Introduction
Transkripsjonsfaktor Nurr1 og dets homologer (Nur77 og Nor1) hører til kjernefysisk reseptorunderfamilien 4A (NR4A) 1. De er også foreldreløs reseptorer fordi deres endogene ligander er ikke identifisert ennå. Nurr1 ble først klonet i 1992, og selv kjent for å være uttrykt i hjernen 2, ble det avgjørende rolle for utvikling og vedlikehold av midthjernen dopaminneuroner avslørt av knockout mus studier 3. I tillegg ble det viktig rolle for opprettholdelse av midthjernen dopaminneuroner nylig demonstrert ved en betinget knockout studie 4. På grunn av disse elegante studier som viser Nurr1 kritiske roller for midthjernen dopaminneuroner, har mange etterfølgende studier i stor grad fokusert på midthjernen dopamin nevroner og dopamin-relaterte nevrodegenerativ lidelse, Parkinsons sykdom (PD) 5.
Spesielt, er Nurr1 uttrykkes ikke bare i midthjernen dopamin (MDA) neuroner, men også på divers hjerneområder 2, noe som tyder på at det kan ha funksjonelle roller i mange ikke-DA områder som er sterkt støttet av flere nyere studier som viser at Nurr1 spiller viktige roller i ulike hjernefunksjoner. For eksempler ble det vist at minnet-induserende aktiviteter som læring, eller andre hippocampus avhengige oppgaver resultere i opp-regulering av Nurr1 ekspresjon i hippocampus 6,7. I tillegg slå ned på Nurr1 uttrykk i hippocampus var tilstrekkelig til å svekke langtidshukommelsen og / eller synaptisk plastisitet 8-11, sterkt antyder at Nurr1 spiller ulike roller i mange hjerneområder. Således, for å forstå den celletypespesifikke og subcellulære ekspresjon av Nurr1 ytterligere, er det ønskelig å anvende Nurr1-spesifikke antistoffer, som ikke oppviser noen kryssreaktivitet med dens homologer Nur77 eller Nor1. Dette notatet beskriver en pre-adsorpsjon protokoll for å generere Nurr1-spesifikke antistoffer og presentere flere data som viser sin spesifisitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Sammensetningen av alle løsninger sitert nedenfor finner du i tabellen Materialer / utstyr.
1. Protein A Column Antistoff Rensing
- Stabil en protein A spinnkolonne og alle nødvendige buffere til romtemperatur i 15 minutter før start av fremgangsmåten.
- Fortynn immunserum 1: 1 med Protein A-IgG bindingsbuffer. (5 ml serum anbefales).
- Bank forsiktig på et protein En spin kolonne på benken toppen for å fjerne kvae som kan fremsettes i hatten. Ta av topplokket og forsiktig smekk av bunnen nedleggelse. Plasser kolonne i en 15 ml oppsamlingsrør og tillate lagringsløsning til avløp.
- Tilsett 5 ml av protein A-IgG-bindingsbuffer og la oppløsningen renne.
- Påfør fortynnet immunserum til kolonnen og samler gjennomstrømning. For best resultat, legg en prøvevolum som inneholder en konsentrasjon av antistoffer mindre enn 80% av kolonnen er antistoff-binding capacity.
- Vask kolonnen med 15 ml av protein A-IgG-bindingsbuffer eller inntil absorbansen ved 280 nm ligger under 0,1.
- Legg 100 mL av nøytralisering Buffer til fem merkede innsamlings rør.
- Tilsett 5 ml av IgG elueringsbuffer til Protein A-kolonnen og samles 1 ml fraksjoner i hvert av rørene inneholdende 100 ul buffer nøytralisering.
- Mål absorbansen av hver fraksjon ved 280 nm og fraksjoner basseng med en absorbans som er større enn 0,5. Hold samlede fraksjoner på is inntil den er klar for dialyse.
- Regenerer kolonnen ved tilsetning av 8 ml av IgG elueringsbuffer og la oppløsningen strømme gjennom kolonnen.
- Rens kolonne med protein A-IgG-bindende oppløsning inntil elueringsmiddel pH tilbake til 7,4.
- Oppbevar kolonnen ved å tilsette 5 ml av lagringsløsning (0,02% natriumazid i PBS). Når ca 3 ml forbli i kolonnen, lue bunn og sikre den øverste cap. Oppbevar kolonnen ved 4 ° C.
- Bestem lengden of dialyserør nødvendig i henhold til produsentens instruksjoner. Ved hjelp av 16 mm flat diameter bruke 5,47 cm rørlengde per ml oppløsning som skal dialyseres. Skjær slangen og vaske med PBS, pH 7,4 i 15 til 30 min.
- Brett og klippet ene ende av dialyserøret, overfører den samlede IgG-inneholdende fraksjoner til dialyserør ekvilibrert i PBS pH 7,4 og lukker den andre enden.
- Dialyser ved romtemperatur mot 200 volumer PBS pH 7,4 i 2 timer.
- Endre dialysebuffer (frisk PBS pH 7,4) og dialyser i ytterligere 2 timer ved romtemperatur.
- Endre dialysebuffer (frisk PBS pH 7,4) og dialyser over natten ved 4 ° C.
- Hold dialyserte antistoffløsning ved 4 ° C inntil de er klare til å fortsette med ytterligere rensetrinn.
- Vurdere antistoffkonsentrasjonen ved hjelp av dets absorbans ved 280 nm og den molare absorpsjonskoeffisient av antistoffer ved 280 nm for 210000 M -1 cm -1 12.
2. Kobling av LBD Proteiner å Aminolink Coupling Resin
- Forbered to kolonner, en for Nor1 og den andre for Nur77. Følge den samme protokoll for begge proteiner.
- Tine proteinet som skal kobles til harpiksen på is. Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av sin molare ekstinksjonskoeffisient og dets absorbans ved 280 nm 12.
- Alternativt kan du bruke en proteinbestemmelse analysen som bicinchoninic syre analysen 13. Hvis proteinet blir løst opp i en aminholdig buffer eller bufferbytte dialyser mot koblingsbuffer. Hvis proteinet er i en egnet buffer (ingen frie aminer) fortynne det fire ganger i koblingsbuffer.
- Bruk 2 ml harpiks for 2 mg protein. Alle trinn som følger er for 2 ml harpiks i en 10 ml kolonne. Opp til 10 mg av protein kan bli koblet per 1 ml harpiks (2 ml av 1: 1 suspensjon).
- Tilbered en 10 ml kolonne ved å skyve en fritte til bunnen og går PBS pH 7,4 gjennom den. Cap tHan bunnen av kolonnen og tilsett 2 ml koblingsbuffer.
- Legg til ønsket volum av slurry (4 ml for å oppnå 2 ml harpiks) til kolonnen, fjernes bunnlokket og avløp søylen la. Rens kolonne med totalt 6 ml (3-harpikssjiktvolum) av koblingsbuffer og tillater søylen å renne. Etter Coupling buffer har drenert, erstatte bunnlokket.
- Legg 2-4 ml protein suspendert i koblingsbuffer til kolonnen (beholde en alikvot av proteinløsningen for å vurdere koblingseffektiviteten ved å sammenligne proteinkonsentrasjonen i eluatet i trinn 2.11 enten ved hjelp av absorbans ved 280 nm eller bicinchoninic assay) . Hetten og bland ende-over-ende for å ha en homogen oppløsning.
- Veie en tom 1,8 ml mikrosentrifugerør og flytte til avtrekkshette. Nøye overføre NaCNBH3 (0,05 g) i pre-veide rør. Lukk røret og veie røret som inneholder NaCNBH3. Ikke åpne røret utenfor panseret.
- Basert på vekten avNaCNBH3 overføres inn i røret, få en 5 M løsning ved tilsetning av 1 M NaOH. Molekylvekten av NaCNBH3 er 62,84 g 0,05 g derfor er lik (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 mol) -4 7,96 x 10 -4 mol. For å gjøre en 5 M løsning add (7,96 x 10 -4/5) 159 mL av 1 M NaOH.
- Mål reaksjonen samlede volum tar harpiksvolum i betraktning. Tilsett 10 ul av 5 M NaCNBH3 per ml av reaksjonen.
- For eksempel: for en 4 ml reaksjonsvolum legge 40 ul 5 M NaCNBH3. For en ml av harpiks og 3 ml tilsatt protein, er det totale volumet 4 ml.
- Cap kolonnen og bland ende over ende. Sikre kolonnen på et rør rotator og la reaksjonen fortsette over natten ved 4 ° C.
- I morgen, bringe kolonnen til kjemisk hette og forsiktig fjerne hetten som noe gass kan ha dannet. Tømme kolonne i et rent rør og lagre eluatet å måle protein consentra hjelp av absorbans ved 280 nm metode 12 eller bicinchoninic syre analysen og sammenligne den med startproteinkonsentrasjonen i trinn 2.6.
- Vask harpiksen med 4 ml koblingsbuffer og avløp søylen la.
3. Blokkere Gjenværende nettsteder
- Vask harpiksen med 4 ml buffer bråkjøling. Hell av vannet og erstatte bunnlokket. Tilsett 2 ml bråkjøling buffer og suspendere harpiksen.
- Vurdere totalt reaksjonsvolum ved å måle harpiksvolum og bråkjølingen buffervolumet deretter legge til 10 ul av 5 M NaCNBH3 per ml reaksjonsvolum.
- Bland forsiktig ved romtemperatur i 30 min ende-over-ende. Etter 30 min bringe kolonnen i avtrekksskap. Fjern forsiktig den øverste og fjern bunnlokket og avløp kolonnen i en avfalls tube utleid.
- Vask kolonnen med 5 volumer av harpiksvaskeløsning. Overvåke vasker for tilstedeværelse av gjenværende proteiner ved måling av eluatet s absorbance ved 280 nm. Ukoblet proteiner blir vasket ut av den høye saltkonsentrasjonen.
- Vask harpiksen med 6 ml avgasset PBS pH 7,4 inneholdende 0,02% natriumazid. Hold kolonnen ved 4 ° C inntil behov.
4. Rensing av Nurr1 spesifikke antistoffer
- Skyll Nur77 LBD kombinert kolonnen med 10 ml PBS pH 7,4 og avløp søylen la. Lokk på bunnen av kolonnen og plassere den drenerte Nur77 LBD koplet kolonne i en ny 15 ml oppsamlingsrør.
- Tilsett 5 ml av protein A-rensede anti-Nurr1 antistoffer, hetten kolonnen og stedet på en rotator ved 4 ° C i 1 time. Fjern de øvre og nedre hetter og samle strømningen gjennom. Sett til side på is inntil klar til å legge til Nor1 LBD kombinert kolonne.
- Skyll Nor1 LBD kombinert kolonnen med 10 ml PBS pH 7,4 og avløp søylen la. Lokk på bunnen av kolonnen og plasser Nor1 LBD koplet kolonne i en 15 ml oppsamlingsrør.
- Legg flyten gjennom fra Nur77 LBD kuppetledet kolonne, hetten kolonnen og stedet på en rotator ved 4 ° C i 1 time. Fjern de øvre og nedre hetter og samle strømningen gjennom.
- Måle antistoffkonsentrasjonen ved å måle absorbansen ved 280 nm.
5. ELISA-basert analyse av Purified Anti-Nurr1 Antistoff
- Tilsett 100 ul protein (2,5 ug / ml) til brønner i en 96-brønners plate. Hvis teste tre ulike proteiner, tilsett 100 mL av protein 1 til brønner A1 til H4, 100 mL av protein 2, til brønner A5 til H8 og 100 mL av protein 3 til brønner A9 til H12. Dekk platen og inkuber over natten ved 4 ° C.
- Vask de belagte brønnene to ganger med 300 ul per brønn av PBS pH 7,4 og tilsett 300 ul av ELISA-blokkeringsbuffer til hele antigen-belagte brønner og inkuber i 2 timer ved romtemperatur.
- Mens platen blokkerer fremstille en ønsket utgangs fortynning av renset anti-Nurr1 antistoff (fra 10 til 100 ug / ml) i ELISA-blokkeringsbuffer.
- Etter 2 timer av blokkering, erstatte ELISA blokk buffer med 100 ul frisk ELISA blokk buffer til alle brønnene.
- Tilsett 100 ul fortynnet renset anti-Nurr1 antistoff til alle brønner i rad A. serielt fortynnet antistoffene ved å overføre 100 ul oppløsning fra rad A til brønnene i rad B, etterfulgt av å overføre 100 ul oppløsning fra rad til rad B C fortsetter nedover til rad G. Etter blanding av løsninger i brønner i rad G forkaste de ekstra 100 mL. Brønner i rad H motta bare de første 100 pl blokkeringsbuffer. Inkuber ved romtemperatur i 1 time.
- Vask platen tre (3) ganger med 300 ul per brønn av 0,05% Tween 20 i PBS pH 7,4 og blot platen for å fjerne overskudd av vaskebuffer.
- Tilsett 100 ul pepperrot-peroksidase (HRP) konjugert geite-anti-kanin-IgG fortynnet i ELISA-blokk-buffer (1: 8000 fortynning, typisk område er fra 1: 5000 til 1: 25.000). Inkuber ved romtemperatur i 1 time.
- Vask platen three (3) ganger som beskrevet under 5.6. Skyll alle brønner ved å fylle dem med 300 ul deionisert vann. Blot overflødig vann ved å snu platen på absorberende papir.
- Tilsett 100 ul av 3, 3 ', 5, 5' tetrametylbenzidin (oppvarmet til romtemperatur) til alle brønner og inkuber 15 til 30 minutter i mørke ved romtemperatur.
- Stopp reaksjonen ved å tilsette 50 ul av 2 NH 2 SO 4.
- Les absorbansen ved 450 nm bakgrunnen er trukket ved 650 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En sammenligning av protein A kolonne renset Nurr1-spesifikke antistoff med protein A-rensede anti-Nurr1 antistoffer etterfulgt av passasje gjennom Nur77 LBD og Nor1 LBD kolonner er vist i figur 1. Som det kan sees, protein A-renset antistoff Nurr1 viste en sterk binding å Nurr1 LBD. Men det viste også betydelig binding til Nur77 LBD og Nor1 LBD. Når Protein A-renset Nurr1 antistoffer ble renset ytterligere mot Nur77 LBD og Nor1 LBD den endelige affinitetsrenset Nurr1 antistoffer oppviste spesifikk binding til Nurr1 LBD med detekterbar binding til Nur77 LBD eller Nor1 LBD, noe som viser at dens kryssreaktivitet til Nur77 og var Nor1 fullstendig fjernet.
Denne spesifisitet ble videre demonstrert ved Western blot-analyse av ekstrakter fra CHO-celle transfektert med ekspresjonsvektorer som bærer hele lengden Nurr1, Nor1, eller Nur77 fusjonert til myc merking protein (figur 2). Som forventet, anti-myc Antibodies avslørte at hver full-lengde protein ble uttrykt ved dens forventede molekylvekt. Etter avtale med ELISA resultatene, Protein A-renset Nurr1 spesifikt antistoff robust oppdaget helaftens Nurr1 men også oppdaget Nor1 og Nur77 men mindre effektivt. I kontrast, gjorde fullt renset Nurr1 antistoff ikke viser noen påviselig kryssreaktivitet å Nor1 og Nur77 ved ELISA eller Western blot analyser.
Til slutt ble den fullstendig rensede Nurr1 antistoff som brukes for immunhistokjemisk analyse av MDA neuroner. Det er godt dokumentert at Nurr1, men ikke dens nære homologene Nor1 og Nur77 en fremtredende uttrykt i gnager og menneskelige MDA nevroner på både mRNA og proteinnivåer 14,15. Bruken av det fullt renset Nurr1 antistoff bekreftet at Nurr1 nesten utelukkende uttrykt i kjernen av MDA nevroner i substantia nigra området (figur 3).
Figur 1: ELISA-sammenligning av kryss-reaktiviteter av anti-antistoffer Nurr1 før og etter rensing ved passasje gjennom Nur77 og Nor1 LBDs koblede kolonner protein A-rensede anti-Nurr1 antistoffer (0,156 ug / ml) (a) eller et renset protein, etterfulgt av. kromatografi på Nor1 og Nur77 LBD-koblede kolonner anti-Nurr1 antistoffer (0,156 ug / ml) (b) ble tilsatt til brønnene i 96-brønners plate belagt med 100 ul 2,5 ug / ml av enten Nurr1 LBD, Nor1 LBD eller Nur77 LBD. ELISA ble utført som beskrevet i metoden delen.
Figur 2: spesifikk påvisning av full-lengde Nurr1 uttrykt i CHO-celler ved hjelp av den fullstendig rensede Nurr1-spesifikke antistoff i full lengde Nurr1, Nor1, og Nur77 proteiner ble uttrykt som myc-merket.fusjonsproteiner i CHO-celler, og som detekteres av myc-spesifikke antistoffer (a) Protein A-renset Nurr1 antistoff (b), og fullstendig renset Nurr1 antistoff (c). Anti-actin-antistoffer anvendt for protein lasting kontrollen (d). Hver Myc-merket full lengde DNA (molekylvekt på 65, 66 og 69 kDa for Nurr1, Nur77, Nor1, respektivt) ble transient transfektert inn i CHO-celler, og den samme mengden av celle-ekstrakter ble påsatt i hvert felt. Felt 1: negativ kontroll bestående av CHO-celler transfektert ekstrakter med en tom vektor; lane 2: Myc-Nurr1; lane 3: Myc-Nur77; lane 4: Myc-Nor1.
Fig. 3: Den fullt rensede Nurr1-spesifikt antistoff som spesifikt gjenkjenner tyrosin-hydroksylase-positive dopaminneuroner midthjernen dopamin nevroner i substantia nigra er positive for Nurr1, som examined ved immunhistokjemi hjelp av fullt rensede Nurr1-spesifikke antistoffer. Spesielt, Nurr1 ble lokalisert i kjernen av MDA neuroner. TH (tyrosinhydroksylase). Scale bar = 100 mikrometer. Scale bar i hvit boks merge er 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Suksessen til denne protokollen er avhengig av tilgjengeligheten av rene proteiner for karakterisering av antistoffer dannet mot et bestemt medlem av proteinfamilie av interesse. Det er ikke nødvendig å rense antistoffene ved å bruke protein A / G inntil det er klart fastslått at det er betydelige kryssreaktiviteter ved ELISA og Western blotting.
Som angitt i teksten, er det viktig å unngå opphenging av protein (er) for å være tverrbundet til søylen i et amin-holdig buffer så som tris og glycin. Videre er den optimale proteinkonsentrasjonen anvendt for tverrbinding må bestemmes empirisk. For mye protein på kolonnen kan føre til sterisk hindring, mens for lite ville redusere effektiviteten til adsorpsjon. Derfor er det en god idé å teste proteinkonsentrasjoner som varierer fra 2 til 10 mg / ml, og for å vurdere kvaliteten av de resulterende antistoffer.
Flere faktorer må vurderes når thTeknikken er ikke klarer å gi høyt spesifikke antistoffer. Disse inkluderer: kryssbinding effektivitet, tap av immunoreaktivt domene, og kryssbundet protein denaturering. Som angitt i protokollen, overvåking kryssbindingseffektivitet muliggjør bestemmelse at for mye eller for lite protein blir immobilisert på kolonnen. Hvis tverrbinding ved hjelp av reaktive aminer som er mistenkt for å ødelegge immunoreaktivt domene (r), immobilisering gjennom karboksylgruppe eller gjennom karbohydrater bør vurderes.
Det er viktig å overvåke effektiviteten av fremgangsmåten for å gi konsekvent høyt spesifikke antistoffer. For regenerering formål, må kolonnene være strippet av kryssreaktive antistoffer bundet til dem ved hjelp av harde betingelser (høy eller lav pH). Dette fører til en stadig høy prosentandel av kryssbundne proteiner for å være effektivt denaturert, ytelse i kolonnen reduseres.
Tilsetting av blokkerende midler i ELISA og Western blotting er ofte brukt med en rimelig grad av suksess. Imidlertid var det som er beskrevet i denne video øker sannsynligheten for suksess, og reduserer behovet for vedlikehold av store mengder av de kryss-reaktive proteiner på hånden. Som reagenser og fremgangsmåter for å immobilisere proteiner kromatografi media holde bedre, vil denne tilnærmingen bidra til identifisering av transformerte celler sirkulerende spesifikke antistoffer.
Denne fremgangsmåten er begrenset av tilgjengeligheten av rene proteiner. En annen begrensning av denne protokollen er avhengigheten av riktig folding når du bruker proteindomener. Hvis proteindomener ikke brett som i hele protein, kan pre-adsorpsjon strategi ikke gi antistoffer som kan lett identifisere protein medlem av interesse når analysere celle eller vevsekstrakter.
Mange proteiner steder og tilhører (sub) familier av proteiner med høy aminosyre sekvenshomologier. Funksjonell karakterisering og Identification av fordelingen av proteiner ofte avhengige av tilgjengeligheten av spesifikke antistoffer mot hvert familiemedlem. Den høye aminosyre homologier mellom protein medlemmer i den samme familien bidra til vanskeligheter i å generere svært spesifikke antistoffer. Ved hjelp av disse kryssreaktive antistoff ofte fører til motstridende resultater.
Ett slikt eksempel er foreldreløs atom reseptoren Nurr1 som tilhører NR4A familien av kjernereseptorer, sammen med Nur77 og Nor1. Siden disse tre faktorene har en høy grad av aminosyrehomologi, antistoffer mot hver faktor viser signifikant kryss reaktiviteter, noe som hindrer nøyaktig analyse av hver faktor.
Ved hjelp av disse NR4A medlemmer som et eksempel, var det mulig å generere svært spesifikke Nurr1 antistoffer gratis reaktiviteter til Nor1 eller Nur77. Siden LBDs dele mindre homologi enn de DNA-bindende domener ble LBD av hvert protein uttrykt og renset, og deretter brukt til å improve spesifisiteten av de anti-Nurr1 antistoffer. Til å begynne med antistoffer mot Nurr1 s LBD oppviste beskjedne, men betydelige nivåer av kryssreaktivitet til andre proteiner, som undersøkt med ELISA og Western blot-analyser. Når imidlertid protein A-renset Nurr1 antistoffer ble ytterligere renset ved pre-adsorpsjon mot kryssreaktive LBD domenene til Nur77 og Nor1, det resulterende Nurr1 antistoff viste ingen kryssreaktivitet, som undersøkt ved Western blot og ELISA analyser av fremtredende detektert Nurr1 -expressing DA nevroner i midthjernen områder. Western blot data og ELISA analyser tett enige med hverandre, noe som indikerer at disse analysene kan være komplementære og støtter hverandre.
Til sammen vil dette antistoffrensing strategien være ekstremt nyttige i å generere et spesifikt antistoff ved å eliminere kryssreaktivitet overfor homologe protein medlemmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77 | Column Storage solution | ||
| AminoLink Coupling Resin and Kit | Thermo Scientific | 44890 | |
| Protein A spin column | Thermo Scientific | 89978 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| 96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10% Normal Goat Serum | KPL | 50-675-69 | |
| Milk Diluent/ Blocking Concentrate | KPL | 50-82-01 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23235 | |
| Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | 31460 | |
| Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine | Thermo Scientific | 34028 | |
| 2N H2SO4 | Macron Fine Chemicals | H381 05 | |
| Protein A IgG Binding Buffer | Thermo Scientific | 21001 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Column Storage solution | Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide | ||
| Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing | Spectrum Labs | 132128 | |
| 10 ml Disposable columns | Thermo Scientific | 29924 | |
| AminoLink Coupling Buffer | 0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0 | ||
| Quenching buffer | 1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4 |
||
| Wash Solution | 1M NaCl, 0.05% NaN3 | ||
| ELISA Blocking buffer | 1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent | ||
| Storage Solution | PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide | ||
| Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl |
References
- Hawk, J. D., Abel, T. The role of NR4A transcription factors in memory formation. Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).
- Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1. Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).
- Zetterström, R. H., et al. Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice. Science. 276 (5310), 248-250 (1997).
- Kadkhodaei, B., et al. Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons. J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).
- Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).
- Peña de Ortiz, S. Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning. Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).
- Vecsey, C. G., et al. Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation. J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).
- Colón-Cesario, W. I., et al. Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory. Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).
- McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).
- Hawk, J. D., et al. NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors. J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).
- Bridi, M. S., Abel, T. The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity. Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
- Smith, P. K., et al.
- Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).
- Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization. Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).
