Introduction
El factor de transcripción Nurr1 y sus homólogos (Nur77 y NOR1) pertenecen a la subfamilia de receptores nucleares 4A (NR4A) 1. También son receptores huérfanos porque sus ligandos endógenos no son identificados todavía. Nurr1 se clonó por primera vez en 1992 y aunque sabe que se expresa en el cerebro 2, su papel esencial para el desarrollo y mantenimiento de las neuronas de dopamina del cerebro medio fue revelado por estudios de ratones knockout 3. Además, su importante papel para el mantenimiento de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo se demostró recientemente por un estudio knockout condicional 4. Debido a estos estudios elegantes que muestran papeles críticos de Nurr1 para las neuronas de dopamina del cerebro medio, muchos estudios posteriores se han centrado en gran medida en el cerebro medio neuronas de dopamina y trastorno neurodegenerativo relacionada con la dopamina, enfermedad de Parkinson (PD) 5.
Notablemente, Nurr1 se expresa no sólo en las neuronas de dopamina del cerebro medio (MDA), sino también en diáreas cerebrales versículo 2, lo que sugiere que puede tener un papel funcional en muchas áreas no-DA, que está fuertemente apoyadas por estudios más recientes muestran que Nurr1 juega un papel importante en varias funciones cerebrales. Para ejemplos, se demostró que las actividades de inducción de memoria tales como el aprendizaje, u otras tareas dependiente del hipocampo da lugar a la regulación de la expresión de Nurr1 en el hipocampo 6,7. Además, derribar de expresión Nurr1 en el hipocampo fue suficiente para afectar la memoria a largo plazo y / o la plasticidad sináptica 8-11, lo que sugiere fuertemente que Nurr1 juega diversos papeles en muchas áreas del cerebro. Por lo tanto, para entender mejor la expresión de tipo celular específico y subcelular de Nurr1, es deseable usar anticuerpos-Nurr1 específico, que no presentan ninguna reactividad cruzada con sus homólogos Nur77 o NOR1. En este trabajo se describe un protocolo pre-adsorción para generar anticuerpos Nurr1 específica y presentar datos adicionales que muestran su especificidad.
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Protocol
Nota: La composición de todas las soluciones citadas a continuación se puede encontrar en la Tabla de Materiales / Equipo.
1. columna de proteína A Purificación de anticuerpos
- Equilibrar una proteína de una columna de centrifugación y todos los tampones necesarios a temperatura ambiente durante 15 min antes de iniciar el procedimiento.
- Diluir el suero inmune 1: 1 con Proteína A IgG Binding Buffer. (Se recomienda 5 ml de suero).
- Golpee suavemente una columna de proteína vuelta en la mesa de trabajo para desalojar cualquier resina que puede ser alojada en la tapa. Retire la tapa superior y coloque suavemente el cierre inferior. Colocar la columna en un tubo de recogida de 15 ml y permita que la solución de almacenamiento para drenar.
- Añadir 5 ml de Proteína A IgG Binding Buffer y permita que la solución drene.
- Aplicar el suero inmune diluido a la columna y recoger el flujo a través. Para obtener los mejores resultados, añadir un volumen de muestra que contiene una concentración de anticuerpos de menos de 80% de la unión del anticuerpo-capacit de la columnay.
- Lavar la columna con 15 ml de Proteína A IgG Binding Buffer o hasta que la absorbancia a 280 nm es inferior a 0,1.
- Añadir 100 l de tampón de neutralización a cinco tubos de recogida etiquetados.
- Añadir 5 ml de tampón de elución de IgG a la columna de Proteína A y recoger fracciones de 1 ml en cada uno de los tubos que contienen los 100 l de tampón de neutralización.
- Medir la absorbancia de cada fracción a 280 nm y las fracciones de la piscina con una absorbancia mayor que 0.5. Mantenga las fracciones agrupadas en hielo hasta que esté listo para la diálisis.
- Regenerar la columna mediante la adición de 8 ml de IgG tampón de elución y permita que la solución fluya a través de la columna.
- Lavar la columna con una solución de proteína de unión Una IgG hasta que el pH eluyente vuelve a 7.4.
- Almacenar la columna mediante la adición de 5 ml de solución de almacenamiento (azida de sodio 0,02% en PBS). Cuando aproximadamente 3 ml permanecen en la columna, la tapa inferior y asegurar la tapa superior. Guarde la columna a 4 ° C.
- Determinar la longitud otubos de diálisis f necesario de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El uso de tubos de 16 mm de diámetro plana usar 5,47 cm de longitud del tubo por ml de solución que se dializa. Corte el tubo y enjuagar con PBS pH 7,4 durante 15 a 30 min.
- Doblar y el clip un extremo del tubo de diálisis, transferir la IgG reunidas que contienen fracciones a tubos de diálisis equilibrada en PBS pH 7,4 y cerrar el otro extremo.
- Se dializa a temperatura ambiente contra 200 volúmenes de PBS pH 7,4 durante 2 h.
- Cambiar el tampón de diálisis (fresco PBS pH 7,4) y se dializa durante otras 2 horas a temperatura ambiente.
- Cambiar el tampón de diálisis (fresco PBS pH 7,4) y se dializa durante la noche a 4 ° C.
- Mantener la solución de anticuerpo dializada a 4 ° C hasta que esté listo para proceder con etapas de purificación adicionales.
- Evaluar la concentración de anticuerpo utilizando su absorbancia a 280 nm y el coeficiente de absorción molar de anticuerpos a 280 nm de 210.000 M -1 cm -1 12.
2. Acoplamiento de LBD proteínas para Aminolink Acoplamiento Resina
- Prepare dos columnas, una para NOR1 y el otro para Nur77. Siga el mismo protocolo para ambas proteínas.
- Descongelar la proteína que se acopla a la resina en hielo. Determinar la concentración de proteína usando su coeficiente de extinción molar y su absorbancia a 280 nm 12.
- Alternativamente, utilizar un ensayo de determinación de proteínas tales como el ensayo de 13 ácido bicinconínico. Si la proteína se disuelve en un intercambio de Diálisis tampón que contiene amina o tampón contra el enganche de tope. Si la proteína es en un tampón adecuado (no hay aminas libres) diluirlo 4 veces en tampón de acoplamiento.
- Utilice 2 ml de resina para 2 mg de proteína. Todos los pasos que siguen son para la resina de 2 ml en una columna de 10 ml. Hasta 10 mg de proteína puede ser vinculado por 1 ml de resina (2 ml de 1: 1 de suspensión).
- Preparar una columna de 10 ml empujando una frita a la parte inferior y funcionando PBS pH 7,4 a través de él. Cap tél parte inferior de la columna y añadir 2 ml de Coupling Buffer.
- Añadir el volumen deseado de suspensión (4 ml para obtener 2 ml de resina) a la columna, retire la tapa inferior y dejar que el drenaje de la columna. Lavar la columna con un total de 6 ml (volumen 3 de resina de lecho) de acoplamiento de búfer y permitir que la columna se drene. Después de que el tampón de acoplamiento ha drenado, coloque la tapa inferior.
- Añadir 2-4 ml de proteína en suspensión en tampón de acoplamiento a la columna (mantener una alícuota de la solución de proteína para evaluar la eficiencia de acoplamiento mediante la comparación de la concentración de proteína del eluato en el paso 2.11 utilizando la absorbancia a 280 nm o el ensayo bicinconínico) . Tapar y mezclar de punta a punta para tener una solución homogénea.
- Pesar un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml vacío y pasar a la campana de humos. Transferir cuidadosamente NaCNBH3 (aproximadamente 0,05 g) en el tubo pesado previamente. Cerrar el tubo y pesar el tubo que contiene NaCNBH3. No abra el tubo fuera del capó.
- Basado en el peso deNaCNBH3 transferido en el tubo, hacer una solución 5 M mediante la adición de 1 M NaOH. El peso molecular de NaCNBH3 es 62,84 g, por lo tanto 0.05 g es igual a (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 -4 moles) 7,96 x 10 -4 moles. Para hacer una solución add 5 M (7,96 x 10 -4/5) 159 l de 1 M NaOH.
- Medir el volumen total de la reacción que tiene el volumen de resina en consideración. Añadir 10 l de 5 M NaCNBH3 por ml de reacción.
- Por ejemplo: para un volumen de reacción 4 ml añadir 40 l de 5 M NaCNBH3. Para 1 ml de resina y 3 ml de proteína añadida, el volumen total es de 4 ml.
- Tape la columna y la mezcla de punta a punta. Asegure la columna en un rotador tubo y dejar que la reacción continúe durante la noche a 4 ° C.
- Por la mañana, llevar la columna a la campana química y cuidadosamente quite la tapa como un poco de gas puede haberse formado. Escurrir la columna en un tubo limpio y guardar el eluido para medir la concentración de proteínacentración mediante la absorbancia a 280 nm Método 12 o el ensayo de ácido bicinconínico y compararla con la concentración de proteína de partida en el paso 2.6.
- Lavar la resina con 4 ml de acoplamiento Buffer y dejar que la fuga de la columna.
3. Sitios Bloqueo restante
- Lavar la resina con 4 ml de tampón de enfriamiento. Escurra y coloque la tapa inferior. Añadir 2 ml de tampón de extinción y suspensión de la resina.
- Evaluar el volumen total de reacción midiendo el volumen de resina y el volumen de tampón de temple a continuación, añadir 10 l de 5 M NaCNBH3 por ml de volumen de reacción.
- Mezclar suavemente a temperatura ambiente durante 30 min de extremo a extremo. Después de 30 min, traer la columna en la campana de humos. Retire con cuidado la tapa y retire la tapa inferior y dejar que la fuga de la columna en un tubo de residuos.
- Lavar la columna con 5 volúmenes de resina de solución de lavado. Monitorear los lavados para la presencia de proteínas residuales mediante la medición de abso del eluatorbance a 280 nm. Proteínas desacopladas se lavan a cabo por la alta concentración de sal.
- Lavar la resina con 6 ml de desgasificado PBS pH 7,4 que contiene azida de sodio al 0,02%. Mantenga la columna a 4 ° C hasta que se necesite.
4. Purificación de Nurr1 anticuerpos específicos
- Enjuague la columna junto Nur77 LBD con 10 ml de PBS pH 7,4 y dejar que la fuga de la columna. Tapar el fondo de la columna y colocar el Nur77 LBD columna junto drenado en un nuevo tubo de recogida de 15 ml.
- Añadir 5 ml de proteína A anticuerpos anti-Nurr1 purificados, limitar la columna y colocar en un rotador a 4 ° C durante 1 hora. Retire las tapas superior e inferior y recoger el flujo a través. Ponga a un lado en el hielo hasta que esté listo para agregar a la columna junto NOR1 LBD.
- Enjuague la columna junto NOR1 LBD con 10 ml de PBS pH 7,4 y dejar que la fuga de la columna. Tapar el fondo de la columna y colocar el NOR1 LBD columna acoplada en un tubo de recogida de 15 ml.
- Añadir el flujo a través del golpe Nur77 LBDcolumna encabezada, la tapa de la columna y colocar en un rotador a 4 ° C durante 1 hora. Retire las tapas superior e inferior y recoger el flujo a través.
- Medir la concentración de anticuerpo midiendo la absorbancia a 280 nm.
Análisis basado en ELISA 5. purificada de Anti-Nurr1 Anticuerpo
- Añadir 100 l de proteína (2,5 g / ml) a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Si las pruebas 3 proteínas diferentes, añadir 100 l de proteína 1 de pozos A1 a H4, 100 l de la proteína 2, a pozos A5 a H8 y 100 l de proteína 3 a pozos A9 a H12. Cubrir la placa e incubar durante la noche a 4 ° C.
- Lavar los pocillos recubiertos dos veces con 300 l por pocillo de PBS pH 7,4 y añadir 300 l de tampón de bloqueo ELISA a la totalidad de los pocillos recubiertos de antígeno y se incuba 2 horas a temperatura ambiente.
- Mientras que la placa está bloqueando preparar una dilución de partida deseado de anticuerpo anti-Nurr1 purificado (que van de 10 a 100 g / ml) en tampón de bloqueo ELISA.
- Después de 2 horas de bloqueo, reemplazar el tampón de bloqueo ELISA con 100 l de tampón bloque fresca ELISA a todos los pocillos.
- Añadir 100 l de anticuerpo anti-Nurr1 purificada diluida a todos los pocillos de la fila A. En serie diluir los anticuerpos mediante la transferencia de 100 l de solución de la fila A de los pozos en la fila B seguido de la transferencia de 100 l de solución de la fila B a la fila C continuando hasta la fila G. Después de mezclar las soluciones en los pocillos de la fila G descartar los extra de 100 l. Wells en la fila H sólo reciben los iniciales 100 l de tampón de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr.
- Lavar la placa tres (3) veces con 300 l por pocillo de 0,05% de Tween 20 en PBS pH 7,4 y seque la placa para eliminar el exceso de tampón de lavado.
- Añadir 100 l de peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado de cabra anti-IgG de conejo diluido en tampón de bloqueo ELISA (1: 8000 dilución; la gama típica es de 1: 5.000 a 1: 25.000). Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr.
- Lavar las placas ªree (3) veces como se describe en 5.6. Enjuague todos los pocillos llenándolos con 300 l de agua desionizada. Seque el exceso de agua invirtiendo la placa sobre papel absorbente.
- Añadir 100 l de 3, 3 ', 5, 5' tetrametilbencidina (calentó a temperatura ambiente) a todos los pocillos e incubar 15 a 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Detener la reacción mediante la adición de 50 l de 2 NH 2 SO 4.
- Leer la absorbancia a 450 nm restando fondo a 650 nm.
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Representative Results
Una comparación de columna de proteína A purificada anticuerpos Nurr1 específica con la proteína A anticuerpos anti-Nurr1 purificados seguido por paso a través Nur77 LBD y NOR1 LBD columnas se muestra en la Figura 1. Como puede verse, la proteína A-anticuerpo purificado Nurr1 exhibió una fuerte unión a Nurr1 LBD. Sin embargo, también mostró unión significativa a Nur77 LBD y para NOR1 LBD. Cuando Proteína A-Nurr1 anticuerpos purificados se purificaron adicionalmente contra Nur77 LBD y NOR1 LBD, la afinidad final purificado anticuerpos Nurr1 mostraron unión específica a Nurr1 LBD con indetectable de unión a Nur77 LBD o NOR1 LBD, demostrando que su reactividad cruzada con Nur77 y era NOR1 completamente eliminado.
Esta especificidad se demostró adicionalmente mediante análisis de transferencia Western de extractos de células CHO transfectadas con vectores de expresión que llevan longitud completa Nurr1, NOR1, o Nur77 fusionados a Myc marcado de proteína (Figura 2). Como era de esperar, antib anti-mycodies reveló que cada proteína de longitud completa se expresó en su peso molecular esperado. De acuerdo con los resultados del ELISA, Proteína A-purificado Nurr1 anticuerpo específico robustamente detecta de longitud completa Nurr1 pero también detectó NOR1 y Nur77 aunque menos eficiente. En contraste, el anticuerpo Nurr1 totalmente purificada no mostró ninguna reactividad cruzada detectable a NOR1 y Nur77 por ELISA o análisis de Western blot.
Finalmente, el anticuerpo Nurr1 totalmente purificado se utilizó para el análisis inmunohistoquímico de las neuronas MDA. Está bien documentado que Nurr1, pero no sus estrechos homólogos NOR1 y Nur77, se expresa un lugar destacado en los roedores y las neuronas MDA humanos, tanto en el mRNA y los niveles de proteína 14,15. El uso del anticuerpo Nurr1 totalmente purificado confirmó que Nurr1 se expresa casi exclusivamente en el núcleo de las neuronas MDA en el área de la substantia nigra (Figura 3).
Figura 1: Comparación de ELISA de reactividades cruzadas de los anticuerpos anti-Nurr1 antes y después de la purificación mediante el paso a través de Nur77 y NOR1 LBDs columnas acopladas proteína A anticuerpos anti-Nurr1 purificados (0,156 g / ml) (a) o proteína A purificado seguido de. cromatografía en columnas acopladas-LBD NOR1 y Nur77 anticuerpos anti-Nurr1 (0,156 g / ml) (b) se añadieron a los pocillos de placa de 96 pocillos recubiertas con 100 l de 2,5 mg / ml de Nurr1 LBD, NOR1 LBD o Nur77 LBD. El ELISA se llevó a cabo como se describe en la sección de método.
Figura 2: Detección específica de larga duración Nurr1 expresa en células CHO utilizando el anticuerpo-Nurr1 específica totalmente purificada de cuerpo entero Nurr1, se expresaron las proteínas NOR1 y Nur77 como myc etiquetados.proteínas de fusión en células CHO y detectados por anticuerpos específicos Myc (A), la proteína A-anticuerpo purificado Nurr1 (b), y el anticuerpo Nurr1 totalmente purificada (c). Los anticuerpos anti-actina utilizados para el control de la carga de proteínas (d). Cada ADN marcado con Myc de longitud completa (peso molecular de 65, 66, y 69 kDa para Nurr1, Nur77, NOR1, respectivamente) se transfectaron transitoriamente en células CHO y la misma cantidad de extractos celulares fueron cargados en cada carril. Carril 1: control negativo que consiste en CHO extractos de células transfectadas con un vector vacío; calle 2: Myc-Nurr1; carril 3: Myc-Nur77; carril 4: Myc-NOR1.
Figura 3:. El anticuerpo Nurr1-específica totalmente purificada detecta específicamente las neuronas de dopamina tirosina-hidroxilasa-positivo neuronas de dopamina mesencéfalo en la sustancia negra son positivos para Nurr1, como el correoxamined por inmunohistoquímica usando los anticuerpos específicos Nurr1 totalmente purificados. Notablemente, Nurr1 se localizó en el núcleo de las neuronas MDA. TH (tirosina hidroxilasa). Barra de escala = 100 micras. Barra de escala en la combinación de caja blanca es de 10 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El éxito de este protocolo se basa en la disponibilidad de proteínas puras para la caracterización de los anticuerpos generados contra un miembro específico de la familia de proteínas de interés. No hay necesidad de purificar los anticuerpos usando proteína A / G hasta que se establezca claramente que no son significativas reactividades cruzadas por ELISA y Western Blot.
Como se indica en el texto, es importante para evitar la suspensión de la proteína (s) a ser reticulado a la columna en un tampón que contiene amina tales como Tris o glicina. Además, la concentración de proteína óptima utilizado para la reticulación debe ser determinada empíricamente. El exceso de proteína en la columna podría resultar en el impedimento estérico mientras que muy poco reduciría la eficiencia de adsorción. Por lo tanto, es una buena idea para probar las concentraciones de proteínas que van de 2 a 10 mg / ml y para evaluar la calidad de los anticuerpos resultantes.
Se deben considerar varios factores al XXes la técnica falla para producir anticuerpos altamente específicos. Estos incluyen: la eficiencia de la reticulación, pérdida de dominio inmunorreactivo, y reticulado desnaturalización de la proteína. Como se indica en el protocolo, el monitoreo de entrecruzamiento eficiencia permite la determinación de que la proteína demasiado o muy poco se está inmovilizado en la columna. Si entrecruzamiento usando aminas reactivas se sospecha de destruir dominio (s) inmunorreactiva, la inmovilización a través del grupo carboxílico oa través carbohidratos debe ser considerado.
Es importante monitorizar la eficacia del procedimiento para producir consistentemente anticuerpos altamente específicos. Para los propósitos de regeneración, las columnas deben ser despojados de los anticuerpos de reacción cruzada con destino a ellos usando duras condiciones (pH alto o bajo). Esto provoca un porcentaje cada vez más alto de proteínas reticuladas que se desnaturaliza eficazmente, reduciendo el rendimiento de la columna.
La adición de agentes bloqueantes en ELISA y WesteBlot rn es de uso general con un nivel razonable de éxito. Sin embargo, el enfoque descrito en este video aumenta la probabilidad de éxito y reduce la necesidad de mantener grandes cantidades de las proteínas de reacción cruzada en la mano. Como los reactivos y métodos para inmovilizar proteínas a cromatografía medios seguir mejorando, este enfoque contribuirá a la identificación de células transformadas que circula anticuerpos específicos.
Este enfoque está limitado por la disponibilidad de proteínas puras. Otra limitación de este protocolo es la dependencia de plegamiento apropiado cuando se utilizan dominios de la proteína. Si los dominios de proteínas no se pliegan como en toda la proteína, la estrategia previa a la adsorción puede no producir anticuerpos que pueden identificar fácilmente el miembro proteína de interés en el análisis de los extractos de células o tejidos.
Muchas proteínas de interés, pertenecen a los (sub) familias de proteínas con alta secuencia de aminoácidos homologías. Caracterización funcional y identificación de la distribución de las proteínas a menudo se basan en la disponibilidad de anticuerpos específicos contra cada miembro de la familia. Las homologías de ácido amino alta entre los miembros de proteínas de la misma familia contribuyen a las dificultades en la generación de anticuerpos altamente específicos. El uso de estos anticuerpos de reacción cruzada a menudo conducen a resultados contradictorios.
Un ejemplo de ello es el Nurr1 receptor nuclear huérfano que pertenece a la subfamilia de receptores nucleares NR4A, junto con Nur77 y NOR1. Dado que estos tres factores comparten un alto grado de homología de aminoácidos, los anticuerpos contra cada factor muestran reactividades cruzadas significativas, que dificultan el análisis preciso de cada factor.
El uso de estos miembros NR4A como un ejemplo, fue posible generar anticuerpos altamente específicos Nurr1 libre de reactividades a NOR1 o Nur77. Dado que los LBDs comparten homología menos que los dominios de unión a ADN, se expresó la LBD de cada proteína y purificada y luego utiliza para iejorar la especificidad de los anticuerpos anti-Nurr1. Inicialmente, los anticuerpos contra LBD de Nurr1 exhibieron niveles modestos pero significativos de reactividad cruzada con las otras proteínas, como se analizó por ELISA y análisis de Western blot. Sin embargo, cuando la proteína A-Nurr1 anticuerpos purificados se purifican adicionalmente a través de pre-adsorción contra dominios LBD de reacción cruzada de Nur77 y NOR1, el anticuerpo Nurr1 resultante no mostró ninguna reactividad cruzada, como se examinó por Western blot y ELISA analiza de forma destacada detectado Nurr1 expresando neuronas DA en las áreas del cerebro medio. Los datos de Western blot y ELISA análisis de cerca están de acuerdo entre sí, lo que indica que estos análisis pueden ser complementarios y apoyarse mutuamente.
Tomados en conjunto, esta estrategia de purificación de anticuerpos será de gran utilidad en la generación de un anticuerpo específico al eliminar la reactividad cruzada a los miembros de proteínas homólogas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77 | Column Storage solution | ||
| AminoLink Coupling Resin and Kit | Thermo Scientific | 44890 | |
| Protein A spin column | Thermo Scientific | 89978 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| 96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10% Normal Goat Serum | KPL | 50-675-69 | |
| Milk Diluent/ Blocking Concentrate | KPL | 50-82-01 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23235 | |
| Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | 31460 | |
| Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine | Thermo Scientific | 34028 | |
| 2N H2SO4 | Macron Fine Chemicals | H381 05 | |
| Protein A IgG Binding Buffer | Thermo Scientific | 21001 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Column Storage solution | Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide | ||
| Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing | Spectrum Labs | 132128 | |
| 10 ml Disposable columns | Thermo Scientific | 29924 | |
| AminoLink Coupling Buffer | 0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0 | ||
| Quenching buffer | 1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4 |
||
| Wash Solution | 1M NaCl, 0.05% NaN3 | ||
| ELISA Blocking buffer | 1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent | ||
| Storage Solution | PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide | ||
| Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl |
References
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