى أضداد Nurr1 (0.156 ميكروغرام / مل) (أ) أو البروتين وتنقيته تليها. اللوني على أعمدة Nor1 وNur77 الائتلاف الحزبي إلى جانب الأجسام المضادة لمكافحة Nurr1 (0.156 ميكروغرام / مل) (ب) وأضيفت إلى الآبار من 96 لوحة جيدا المغلفة مع 100 ميكرولتر من 2،5 ميكروغرام / مل من أي Nurr1 الائتلاف الحزبي، Nor1 الائتلاف الحزبي أو Nur77 الائتلاف الحزبي. تم تنفيذ ELISA بها كما هو موضح في القسم الأسلوب.
الشكل 2: كشف محددة من كامل طول Nurr1 أعرب في الخلايا CHO باستخدام تنقيته تماما الضد Nurr1 محددة على كامل طول Nurr1، وأعرب عن البروتينات Nor1، وNur77 كما MYC الموسومة.البروتينات الانصهار في الخلايا CHO والكشف عنها من قبل Myc على أجسام مضادة محددة (أ)، البروتين المنقى A Nurr1 الأجسام المضادة (ب)، وتنقيته تماما Nurr1 الأجسام المضادة (ج). أضداد أكتين المستخدمة للسيطرة على البروتين تحميل (د). تم transfected كل Myc على الموسومة DNA كامل طول (الوزن الجزيئي لل65، 66، و 69 كيلو دالتون لNurr1، Nur77، Nor1، على التوالي) عابر إلى خلايا CHO وعلى نفس القدر من مقتطفات خلية تم تحميلها في كل حارة. حارة 1: السيطرة السلبية التي تتكون من خلايا CHO مقتطفات مع transfected متجه فارغة. 2 لين: Myc على-Nurr1. حارة 3: Myc على-Nur77. حارة 4: Myc على-Nor1.
الشكل (3): إن الأجسام المضادة Nurr1 محددة النقي بالكامل بالكشف على وجه التحديد الخلايا العصبية الدوبامين التيروزين هيدروكسيلاز إيجابية الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط في المادة السوداء إيجابية لNurr1، كبريدxamined التي كتبها المناعية باستخدام أجسام مضادة Nurr1 محددة النقاء تماما. والجدير بالذكر أن والمترجمة Nurr1 في نواة الخلايا العصبية نجمة داود الحمراء. TH (هيدروكسيلاز التيروزين). على نطاق وبار = 100 ميكرون. شريط النطاق في دمج مربع أبيض هو 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نجاح هذا البروتوكول يعتمد على توافر البروتينات النقية لتوصيف الأجسام المضادة التي أثيرت ضد عضو محدد من عائلة البروتينات المثيرة للاهتمام. ليست هناك حاجة لتنقية الأجسام المضادة باستخدام بروتين A / G حتى ثبت بوضوح أن هناك نشاطية عبر الكبيرة التي ELISA والنشاف الغربي.
كما جاء في النص، فمن المهم تجنب تعليق البروتين (ق) أن تكون مرتبطة العابرة إلى العمود في وجود مخزن مؤقت التي تحتوي على الأمينات مثل تريس أو جليكاين. وعلاوة على ذلك تركيز البروتين الأمثل تستخدم لعبر ربط يجب أن تحدد تجريبيا. أيضا الكثير من البروتين على العمود يمكن أن يؤدي إلى الإعاقة الفراغية في حين أن القليل جدا تقلل من كفاءة امتصاص. لذلك، انها فكرة جيدة لاختبار تركيزات البروتين تتراوح 2-10 ملغم / لتر وتقييم نوعية الأجسام المضادة الناتجة عن ذلك.
يجب النظر في عدة عوامل عند عشرهو فشل تقنية لانتاج الاجسام المضادة المحددة للغاية. وتشمل هذه: الكفاءة عبر ربط، وفقدان المجال مناعيا، وعبر ربط تمسخ البروتين. كما جاء في البروتوكول والرصد عبر ربط الكفاءة يسمح للتقرير الذي يتم يجمد البروتين الكثير أو القليل جدا على العمود. إذا عبر ربط باستخدام الأمينات رد الفعل يشتبه في مجال تدمير مناعيا (ق)، والشلل من خلال مجموعة الكربوكسيل أو من خلال الكربوهيدرات ينبغي النظر فيها.
من المهم مراقبة كفاءة إجراءات لانتاج أجسام مضادة محددة للغاية على الدوام. لأغراض التجديد، لا بد من تجريد أعمدة من الأجسام المضادة عبر التفاعل ملزمة لهم باستخدام ظروف قاسية (درجة الحموضة العالية أو المنخفضة). هذا يسبب نسبة عالية من البروتينات بشكل متزايد عبر ربط ليتم التشويه والتحريف بشكل فعال، والحد من أداء العمود.
إضافة منع وكلاء في ELISA ونمط غربي آسييستخدم النشاف آكانيوز عادة بمستوى لا بأس به من النجاح. ومع ذلك، فإن النهج هو موضح في هذا الفيديو يزيد من احتمالات النجاح ويقلل من الحاجة للحفاظ على كميات كبيرة من البروتينات عبر التفاعل في متناول اليد. كما الكواشف وطرق لشل حركة البروتينات إلى اللوني وسائل الإعلام ومواصلة تحسين، فإن هذا النهج أن يسهم في التعرف على تعميم الخلايا تحولت أجسام مضادة محددة.
وهذا النهج محدودة بسبب توافر البروتينات النقية. قيود آخر من هذا البروتوكول هو الاعتماد على لطي السليم عند استخدام المجالات البروتين. إذا المجالات البروتين لا أضعاف كما في البروتين الكامل، واستراتيجية ما قبل الامتزاز قد لا تسفر عن الأجسام المضادة التي يمكن أن تحدد بسهولة عضو البروتين من الاهتمام عند تحليل الخلايا او الانسجة مقتطفات.
العديد من البروتينات المصالح التابعة (الفرعية) عائلة من البروتينات مع الأمينية عالية homologies تسلسل الحمض. توصيف وظيفي والاتساعtification توزيع البروتينات غالبا ما تعتمد على توافر الاجسام المضادة المحددة ضد كل فرد من أفراد الأسرة. تساهم homologies الأحماض الأمينية عالية بين أعضاء البروتين في نفس العائلة إلى صعوبات في توليد أجسام مضادة محددة للغاية. استخدام هذه الأجسام المضادة عبر التفاعل غالبا ما تؤدي إلى نتائج متضاربة.
أحد الأمثلة على ذلك هو اليتيم Nurr1 مستقبلات النووي الذي ينتمي إلى فصيلة NR4A من المستقبلات النووية، جنبا إلى جنب مع Nur77 وNor1. وبما أن هذه العوامل الثلاثة تشترك في درجة عالية من التماثل الأحماض الأمينية، والأجسام المضادة ضد كل عامل تظهر نشاطية عبر الهامة، التي تعيق تحليل دقيق لكل عامل.
عن طريق هؤلاء الأعضاء NR4A كمثال على ذلك، كان من الممكن لتوليد أجسام مضادة محددة للغاية Nurr1 خالية من نشاطية إلى Nor1 أو Nur77. منذ LBDs حصة تناظر أقل من المجالات DNA ملزمة، أعرب عن الائتلاف الحزبي من كل من البروتين وتنقيته ثم استخدامه لطmprove خصوصية أضداد Nurr1. في البداية، والأجسام المضادة ضد الائتلاف الحزبي Nurr1 وأظهرت مستويات متواضعة ولكن مهمة من عبر التفاعل مع بروتينات أخرى، وفحصها من قبل ELISA وتحليلات لطخة غربية. ومع ذلك، عندما تم تنقية البروتين المنقى A Nurr1 الأجسام المضادة أيضا من خلال ما قبل الامتزاز ضد المجالات الائتلاف الحزبي عبر رد الفعل من Nur77 وNor1، الناتجة Nurr1 الأجسام المضادة لم تظهر أي تفاعل الصليب، كما فحصها من قبل لطخة غربية وELISA تحاليل الكشف عن بارز Nurr1 -expressing الخلايا العصبية DA في مناطق الدماغ المتوسط. البيانات لطخة غربية وELISA تحليلات تتفق بشكل وثيق مع بعضها البعض، مشيرا إلى أن هذه التحليلات يمكن أن تكون مكملة ويدعم كل منهما الآخر.
أخذت معا، فإن هذه الاستراتيجية تنقية الجسم المضاد سيكون مفيدا للغاية في توليد الأجسام المضادة المحددة من خلال القضاء على التفاعل المتبادل للأعضاء البروتين مثلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77 | Column Storage solution | ||
| AminoLink Coupling Resin and Kit | Thermo Scientific | 44890 | |
| Protein A spin column | Thermo Scientific | 89978 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| 96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10% Normal Goat Serum | KPL | 50-675-69 | |
| Milk Diluent/ Blocking Concentrate | KPL | 50-82-01 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23235 | |
| Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | 31460 | |
| Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine | Thermo Scientific | 34028 | |
| 2N H2SO4 | Macron Fine Chemicals | H381 05 | |
| Protein A IgG Binding Buffer | Thermo Scientific | 21001 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Column Storage solution | Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide | ||
| Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing | Spectrum Labs | 132128 | |
| 10 ml Disposable columns | Thermo Scientific | 29924 | |
| AminoLink Coupling Buffer | 0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0 | ||
| Quenching buffer | 1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4 |
||
| Wash Solution | 1M NaCl, 0.05% NaN3 | ||
| ELISA Blocking buffer | 1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent | ||
| Storage Solution | PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide | ||
| Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl |
References
- Hawk, J. D., Abel, T. The role of NR4A transcription factors in memory formation. Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).
- Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1. Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).
- Zetterström, R. H., et al. Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice. Science. 276 (5310), 248-250 (1997).
- Kadkhodaei, B., et al. Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons. J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).
- Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).
- Peña de Ortiz, S. Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning. Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).
- Vecsey, C. G., et al. Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation. J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).
- Colón-Cesario, W. I., et al. Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory. Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).
- McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).
- Hawk, J. D., et al. NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors. J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).
- Bridi, M. S., Abel, T. The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity. Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
- Smith, P. K., et al.
- Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).
- Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization. Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).
