Introduction
转录因子Nurr1基因和它的同系物（Nur77的和NOR1）属于核受体亚家族4A（NR4A）1。它们还孤儿受体，因为它们的内源性配体尚未得到确认。 Nurr1的于1992年首次克隆并虽然已知在脑中表达2，其用于开发和维护中脑多巴胺神经元的基本作用是揭示基因敲除小鼠的研究3。另外，它的维修中脑多巴胺神经元的重要作用由一个条件性敲除研究4最近被证实。由于这些优雅的研究显示对中脑多巴胺神经元Nurr1基因的关键作用，许多随后的研究主要集中在中脑多巴胺神经元和多巴胺相关的神经退行性疾病，帕金森氏病（PD）5。
值得注意的是，Nurr1的表达不仅在中脑多巴胺（MDA）的神经元，而且在二节脑区2，这表明它可具有在许多非DA领域，这强烈地受到最近的研究显示，Nurr1的起着各种大脑功能的重要作用的支持功能作用。对于实施例，它表明存储器诱导活动，如学习，或其它海马依赖性任务导致上调Nurr1的表达在海马6,7。此外，击倒在海马Nurr1的表达足以削弱长期存储器和/或突触可塑性8-11，强烈暗示Nurr1基因在许多脑区域起着不同的作用。因此，为了进一步理解Nurr1的的细胞类型特异性和亚细胞表达，理想的是使用Nurr1基因特异性抗体，其不表现出任何交叉反应性，以它的同系物Nur77的或NOR1。本文介绍了一种预吸附协议产生Nurr1的特异性抗体和现在的其他数据显示出其特异性。
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Protocol
注意：下面引用的所有解决方案的组合物所用的材料/设备表中找到。
1，蛋白A柱抗体纯化
- 平衡蛋白A旋转柱和开始的过程之前，所有必需的缓冲器至室温15分钟。
- 淡化免疫血清1：1的蛋白A的IgG结合缓冲。 （5毫升血清的建议）。
- 轻轻拍打蛋白质的台式离心柱，以清除可能在帽递交的任何树脂。取下顶盖，轻轻折断底部封闭。放置在一个15毫升的收集管的柱，并允许存储溶液排出。
- 加入5 ml蛋白A的IgG结合缓冲液，并使溶液排出。
- 适用的稀释免疫血清到柱并收集流过。为获得最佳效果，添加包含的抗体的浓度小于80％的柱的抗体结合capacit的样品体积年。
- 用15毫升的蛋白A的IgG结合缓冲液，或直至280nm处的吸光度低于0.1洗柱。
- 加100ul中和缓冲液的五个标记收集管。
- 添加5毫升的IgG洗脱缓冲液的蛋白A柱和收取1 ml的组分中含有每100微升和缓冲液的试管中。
- 测量每个级分在280nm和池组分的吸光度与吸光度大于0.5。置于冰上汇集的分数，直到准备透析。
- 通过加入8毫升的IgG洗脱缓冲液再生柱子，并允许该溶液流过该柱。
- 冲洗蛋白A IgG结合的解决方案列中，直到洗脱液pH值恢复到7.4。
- 加入5毫升的存储溶液（在PBS中0.02％叠氮化钠）存储的列。当约3毫升依然在列，盖底和固定顶盖。储存在4℃下的列。
- 确定长度Ø根据制造商的说明˚F透析管需要。使用平面直径16毫米油管使用5.47厘米每毫升溶液管长度与进行透析。切管和漂洗用PBS pH 7.4的15至30分钟。
- 折叠和剪辑透析管的一端，传输汇集的IgG含有级分透析管平衡在pH 7.4的PBS和关闭的另一端。
- 透析在室温下对200体积pH 7.4的PBS中2小时。
- 改变透析缓冲液（新鲜的PBS pH 7.4）中和透析另外2小时，在室温下进行。
- 改变透析缓冲液（新鲜的PBS pH 7.4）中并透析过夜，在4℃。
- 保持在4℃透析的抗体溶液，直到准备进行进一步的纯化步骤。
- 评估使用其280nm处的吸光度的抗体浓度和抗体在210,000 M -1 -1 12 280nm摩尔吸收系数。
2.偶合LBD蛋白质来AminoLink耦合树脂
- 准备两列，一个用于NOR1，另一个用于Nur77的。按照相同的协议，这两种蛋白。
- 解冻的蛋白要被连接到在冰上的树脂。确定使用其摩尔消光系数和其在280nm处12吸收的蛋白浓度。
- 或者，使用蛋白测定法，如二辛可宁酸测定法13。如果蛋白质溶解在对偶联缓冲液含胺缓冲透析或缓冲液交换。如果所述蛋白质是在合适的缓冲液（无游离胺）稀释4倍于偶联缓冲液。
- 使用2毫升树脂为2毫克的蛋白质。随后所有的步骤都是2毫升树脂10 ml柱。高达10毫克蛋白质可以每1ml树脂（1浆料2毫升1）被链接。
- 通过按压玻璃料至底部，并通过它运行pH 7.4的PBS制备10ml的柱。盖牛逼柱的底部，他和加入2ml耦合缓冲。
- 加浆料的期望体积（4毫升至得到2毫升树脂）到柱上，取下底盖，并让柱漏极。冲洗以总共6毫升偶联缓冲液（3树脂床体积）柱上，使柱排出。经过耦合缓冲区已耗尽，更换底盖。
- 加2-4 ml蛋白质悬浮于偶联缓冲液的向列（保持该蛋白质溶液的等分试样通过使用吸光度在280nm或二辛可宁测定在步骤2.11比较洗脱液的蛋白浓度来评估耦合效率） 。盖上盖子并混合结束了到底能有一个均匀的溶液。
- 称量空1.8毫升微量离心管中，并移动到通风橱。小心在预称重管转移的NaCNBH 3（约0.05克）。关闭管，重量含3的NaCNBH管。不要在外面引擎盖打开管。
- 基于重量的NaCNBH 3转移到管中，使通过加入1M的NaOH一个5M的溶液。的NaCNBH 3的分子量，因此62.84克0.05克等于（0.05 / 62.84 = 7.96×10 -4摩尔）7.96×10 -4摩尔。为了使5个M解决方案的附加 （7.96×10 -4 / 5）159微升1 M氢氧化钠。
- 测量反应的总量服用树脂体积考虑。加入10微升5米的NaCNBH 3每毫升反应。
- 例如：4ml的反应体积加入40微升5米的NaCNBH 3。对于1毫升树脂和3ml补充蛋白质，总体积为4毫升
- 盖上列，拌匀结束了尽头。固定在管旋转的柱，并让反应继续过夜，在4℃。
- 在早晨，把列的化学罩和小心地拧开一些气体可能已经形成。沥干列到一个干净的试管和保存洗脱液测量蛋白质CON中心定位使用280nm处的吸光度方法12或二辛可宁酸测定法，并将其与在步骤2.6的起始蛋白质浓度比较。
- 用4ml偶联缓冲液中洗涤树脂，并让柱漏极。
3.阻止遗址尚存
- 用4ml淬火缓冲液洗涤树脂。排水和更换底盖。加入2ml缓冲液淬火和暂停树脂。
- 通过测量树脂体积和淬火缓冲容积然后添加的5M的NaCNBH 3 10微升每毫升反应体积的评估的总反应体积。
- 轻轻混匀，在室温下搅拌30分钟结束过端。 30分钟后，使在通风橱的列。小心取出顶部，然后取下底盖，让列排入废液管。
- 用洗涤液5树脂体积洗列。通过测量洗脱液的ABSO监视洗涤残余蛋白质的存在rbance 280nm处。未偶联的蛋白质是由高浓度的盐洗出。
- 用6ml脱气的PBS pH7.4，含有0.02％叠氮化钠洗涤树脂。保持柱在4℃直到需要。
4.净化Nurr1的特异性抗体
- 冲洗用10毫升的PBS pH值为7.4的Nur77的LBD再加柱，让列流失。帽塔的底部，然后将排水Nur77的LBD耦合柱在一个新15毫升收集管。
- 加入5 ml蛋白质的纯化的抗Nurr1的抗体，盖在4℃下在旋转器上的柱和地点1小时。除去顶部和底部盖，并收集通过的流动。冰上直至准备预留添加到NOR1 LBD加上列。
- 冲洗用10毫升的PBS pH值为7.4的NOR1 LBD再加柱，让列流失。帽塔的底部，然后将NOR1 LBD耦合柱在15毫升收集管中。
- 通过从Nur77的LBD政变添加流导致柱，盖在4℃下在旋转器上的柱和地点1小时。除去顶部和底部盖，并收集通过的流动。
- 通过测量280nm处的吸光度测定抗体浓度。
纯化的抗Nurr1的抗体5.基于ELISA的分析
- 加入100微升蛋白（2.5微克/毫升），以96孔板的孔中。如果测试3种不同的蛋白质，添加100微升蛋白1井A1至H4，100微升蛋白2，井A5为H8和100微升蛋白3井A9为H12。覆盖板和孵化一夜之间在4℃。
- 每个pH 7.4的PBS的井300微升两次洗涤包被的孔，并添加300微升的ELISA阻断缓冲液将整个抗原包被的孔，并在室温下孵育2小时。
- 而板被阻断制备纯化的抗Nurr1的抗体的所希望的起始稀释液（从10至100微克/毫升）在ELISA中封闭缓冲液。
- 2小时后阻断，替换用100μl的新鲜的ELISA块缓冲器向所有孔的ELISA块缓冲器。
- 加入100微升稀释纯化的抗Nurr1的抗体，所有井排A.串行通过将100微升的解决方案，从A行到B行的孔随后转移100微升的解决方案从B行到C行稀释抗体继续向下行G.混合解决方案，井G行丢弃超出100微升之后。在排H井只收到初始100微升封闭缓冲液。在室温下孵育1小时。
- 在pH 7.4的PBS洗涤该板，每0.05％吐温20以及300微升三（3）次并且吸干板以去除多余的洗涤缓冲液。
- 添加100μl的辣根过氧化物酶（HRP）缀合的山羊抗兔IgG稀释在ELISA中块缓冲液（1：8000稀释;典型的范围是从1：5000至1：25000）。在室温下孵育1小时。
- 洗个板块稀土元素（3）倍的5.6中描述。通过用300μl去离子水填充它们冲洗所有孔中。通过倒转板到吸收纸吸干多余的水。
- 加入100微升3,3'，5,5'四甲基联苯胺（加温到室温）到所有孔中并孵育15至30分钟，在黑暗中在室温下进行。
- 停止加入的2 50微升的NH 2 SO 4的反应。
- 读450nm处的吸光度在650nm中减去背景。
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Representative Results
蛋白质的比较例A纯化柱Nurr1的特异性抗体用蛋白A纯化的抗Nurr1的抗体然后通过Nur77的LBD和NOR1 LBD列通路示于图1。如可以看到的，蛋白A纯化的Nurr1的抗体表现出强结合到Nurr1的LBD。但是，它也表现出显著结合Nur77的LBD，并NOR1 LBD。当蛋白A纯化的Nurr1的抗Nur77的LBD和NOR1 LED，纯化Nurr1的抗体表现出特异性结合Nurr1的LBD检测不到结合Nur77的LBD或NOR1发光二极管，表明其交叉反应性Nur77的和NOR1是最后的亲和力进一步纯化完全除去。
这种特异性通过提取物的CHO细胞转染携带全长Nurr1基因，NOR1，或Nur77的融合于MYC标记蛋白（ 图2）的表达载体的Western印迹分析进一步证实。正如预期的，抗myc antibodies表明每个全长蛋白的表达在其预期的分子量。与ELISA结果一致，蛋白A纯化的Nurr1的特异性抗体鲁棒检测全长Nurr1基因，而且检测NOR1和Nur77的虽然效率较低。与此相反，完全纯化的Nurr1的抗体不通过ELISA或表现出任何可检测的交叉反应性NOR1和Nur77的蛋白质印迹分析。
最后，完全纯化抗体Nurr1的用于丙二醛神经元的免疫组化分析。这是有据可查的Nurr1的，但不是它的同系物接近NOR1与Nur77的，突出表现在啮齿类动物和人类神经元的丙二醛在mRNA和蛋白水平14,15。使用充分精制Nurr1的抗体证实，Nurr1的是几乎完全表达于黑质区丙二醛神经元（ 图3）的核心。
图1：抗Nurr1的抗体的交叉反应之前和通过Nur77的和NOR1个发光二极管耦合柱纯化由通道蛋白A纯化的抗Nurr1的抗体（0.156微克/毫升）（a）之后或蛋白A纯化，随后通过ELISA比较色谱上NOR1和Nur77的LBD-耦合柱抗Nurr1的抗体（0.156微克/毫升）（二）加入到96孔平板的孔用100μl的任Nurr1的LED，NOR1 LBD或Nur77的LBD的2.5微克/毫升。的ELISA法进行如在方法部分中描述。
图2：使用完全纯化的Nurr1的特异性抗体在CHO细胞中特异性检测全长Nurr1的表达全长Nurr1基因，NOR1，和Nur77的蛋白质如myc基因标记表达。融合蛋白在CHO细胞中，并通过Myc蛋白特异性抗体（a）中，蛋白A纯化的Nurr1的抗体（b）和完全纯化的Nurr1的抗体（三）进行检测。用于蛋白质上样对照（四）抗肌动蛋白抗体。每个Myc标签全长DNA（65，66的分子量，和69 kDa的为Nurr1基因，Nur77的，NOR1，分别）瞬时转染的CHO细胞和细胞提取物的相同量在每一泳道中加载。泳道1：阴性对照由转空载体的CHO细胞提取物;泳道2：Myc基因，Nurr1的;泳道3：Myc基因，Nur77的;泳道4：Myc基因-NOR1。
图3：完全纯化的Nurr1的特异性抗体特异性检测酪氨酸羟化酶阳性多巴胺神经元中脑多巴胺神经元在黑质是阳性的Nurr1基因，为e通过使用完全纯化的Nurr1的特异性抗体免疫组织化学xamined。值得注意的是，Nurr1基因定位于丙二醛神经细胞的细胞核中。 TH（酪氨酸羟化酶）。比例尺= 100微米。在白盒合并比例尺为10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
此协议的成功依赖于纯蛋白质的提出对感兴趣的蛋白家族的特定成员的抗体鉴定的可用性。没有必要纯化使用蛋白A / G，直到它被明确规定，有显著交叉反应通过ELISA和Western印迹的抗体。
如文中所述，它避免悬浮蛋白（S）以被交联，以在含胺缓冲液如Tris或甘氨酸列是重要的。此外用于交联的最佳蛋白浓度必须根据经验来确定。太在柱上的蛋白质，可能会导致空间位阻，而太少会降低吸附的效率。因此，这是一个好主意，以测试蛋白浓度范围为2至10毫克/毫升，并评估得到的抗体的质量。
有几个因素必须考虑，当个是技术未能获得高度特异性抗体。这些包括：交联效率，免疫反应域的损失，和交联的蛋白质变性。在协议中规定，监测交联效率允许过多或过少的蛋白质被固定在该列的判定。如果交联使用反应性胺是怀疑通过羧酸基团或通过碳水化合物破坏免疫域，固定化的，应考虑。
它监视程序的效率，以一致地产生高度特异性的抗体是非常重要的。用于再生目的，列必须绑定到使用苛刻的条件（高或低pH）它们的交叉反应抗体的剥离。这将导致交联蛋白质的越来越高百分比的有效改性，降低了塔的性能。
加入在ELISA和Weste阻断剂的RN印迹常用成功的公平程度。然而，在该视频描述的方法增加成功的可能性，并减少了必要保持大量手边的交叉反应性的蛋白质。作为试剂和方法来固定蛋白质层析介质保持不断提高，这种方法将有助于循环转化细胞特异性抗体的鉴定。
这种方法是通过纯蛋白质的可用性的限制。此协议的另一个限制是使用蛋白质结构域时在正确折叠的依赖性。如果蛋白质结构域没有在整个蛋白作为折叠，预吸附的策略可能不会产生抗体分析细胞或组织提取物时，可以容易地识别感兴趣的蛋白质成员。
利益的许多蛋白质属于高氨基酸序列同源性蛋白质（次）家庭。功能特性和iDEN蛋白质的分布的tification往往依靠对每个家庭成员的特异性抗体的可用性。蛋白成员之间在同一个家庭的高氨基酸同源性向困难在产生高度特异性的抗体。使用这些交叉反应性抗体往往会导致矛盾的结果。
一个这样的例子是属于核受体NR4A亚家族，连同Nur77的和NOR1的孤儿核受体Nurr1的。因为这三个因素共享的氨基酸同源性高的程度，抗体针对每个因素表明显著交叉反应，这妨碍各因素的精确分析。
使用这些NR4A构件，例如，有可能产生高度特异性的Nurr1的抗体反应性的分类，以NOR1或Nur77的的。由于个发光二极管共享比该DNA结合结构域的同源性更小，每一种蛋白质的LBD表达并纯化，然后用于我的mProve抗Nurr1的抗体的特异性。最初，抗Nurr1基因的LBD显示交叉反应性的适度但显著水平的其他蛋白，如检测用ELISA和Western印迹分析。然而，当蛋白A纯化的Nurr1的抗体通过预先吸附针对Nur77的和NOR1的交叉反应性的LBD结构域进一步纯化，将得到的Nurr1的抗体没有显示出任何的交叉反应性，如审查通过Western印迹和ELISA分析显着地检测Nurr1的的-expressing DA神经元的脑区。 Western印迹数据和ELISA分析密切相互一致，表明这些分析可以互补，相互支持。
两者合计，该抗体纯化策略将是通过消除交叉反应同源蛋白质成员产生的特异性抗体极为有用。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77 | Column Storage solution | ||
| AminoLink Coupling Resin and Kit | Thermo Scientific | 44890 | |
| Protein A spin column | Thermo Scientific | 89978 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| 96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10% Normal Goat Serum | KPL | 50-675-69 | |
| Milk Diluent/ Blocking Concentrate | KPL | 50-82-01 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23235 | |
| Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | 31460 | |
| Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine | Thermo Scientific | 34028 | |
| 2N H2SO4 | Macron Fine Chemicals | H381 05 | |
| Protein A IgG Binding Buffer | Thermo Scientific | 21001 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Column Storage solution | Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide | ||
| Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing | Spectrum Labs | 132128 | |
| 10 ml Disposable columns | Thermo Scientific | 29924 | |
| AminoLink Coupling Buffer | 0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0 | ||
| Quenching buffer | 1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4 |
||
| Wash Solution | 1M NaCl, 0.05% NaN3 | ||
| ELISA Blocking buffer | 1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent | ||
| Storage Solution | PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide | ||
| Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl |
References
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