Introduction
Transkriptionsfaktoren Nurr1 og dens homologer (Nur77 og NOR1) tilhører den nukleare receptor underfamilien 4A (NR4a) 1. De er også orphan-receptorer, fordi deres endogene ligander ikke er identificeret endnu. Nurr1 blev først klonet i 1992 og selvom de er kendt for at blive udtrykt i hjernen 2, var dens afgørende rolle for udvikling og vedligeholdelse af midthjernen dopamin neuroner afsløret ved knockout mus undersøgelser 3. Desuden blev en væsentlig rolle for vedligeholdelse af midthjernen dopamin neuroner nylig påvist af en betinget knockout undersøgelse 4. På grund af disse elegante undersøgelser, der viser Nurr1 kritiske roller for midthjernen dopamin neuroner, har mange efterfølgende undersøgelser vid udstrækning fokuseret på midthjernen dopamin neuroner og dopamin-relateret neurodegenerativ lidelse, Parkinsons sygdom (PD) 5.
Især er Nurr1 udtrykkes ikke kun i de midthjernen dopamin (MDA) neuroner, men også i divers hjerneområder 2, hvilket tyder på, at det kan have funktionelle roller i mange ikke-DA områder, som er stærkt støttet af nyere undersøgelser, der viser, at Nurr1 spiller vigtige roller i forskellige hjernefunktioner. For eksempler, blev det vist, at hukommelsen-fremkaldende aktiviteter såsom læring eller andre hippocampus-afhængige opgaver resulterer i opregulering af Nurr1 udtryk i hippocampus 6,7. Desuden vælte af Nurr1-ekspression i hippocampus var tilstrækkelig til at forringe langtidshukommelse og / eller synaptisk plasticitet 8-11, hvilket kraftigt antyder, at Nurr1 spiller forskellige roller i mange områder i hjernen. Således, at yderligere at forstå celle-typespecifikke og subcellulære ekspression af Nurr1, er det ønskeligt at anvende Nurr1-specifikke antistoffer, der ikke udviser nogen krydsreaktivitet med dens homologer Nur77 eller NOR1. Dette papir beskriver en pre-adsorption-protokol til at generere Nurr1-specifikke antistoffer og nuværende yderligere data, der viser dens specificitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Sammensætningen af alle løsninger citeret nedenfor kan findes i Materialer / udstyr Table.
1. Protein A Kolonne antistofoprensning
- Ækvilibrer en protein A centrifugesøjle og alle de nødvendige buffere til stuetemperatur i 15 minutter før start af proceduren.
- Fortynd immunserum 1: 1 med Protein A IgG Binding Buffer. (5 ml serum anbefales).
- Bank forsigtigt på en protein A spinkolonne på bænken toppen for at løsne eventuelle harpiks, der kan indgives i hætten. Fjern det øverste låg og forsigtigt bræk den nederste lukning. Kolonnen anbringes i et 15 ml opsamlingsrør og tillade opbevaring opløsningen løbe.
- Der tilsættes 5 ml protein A IgG Bindende Buffer og lad opløsningen løbe.
- Påfør den fortyndede immunserum til søjlen og indsamle gennemløbet. For de bedste resultater, skal du tilføje et prøvevolumen, som indeholder en koncentration af antistoffer mindre end 80% af kolonnens antistof-bindende capacity.
- Kolonnen udvaskes med 15 ml protein A IgG Binding Buffer eller indtil absorbansen ved 280 nm er under 0,1.
- Tilføj 100 ul Neutralisering Buffer til fem mærkede rør indsamling.
- Der tilsættes 5 ml IgG elueringspuffer til Protein A-søjle og indsamle 1 ml fraktioner i hvert af de rør, der indeholder de 100 pi neutraliseringsbuffer.
- Absorbansen af hver fraktion ved 280 nm og pool fraktioner med en absorbans større end 0,5. Hold samlede fraktioner på is indtil klar til dialyse.
- Regenerere kolonnen ved tilsætning 8 ml IgG Elution Buffer og lad opløsningen strømme gennem søjlen.
- Søjlen skylles med protein A-IgG Binding opløsning, indtil eluent pH tilbage til 7,4.
- Kolonnen opbevares ved tilsætning af 5 ml af storage-opløsning (0,02% natriumazid i PBS). Når ca. 3 ml forbliver i søjlen, cap bund og fastgør den øverste hætte. Opbevar søjlen ved 4 ° C.
- Bestem længden of dialyserør nødvendig i henhold til producentens anvisninger. Ved hjælp af 16 mm flad diameter slange bruge 5.47 cm slange længde pr ml opløsning skal dialyseres. Skær slangen og skylles med PBS pH 7,4 i 15 til 30 min.
- Fold og klip den ene ende af dialyserør, overføre den poolede IgG fraktioner til dialyserør ækvilibreret i PBS pH 7,4 og lukke den anden ende.
- Dialyse ved stuetemperatur mod 200 volumener PBS pH 7,4 i 2 timer.
- Ændre dialysebufferen (frisk PBS pH 7,4) og dialyseres i yderligere 2 timer ved stuetemperatur.
- Ændre dialysebufferen (frisk PBS pH 7,4) og dialyseres natten over ved 4 ° C.
- Holde den dialyserede antistofopløsning ved 4 ° C indtil den er klar til at gå videre med yderligere oprensningstrin.
- Vurdere antistofkoncentrationen hjælp dets absorbans ved 280 nm og den molære absorptionskoefficient af antistoffer ved 280 nm på 210.000 M-1 cm-1 12.
2. Kobling af LBD Proteiner til Aminolink Coupling Resin
- Forbered to kolonner, en for NOR1 og den anden for Nur77. Følg samme protokol for begge proteiner.
- Tø proteinet, der skal kobles til resinen på is. Bestemme proteinkoncentrationen ved hjælp af sin molær ekstinktionskoefficient og dens absorbans ved 280 nm 12.
- Alternativt kan du bruge et protein beslutsomhed assay såsom det bicinchoninsyre assay 13. Hvis proteinet opløses i en aminholdig buffer dialysemoden eller bufferudskiftning mod koblingsbuffer. Hvis proteinet er i en passende buffer (ingen frie aminer) fortynde det 4 gange i koblingsbuffer.
- Bruge 2 ml harpiks til 2 mg protein. Alle efterfølgende trin er for 2 ml harpiks i en 10 ml søjle. Kan forbindes op til 10 mg protein pr 1 ml harpiks (2 ml 1: 1 opslæmning).
- Der fremstilles en 10 ml søjle ved at skubbe en fritte til bunden og kører PBS pH 7,4 gennem det. Cap tHan bunden af kolonnen og tilsæt 2 ml Coupling Buffer.
- Tilføj den ønskede mængde gylle (4 ml for at opnå 2 ml harpiks) til søjlen, fjerner bunden hætte og lad kolonnen drænet. Søjlen skylles med i alt 6 ml (3 harpiks-bed volumen) Kobling Buffer og tillade kolonnen til afløb. Efter Coupling bufferen er tømt, skal du udskifte den nederste hætte.
- Tilsættes 2-4 ml protein suspenderet i koblingsbuffer til kolonnen (holde en portion af proteinopløsningen at vurdere koblingseffektiviteten ved at sammenligne proteinkoncentrationen af eluatet i trin 2.11 under anvendelse af enten absorbansen ved 280 nm eller den bicinchoninic assay) . Cap og bland ende over ende at have en homogen opløsning.
- En tom 1,8 ml mikrocentrifugerør afvejes og flytte til stinkskabet. Overføre omhyggeligt NaCNBH3 (ca. 0,05 g) i præ-afvejede rør. Glasset lukkes og vejes røret med NaCNBH3. Åbn ikke slangen uden hætten.
- Baseret på vægten afNaCNBH3 overført ind i røret, lave en 5 M opløsning ved tilsætning af 1 M NaOH. Molekylvægten af NaCNBH3 er 62.84 g derfor 0,05 g er lig med (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 -4 mol) 7,96 x 10 -4 mol. For at gøre en 5 M opløsning add (7,96 x 10 -4 / 5) 159 ul 1 M NaOH.
- Måle reaktionen samlede volumen tager harpiksen volumen i betragtning. Tilsæt 10 pi af 5 M NaCNBH3 pr ml reaktion.
- For eksempel: for en 4 ml reaktion volumen tilsættes 40 pi 5 M NaCNBH3. For 1 ml harpiks og 3 ml tilsat protein, det samlede volumen er 4 ml.
- Cap søjlen og bland ende over ende. Fastgør kolonne på et rør rotator og lad reaktionen fortsætte natten over ved 4 ° C.
- Om morgenen, bringe kolonnen til kemiske hætte og fjern forsigtigt hætten som nogle gas kan have dannet. Dræne kolonnen til et rent rør og gemme eluatet til at måle protein concentrering ved hjælp af absorbansen ved 280 nm metode 12 eller bicinchoninsyre assay og sammenligne den med den begyndende proteinkoncentration i trin 2.6.
- Vask harpiksen med 4 ml Kobling Buffer og lad kolonnen drænet.
3. Blokering Resterende steder
- Vask harpiksen med 4 ml quenching puffer. Hæld vandet fra og erstatte den nederste hætte. Der tilsættes 2 ml quenching buffer og suspendere harpiksen.
- Vurdere den samlede reaktion volumen ved at måle resin volumen og buffervolumenet quenching derefter tilføje 10 pi af 5 M NaCNBH3 pr ml reaktion volumen.
- Bland forsigtigt ved stuetemperatur i 30 min ende-over-ende. Efter 30 minutter bringe kolonnen i stinkskab. Fjern forsigtigt toppen og derefter fjerne den nederste hætte og lad kolonnen afløb i et spild rør.
- Kolonnen udvaskes med 5 harpiksvolumener af Wash løsning. Overvåg vaskene for tilstedeværelsen af resterende proteiner ved måling eluatet er absorbance ved 280 nm. Ukoblede proteiner udvaskes af den høje saltkoncentration.
- Vask harpiksen med 6 ml afgasset PBS pH 7,4 indeholdende 0,02% natriumazid. Holde søjlen ved 4 ° C indtil brug.
4. Oprensning af Nurr1 specifikke antistoffer
- Skyl Nur77 LBD koblet kolonne med 10 ml PBS pH 7,4, og lade kolonnen drænet. Cap bunden af kolonnen og placere den drænede Nur77 LBD koblet kolonne i et ny 15 ml opsamlingsrør.
- Der tilsættes 5 ml protein A-oprenset anti-Nurr1 antistoffer, cap søjlen og sted på en rotator ved 4 ° C i 1 time. Fjern de øverste og nederste hætter og indsamle gennemstrømningen. Braklægning på is indtil klar til at tilføje til NOR1 LBD koblede kolonne.
- Skyl NOR1 LBD koblet kolonne med 10 ml PBS pH 7,4, og lade kolonnen drænet. Cap bunden af kolonnen og placer NOR1 LBD koblet kolonne i et 15 ml opsamlingsrør.
- Tilføj gennemstrømningen fra Nur77 LBD kupførte kolonne, cap søjlen og sted på en rotator ved 4 ° C i 1 time. Fjern de øverste og nederste hætter og indsamle gennemstrømningen.
- Måle antistofkoncentrationen ved måling af absorbansen ved 280 nm.
5. ELISA-baseret analyse af renset Anti-Nurr1 antistof
- Tilsættes 100 pi protein (2,5 ug / ml) til brøndene i en plade med 96 brønde. Hvis teste 3 forskellige proteiner, tilsættes 100 ul protein 1 til hul A1 til H4, 100 pi protein 2, til brønde A5 til H8 og 100 pi af protein 3 til brønde A9 til H12. Dæk pladen og inkuber natten over ved 4 ° C.
- Vask de coatede brønde to gange med 300 pi per brønd PBS pH 7,4, og der tilsættes 300 pi ELISA blokerende buffer til hele antigen-coatede brønde og inkuber 2 timer ved stuetemperatur.
- Mens pladen blokerer forberede en ønsket begyndende fortynding af oprenset anti-Nurr1-antistof (fra 10 til 100 ug / ml) i ELISA blokeringsbuffer.
- Efter 2 timer af blokering, udskift ELISA blok buffer med 100 ul frisk ELISA blok buffer til alle brønde.
- Tilsættes 100 pi fortyndet oprenset anti-Nurr1-antistof til alle brønde i række A. Serielt fortyndede antistofferne ved at overføre 100 pi opløsning fra række A til brøndene i række B efterfulgt af overføre 100 pi opløsning fra række til række B C fortsatte ned til række G. Efter blanding af løsninger i brønde i række G kassere de ekstra 100 pi. Brønde i række H kun modtager de første 100 pi blokeringspuffer. Der inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
- Vask pladen tre (3) gange med 300 pi pr brønd af 0,05% Tween 20 i PBS pH 7,4 og duppes pladen for at fjerne overskydende vaskebuffer.
- Tilsættes 100 pi peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret gede anti-kanin IgG fortyndet i ELISA-blok-buffer (1: 8.000 fortynding; den typisk område er fra 1: 5.000 til 1: 25.000). Der inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
- Vask pladen three (3) gange som beskrevet i 5.6. Skyl alle brønde ved at fylde dem med 300 pi deioniseret vand. Aftryk overskydende vand ved at vende pladen oven på absorberende papir.
- Tilsættes 100 pi 3, 3 ', 5, 5' tetramethylbenzidin (opvarmet til stuetemperatur) til alle brønde og inkuber 15 til 30 minutter i mørke ved stuetemperatur.
- Reaktionen standses ved tilsætning af 50 pi 2 NH 2 SO 4.
- Læs absorbans ved 450 nm subtraktionsorganernes baggrund ved 650 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En sammenligning af Protein A-søjle oprenset Nurr1-specifikke antistoffer med protein A-oprenset anti-Nurr1-antistoffer efterfulgt af passage gennem Nur77 LBD og NOR1 LBD kolonnerne er vist i figur 1. Som det kan ses, Protein A-oprenset Nurr1-antistof udviste en stærk binding til Nurr1 LBD. Men det viste også signifikant binding til Nur77 LBD og NOR1 LBD. Når protein A-oprenset Nurr1 antistoffer blev yderligere oprenset mod Nur77 LBD og NOR1 LBD, den endelige affinitetsoprenset Nurr1 antistoffer udviste specifik binding til Nurr1 LBD med målbart binding til Nur77 LBD eller NOR1 LBD, hvilket viser, at dets krydsreaktivitet med Nur77 og NOR1 var helt fjernet.
Denne specificitet blev yderligere demonstreret ved Western blot analyse af ekstrakter fra CHO-celle transficeret med ekspressionsvektorer, der bærer fuld længde Nurr1, NOR1 eller Nur77 fusioneret til myc-tagging protein (figur 2). Som forventet anti-myc ANTIBodies afslørede, at hvert protein i fuld længde blev udtrykt ved dets forventede molekylvægt. Efter aftale med resultaterne ELISA, protein A-oprenset Nurr1 specifikt antistof håndfast opdaget fuld længde Nurr1 men også opdaget NOR1 og Nur77 selvom mindre effektivt. I modsætning hertil den fuldt oprensede Nurr1 antistof ikke udviser nogen detekterbar krydsreaktivitet med NOR1 og Nur77 ved ELISA eller Western blot-analyser.
Endelig blev fuldt oprenset Nurr1 anvendte antistof til immunhistokemisk analyse af MDA neuroner. Det er veldokumenteret, at Nurr1, men ikke dens tætte homologer NOR1 og Nur77, er tydeligt til udtryk i gnavere og menneskelige MDA neuroner på både mRNA og protein niveauer 14,15. Anvendelsen af den fuldt oprenset Nurr1-antistof bekræftede, at Nurr1 næsten udelukkende udtrykkes i kernen MDA neuroner i substantia nigra område (figur 3).
Figur 1: ELISA sammenligning af krydsreaktiviteter af anti-Nurr1-antistoffer før og efter oprensning ved passage gennem Nur77 og NOR1 LBD'er koblede kolonner protein A-oprenset anti-Nurr1-antistoffer (0,156 ug / ml) (a) eller protein A-oprenset efterfulgt af. chromatografi på NOR1 og Nur77 LBD-koblede kolonner anti-Nurr1-antistoffer (0,156 ug / ml) (b) blev tilsat til brøndene i 96-brønds plade overtrukket med 100 pi 2,5 ug / ml af enten Nurr1 LBD, NOR1 LBD eller Nur77 LBD. ELISA blev udført som beskrevet i metodeafsnittet.
Figur 2: Specifik påvisning af fuld længde Nurr1 udtrykt i CHO-celler ved hjælp af den fuldt oprensede Nurr1-specifikt antistof i fuld længde Nurr1 blev NOR1, og Nur77 proteiner udtrykt som myc tagged.fusionsproteiner i CHO-celler og detekteret ved Myc specifikke antistoffer (a) protein A-oprenset Nurr1 antistof (b), og fuldt oprenset Nurr1 antistof (c). Anti-actin antistoffer anvendt for protein ladningskontrol (d). Hver Myc-mærkede fuldlængde DNA (molekylvægt på 65, 66 og 69 kDa for Nurr1, Nur77, NOR1 henholdsvis) blev transient transficeret ind i CHO-celler og den samme mængde celleekstrakter blev påført i hver bane. Bane 1: negativ kontrol bestående af CHO-celler ekstrakter transficeret med en tom vektor; bane 2: Myc-Nurr1; bane 3: Myc-Nur77; bane 4: Myc-NOR1.
Figur 3:. Den fuldt oprensede Nurr1-specifikt antistof påviser specifikt tyrosin-hydroxylase-positive dopaminneuroner midthjernen dopamin neuroner i substantia nigra er positive for Nurr1, som examined ved immunhistokemi under anvendelse af de fuldt oprensede Nurr1-specifikke antistoffer. Især blev Nurr1 lokaliseret i kernen MDA neuroner. TH (tyrosin hydroxylase). Målestok = 100 um. Scale bar i hvid kasse merge er 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Succesen med denne protokol er afhængig af tilgængeligheden af rene proteiner til karakterisering af antistoffer mod et bestemt medlem af proteinet familien af interesse. Der er ikke behov for at oprense antistoffer ved anvendelse af protein A / G, indtil det er klart, at der er betydelige krydsreaktiviteter ved ELISA og Western blotting.
Som anført i teksten, er det vigtigt at undgå suspension af protein (er) til at være tværbundet til søjlen i en aminholdig puffer, såsom Tris eller glycin. Endvidere den optimale proteinkoncentration, der anvendes til tværbinding skal bestemmes empirisk. For meget protein på søjlen kunne resultere i sterisk hindring, medens for lidt vil reducere effektiviteten af adsorptionen. Derfor er det en god ide at teste protein- koncentrationer i området fra 2 til 10 mg / ml og til at vurdere kvaliteten af de resulterende antistoffer.
Flere faktorer skal overvejes, når ther teknik ikke give meget specifikke antistoffer. Disse omfatter: tværbinding effektivitet, tab af immunoreaktivt domæne, og tværbundet proteindenaturering. Som anført i protokollen, overvågning tværbindingseffektivitet muliggør bestemmelse, at for meget eller for lidt protein bliver immobiliseret på søjlen. Hvis tværbinding under anvendelse reaktive aminer er mistænkt for at ødelægge immunreaktive domæne (r), immobilisering gennem carboxylgruppen eller gennem kulhydrater bør overvejes.
Det er vigtigt at overvåge effektiviteten af proceduren til konsekvent opnåelse meget specifikke antistoffer. Til restitution formål, skal søjlerne være frataget de krydsreaktive antistoffer bundet til dem ved hjælp af barske betingelser (høj eller lav pH). Dette forårsager en stadig høj procentdel af tværbundne proteiner kan blive effektivt denatureres, hvilket reducerer kolonnens præstationer.
Tilsætningen af blokerende midler i ELISA og Western blotting er almindeligt anvendt med en fair niveau af succes. Men den fremgangsmåde, der er beskrevet i denne video øger sandsynligheden for succes og reducerer behovet for vedligeholdelse af store mængder af de krydsreaktive proteiner på hånden. Da reagenser og fremgangsmåder til at immobilisere proteiner chromatografi medier holde forbedring vil denne fremgangsmåde bidrage til identifikationen af cirkulerende transformerede celler specifikke antistoffer.
Denne fremgangsmåde er begrænset af tilgængeligheden af rene proteiner. En anden begrænsning ved denne protokol er afhængigheden af korrekt foldning ved brug proteindomæner. Hvis proteinet domæner ikke foldes som i hele proteinet, kan præ-adsorption strategi ikke give antistoffer, som let kan identificere proteinet medlem af interesse, når der analyseres celle- eller vævsekstrakter.
Mange proteiner af interesse tilhører (under) familier af proteiner med høj amino acid sekvenshomologier. Funktionel karakterisering og idenkation af fordelingen af proteiner er ofte afhængige af tilgængeligheden af specifikke antistoffer mod hvert familiemedlem. De høje aminosyre homologier mellem protein medlemmer i samme familie bidrager til vanskelighederne ved generering højspecifikke antistoffer. Ved anvendelse af disse krydsreaktive antistoffer ofte føre til modstridende resultater.
Et sådant eksempel er den forældreløse nukleare receptor Nurr1 der hører til NR4a underfamilien af nukleare receptorer, sammen med Nur77 og NOR1. Da disse tre faktorer deler en høj grad af aminosyrehomologi, antistoffer mod hver faktor signifikante cross reaktiviteter, som vanskeliggør præcis analyse af de enkelte faktorer.
Under anvendelse af disse NR4a medlemmer som et eksempel, var det muligt at generere meget specifikke Nurr1 antistoffer fri for reaktiviteter til NOR1 eller Nur77. Da LBD'erne deler mindre homologi end det DNA-bindende domæner blev LBD af hvert protein udtrykt og oprenset og derefter anvendt til at jegmprove specificiteten af de anti-Nurr1 antistoffer. I første omgang, antistoffer mod Nurr1 s LBD udstillet beskedne, men signifikante niveauer af krydsreaktivitet med de andre proteiner, som undersøges ved ELISA og Western blot-analyser. Men når protein A-oprenset Nurr1 antistoffer blev yderligere oprenset via pre-adsorption mod krydsreaktive LBD domæner af Nur77 og NOR1 det resulterende Nurr1-antistoffet viste ingen krydsreaktivitet, som undersøges ved Western blot og ELISA-analyser af fremtrædende detekteret Nurr1 udtrykkende DA neuroner i midthjernen områder. Western blot data og ELISA analyser tæt enige med hinanden, hvilket indikerer, at disse analyser kan være et supplement og støtte hinanden.
Tilsammen vil dette antistof oprensning strategi være yderst nyttig i generering af et specifikt antistof ved at fjerne krydsreaktivitet til homologe protein medlemmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77 | Column Storage solution | ||
| AminoLink Coupling Resin and Kit | Thermo Scientific | 44890 | |
| Protein A spin column | Thermo Scientific | 89978 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| 96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10% Normal Goat Serum | KPL | 50-675-69 | |
| Milk Diluent/ Blocking Concentrate | KPL | 50-82-01 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23235 | |
| Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | 31460 | |
| Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine | Thermo Scientific | 34028 | |
| 2N H2SO4 | Macron Fine Chemicals | H381 05 | |
| Protein A IgG Binding Buffer | Thermo Scientific | 21001 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Column Storage solution | Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide | ||
| Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing | Spectrum Labs | 132128 | |
| 10 ml Disposable columns | Thermo Scientific | 29924 | |
| AminoLink Coupling Buffer | 0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0 | ||
| Quenching buffer | 1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4 |
||
| Wash Solution | 1M NaCl, 0.05% NaN3 | ||
| ELISA Blocking buffer | 1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent | ||
| Storage Solution | PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide | ||
| Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl |
References
- Hawk, J. D., Abel, T. The role of NR4A transcription factors in memory formation. Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).
- Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1. Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).
- Zetterström, R. H., et al. Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice. Science. 276 (5310), 248-250 (1997).
- Kadkhodaei, B., et al. Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons. J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).
- Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).
- Peña de Ortiz, S. Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning. Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).
- Vecsey, C. G., et al. Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation. J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).
- Colón-Cesario, W. I., et al. Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory. Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).
- McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).
- Hawk, J. D., et al. NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors. J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).
- Bridi, M. S., Abel, T. The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity. Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
- Smith, P. K., et al.
- Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).
- Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization. Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).
