Abstract
Fyra till sex veckor gamla, var Wistar-hanråttor användes för att producera djurmodeller för leverfibros. Processen kräver fyra veckors behandling med 10 mg / kg dimetylnitrosamin (DMN), som ges intraperitonealt under tre dagar per vecka. Intraperitoneala injektioner utfördes i dragskåp som DMN är en känd hepatoxin och cancerframkallande. Modellen har flera fördelar. För det första kan leverförändringar studeras i följd eller vid speciella stadier av intresse. För det andra kan det stadium leversjukdom övervakas genom mätning av serum alaninaminotransferas (ALT) och aspartataminotransferas (AST) enzymer. För det tredje kan svårighetsgraden av leverskada i olika skeden bekräftas genom offer av djur vid angivna tidpunkter, följt av histologisk undersökning av Massons Trichome färgade levervävnader. Efter fyra veckors DMN dosering, är den typiska fibros poängen 5-6 på Ishak skala. Modellen kan reproduceras konsekvent och har variti stor utsträckning används för att bedöma effekten av potentiella anti-fibrotiska medel.
Introduction
DMN är ett potent lever specifika toxin. Dess metabolism, vävnadsdistribution, och förmåga att skada lever av råttor rapporterades av Magee 1, och mekanismen för hepatocyte skador och celldöd genom apoptos beskrevs av Pritchard och Butler 2. Intermittent administrering av denna förening rapporterades att inducera leverfibros hos hundar och råttor 3,4.
Mekanismerna och morfologiska förändringar av leverfibros har undersökts med hjälp av denna modell. I tidiga studier med råtta, tre-veckors behandling med DMN producerade centrilobulär hemorragisk nekros följt av micronodular cirros utan steatosis 5. Det visade sig att i början av fibros, var kollagen bildas mer tvärbunden med typ III är mer framträdande än typ I sex. I likhet med andra orsaker, var DMN-inducerad fibrotiska förändringar i samband med en ökning av Kupffer-celler; levermakrofager som bor in sinusvågor. Dessa celler förvandlas till myofibroblaster och producerar stora mängder av extracellulär matris som är det primära problemet i fibros 7.
När det gäller cellulär signalering, Nakamura et al. Visade att TGF-β spelar en avgörande roll i utvecklingen av leverfibros 8. De använde ett adenovirus som uttrycker en trunkerad typ II TGF-β-receptorn, för att specifikt inhibera TGF-β-signalering. Leverfibros hos dessa råttor var spektakulärt stoppas under DMN behandling jämfört med kontrollgrupper. Andra studier har bekräftat att undertryckande av TGF-β leder till lindring av leverfibros utveckling 9,10. Modellen används också i en global gen profilering studie för att identifiera andra fibros markörer och proteiner som kan användas som målproteiner för anti fibrotisk terapi 11.
Andra kemiska medel som används för att framkalla leverfibros inkluderar tioacetamid (TAA) och cArbon tetraklorid (CCI4). TAA användes först på råttor och senare i möss 12. Fördelarna med denna modell är: enkel kemisk administrering i dricksvatten, reproducerbarheten av modellen med karakteristisk micronodular cirros och biokemiska förändringar. Nackdelarna inkluderar: den långa tidsperiod på 3 månader för leverfibros för att utveckla och bristen på förståelse av den molekylära mekanismen för induktion av leverfibros. När det gäller CCI4, har användningen minskat av följande skäl: det inte efterlikna mänsklig leversjukdom, har skadliga effekter på ozonskiktet, orsakar smärta och lidande för djur, är mycket giftiga för människor och kräver extra försiktighet i hanteringen och bortskaffande 13,14.
Långvarig gallgången obstruktion (genom ett kirurgiskt ingrepp) som en experimentell modell för levercirros rapporterades först av Kountouras et al. 15. Denna metod är icke-toxiska för människor och djur. However, tiden som krävs för leverfibros för att utveckla varierar. En genomgång av 30 rapporter et al. Marques 16, fann att det tog från sju dagar till fyra veckor efter operationen för leverfibros att utvecklas. De patologiska förändringar som beskrivs likna de mänskliga kronisk gallan fibros och modellen skulle vara mer lämpade för forskare som är intresserade av detta område.
Sammanfattningsvis intermittent administrering av en konstant dos av DMN i råtta under 4 veckor producerar leverfibros som efterliknar den mänskliga sjukdomen. Doserade råttor visar gradvisa utvecklingen av leverskada och parenkymal fibros 4,17. Sjukdomsprogression och svårighetsgrad kan övervakas via blodprov eller offer av djur vid specifika tidpunkter och effekten är mycket reproducerbar 18. Således modellen har använts i stor utsträckning för att studera mekanismerna för leverfibros och cirros samt att screena för potentiella anti-fibrotiska medel 10,19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök har godkänts av djurvård och användning kommittén vid Institutionen för tillämpad vetenskap, Temasek Polytechnic.
1. Framställning av DMN
- Pipett 200 ul av DMN (1 g / ml stamlösning) och tillsätt 19,8 ml PBS för att förbereda 10 mg / ml DMN lösning för injektion.
Obs: DMN är cancerframkallande. Använd ett dragskåp för att förbereda DMN och utföra djurinjektioner.
2. intraperitoneal injektion av DMN
- Använder Wistar-hanråttor med en medelvikt av 150-200 g. Acklimatisera råttor under 4 - 7 dagar före starten av experimentet.
- Bibehålla råttor vid rumstemperatur av 22 ± 1 ° C, med 12 timmar ljus och 12 h mörker cykler. Tillhandahålla råttmat och vatten ad libitum.
- Mät mat och vatten intag dagligen. Mäta kroppsvikt per vecka.
- Beräkna mängden DMN för varje råtta baserat på en dos av 10 mg / kg kroppsvikt. Använd en 1 ml spruta med en 25 gauge nål to dra den beräknade volymen av DMN lösningen i sprutan.
- Begränsa råtta för intraperitoneal injektion 21.
- Med råttan fastspänd, införa nålen i det nedre högra kvadranten av buken, dra tillbaka kolven på sprutan (ingenting ska sugas) för att kontrollera den korrekta placeringen av nålen inuti buken utrymme och långsamt injicera DMN lösning.
- När dosen av DMN har administrerats, långsamt dra tillbaka nålen och kassera i behållare för vassa föremål.
- Utför intraperitoneala injektioner av DMN 3 dagar i följd i veckan under 4 veckor. Administrera injektioner vid samma tidpunkt varje dag. Åter beräkna doseringen baserad på kroppsvikt i början av varje vecka injektioner.
- Samla blod från svansvenen varje vecka för att mäta biokemiska parametrar: alaninaminotransferas (ALT) och aspartataminotransferas (AST) 22.
- Mät serum ALT och AST med hjälp av en kommersiell VetTest Chemistry Analyzer.
3. Gross Undersökning och skörd av lever
- Avliva råttorna genom intraperitoneal injektion av pentobarbital vid en dos av 100 mg / kg kroppsvikt. Se till döden genom att kontrollera för bristen på hjärtslag.
- Förbered för obduktion och bedöma tillståndet hos djuret som beskrivs av Parkinson et al. 23 Placera döda råttor på dissekera ombord i rygg VILA med buken uppåt.
- Desinficera och fukta huden med 70% etanol.
- Med användning av sax, incisionsfilm huden över hela längden av den ventrum från anus till hakan, och reflektera huden. Med saxen, incisionsfilm bukväggen från anus till xiphoid brosk, för att exponera buken inälvor.
- Undersök bukorganen in situ för att kontrollera eventuella avvikelser. Notera eventuella förändringar i färg, storlek, placering av organ och närvaron av vätska i bukhålan. Undersökakonsekvens av organ och notera förekomsten av eventuella lukter.
- Använda sax och pincett, dissekera hela lever utan sina ligament och bilagor.
- Börja på hilus där den är ansluten till membranet och arbeta för att befria alla lever lober bilagor. Skär försiktigt alla ligament och blodkärl.
- Överföra levern på en petriskål och väg levern.
- Med hjälp av en skalpell, skär 2 - 5 mm tjocka sektioner av leverlober. För enhetlighetens skull alltid ta prover från samma lever lob. Ta en kil ca 5 mm diameter i tjocklek, från den högra laterala loben 24 cirka 1 cm från kanten av lobe.Immediately plats i 10% buffrad formalin för fixering. Se till att vävnaden till formalin volym är 1:10 eller mer.
- Harvest och omedelbart frysa delar (med flytande kväve) av leverlober vid denna punkt om det behövs för andra studier. När det gäller (3,8), prov från samma lever lob för konsekvens.
- Fixera leverprov i 10% buffrad formalin under ett minimum av 24 tim.
- Efter fixering, trimma levern, placera i kassetter och ladda dem i korgen av den automatiska vävnadsprocessor.
- Placera korgen med kassetter i den första stationen som innehåller 10% formalin. Se till att kassetterna helt under vatten. De kan finnas kvar i denna kammare för upp till 12 timmar tills cykeln börjar.
- Programmera vävnadsprocessor för att rotera kassetterna för en timme vardera, genom successiva stationer som innehåller följande lösningar: etanol vid en koncentration av 50%, 70%, 90%, 100% (2 stationer), xylen (2 stationer) och flytande paraffin ( 2 stationer).
- Överför leverprov i vax bad av inbäddning stationen. Säkerställa att inbäddning maskinen sätts på åtminstone en timme tidigare.
- Använda förvärmda pincett (65 ° C), ta bort varje kassett från wyxa bad och plats på den varma plattan (65 ° C) av inbäddning maskinen. Dispensera tillräcklig mängd flytande paraffin in i rostfritt stål basformen (förvärmd till 65 ° C) tills halvfullt. Överföra den del av levern från kassetten in i formen. Säkerställ att provet är placerad med den skurna ytan (som skall undersökas mikroskopiskt) platt på botten av formen.
- Fylla formen fullständigt med flytande paraffin, montera den tomma kassetten på toppen och placera formen på 4 ° C plattan hos inbäddning maskinen för att svalna i minst 30 min.
- Kontrollera att vaxet har svalnat och stelnat, och ta bort paraffinblocket från formen. Blocket ska poppa ut lätt och inte fastnar eller spricka. Om detta händer, smälta blocket och upprepa detta steg. Paraffinblocket kan sektioneras när den stelnar. Block kan lagras vid rumstemperatur under många år.
- Placera paraffinblocket i mikrotomen och avsnitt på 10 um tjocklek tills vaxskiktavlägsnas tillräckligt för inbäddade levervävnad att vara synlig.
- Ändra inställningen på mikrotomen att skära vid 5 pm tjocklek. Använd pincett, plocka upp en väl skära avsnitt genom att hålla den i kanten och försiktigt flyter avsnittet i vattenbad vid en temperatur av 40 ° C.
- Placera försiktigt en ren glasskiva under flytsektionen och lyfta den på ytan av glasskivan. Placera objektglaset på ett objektglas varmare vid 37 ° C över natten.
5. Masson trikromfläckning
- Innan du ansöker fläckar, behandla bilderna för att ta bort vaxet och rehydrera vävnaderna på följande sätt:
- Doppa sektionerna i xylen under 5 min. Upprepa 2x.
- Sänk ned de avsnitt på 100% etanol i 3 min. Upprepa 1x.
- Doppa sektionerna under vardera 1 min i följande lösningar av etanol: 90%, 80% och 70%.
- Skölj bilden under rinnande vatten för att avlägsna alla befintliga etanol på bilden.
- Sänk ned objektglasen i Iron Hematoxylin under 10 min för att färga kärnan.
- Skölj objektglasen med vatten för att avlägsna överflödig färg från bilden.
- Sänk ned objektglasen i Biebrich Scarlet-syrafuxin under 2 min för att färga cytoplasman.
- Skölj objektglasen med vatten.
- Placera glasen i fosfor / fosfomolybdensyra lösning för 10 minuter för att främja utnyttjandet av anilin blå. Ändra fosfor / fosfomolybdensyra lösning efter 2 omgångar av användning.
- Placera objektglasen i anilin blå lösning under 10 min för att färga kollagenfibrerna.
- Skölj överskottet fläcken med vatten och placera objektglasen i en% ättiksyralösning under 1 min för att tillåta differentiering kan äga rum för att göra färgen på sliden mer känslig och öppet.
- Skölj objektglasen med vatten och fortsätt att dehydratisera de vävnadssnitt. Dehydratiseringen stegen är följande:
- Sänk ned objektglasen efter varandra under 10 sek varje gång, i det följande concentrations etanol: 70%, 80%, 95% och 100%.
- Sänk ned objektglasen i 30 sek i 100% etanol. Upprepa 1x.
- Skölj objektglasen genom 3 stationer av xylen under 5 min vardera för att avlägsna etanol.
- Montera en glaskupa halka på provet med montering media (t.ex. DPX monterings) och låt torka.
Obs: DPX är ett syntetiskt harts som torkar snabbt, bevarar färg och skyddar vävnadssnittet.
6. Fibros Scoring på Massons Trichome färgade snitt av lever
- Har en veterinär patolog bedöma svårighetsgraden av fibros enligt fibros poäng 25. Det vore optimalt om fibros poäng görs av två eller tre patologer självständigt en blindad sätt. I ett sådant scenario, erhålla en slutpoäng efter diskussion och grupp översyn för att reda ut eventuella skillnader i poäng.
| Göra | Beskrivning |
| 0 | ingen fibros |
| 1 | Fibrer expansion av vissa portal områden, med eller utan kort fiber septa |
| 2 | Fibrer expansion av de flesta portal områden, med eller utan kort fiber septa |
| 3 | Fibrer expansion av de flesta portal områden, enstaka portal till portalen (PP) överbryggande |
| 4 | Fibrer expansion av portal områden med markerade överbryggande (portal till portalen (PP) samt portal centralt (PC) |
| 5 | Markerade brygga (PP och / eller PC) med enstaka knutor (ofullständig cirros) |
| 6 | Cirros, sannolikt eller definitiv |
Tabell 1: fibrosskala används för att läsa Massons Trichome Stained leversnitt 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DMN behandlade råttor gå ner i vikt och blir mindre kraftig med ruggig päls. Det finns en betydande förlust i genomsnitt kroppsvikten hos DMN råttor; första detekterbara efter två veckors DMN behandling, och denna skillnad förblir genom veckor 3 och 4 efter DMN behandling (Figur 1a). Som råttorna får DMN över varandra veckor, skador på levern gör att det blir mindre. Levern index; vilket är den procent av levervikten på slut kroppsvikt var signifikant lägre för DMN behandlade råttor (Figur 1b).
Figur 1: a) kroppsvikten hos DMN behandlade råttor. De data representeras som medel ± SD (n = 6 - 8). * P <0,05 jämfört med normala kontrollgruppen b) Lever index.; procent levervikt vid slutlig kroppsvikt DMN behandlade råttor efter 4 veckors DMN treatment. De data representeras som medel ± SD (n = 6 - 8). * P <0,05 jämfört med normala kontrollgruppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vid offer, efter 4 veckors DMN behandling, är levern mindre och hårdare (figur 2a) jämfört med dem från åldern matchade kontrolldjur (Figur 2b). Fibrin kan vara närvarande på levern yta och angränsande lever lober följs. Ca 20% av råttorna har ascites.
Figur 2: a) Lever från en råtta efter 4 veckors DMN behandling b) Lever från åldern matchad kontrollgrupp råtta.. I (a) levern är krympta, fast och blek med en gulaktig nyans jämfört med levernfrån sin åldrade matchad kontrollgrupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Skada på levern orsakar ökad permeabilitet hepatocyt cellmembranet. Ökad serum ALT och AST är indikatorer på hepatocyte skador. Serum-ALT (figur 3a) och AST (figur 3b) av DMN behandlade gruppen är betydligt högre än kontrollgruppen efter vecka 2 och 4 av DMN injektion. Serum ALT och AST nivåerna ökar normalt efter varje vecka av DMN behandling.
Figur 3: a) serumalaninaminotransferas (ALT) och b) i serum aspartataminotransferas (AST) nivåer av DMN råttor vid vecka 0, 2 och 4 efter den sista DMN injektionen. Uppgifterna är represented som medel ± SD (n = 6 - 8). * P <0,05 jämfört med normala kontrollgruppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Histologisk undersökning av levrar från DMN behandlade råttor visar att det finns progressiv ökning och expansion av fibröst septa, med förlust av hepatocyter, över tiden jämfört med kontrollråttor. Massons Trichome fläck används ofta för att belysa kollagen insättningar i levervävnad: dessa färgas blå.
Figur 4: Mikrofotografier av leversektioner färgade med Massons Trichome: a) lever sektion från en normal kontrollråtta, b) leversektion från en råtta efter att ha fått en veckas dimethylnitrosamine (DMN), c) leversektion från en råtta efter att ha fått 2 veckors DMN. Det finns fiber expansion av de flesta portal områden med enstaka portal till portalen överbrygga. D) Lever sektion från en råtta efter att ha fått 3 veckors DMN. Notera fibrösa expansionen av portal områden med markerad portal till portalen samt portal till centrala bryggning. E) Lever sektion från en råtta efter att ha fått 4 veckors DMN. Det finns cirros med nodulbildning. Styr levern är från gruppen avlivades tillsammans med råttor efter 4 veckors DMN injektion. Det finns ett mönster av progressiv ökning av fibros poäng från 0 i (a); 2 i (b); 3 i (c) 4 i (d) till 5/6 i (e). Alla mikrofotografier togs vid en förstoring av 40X med en längdenhet av Skalstrecket motsvarar 100 | j, m. Vänligen cslicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit en metod för att göra en djurmodell av leverfibros och för att bedöma allvarlighetsgraden av leverfibros. Det är viktigt att leverera rätt dos av DMN och iaktta den tidsplan vecko intraperitoneala injektioner. Eftersom experimentet fortskrider, är det viktigt att väga råttorna och åter beräknar dosen i början av varje vecka av DMN injektioner. Tänk på att DMN är giftig och måste hanteras i dragskåp. Vi utför intraperitoneala injektioner i dragskåp samt. Med behovet av upprepade injektioner är rätt återhållsamhet och teknik för injektion viktigt att undvika införandet av föroreningar och skador på inre organ. Vi har sällan dödlighet från intraperitoneala injektioner.
Råttor bör övervakas 2x per dag under hela försöksperioden. Under den sista veckan i DMN injektion bör observeras djuren ännu oftare och noggrant för döende tecken. Detta är de period när leverskador är svårast och drabbade råttor kommer att inappetent, förlora kroppsvikt och tillstånd. 25-40% av råttor kan bli allvarligt sjuka under denna period och dö om det inte finns någon veterinär intervention. Därför noggrann övervakning gör det möjligt för forskare att bedöma tillståndet hos djuret och planera lämplig avslutning av experimentet för att organ kan nyskördade från en avlivas råtta i stället för att försvinna från förfall från oväntade död.
Vi har funnit veckovis mätning av ALT och AST nivåer för att vara användbara indikatorer på utvecklingen av leverskada. Vi har också konstaterat att AST är mindre specifik än ALT och tillskriver detta till dess release från skadade erytrocyter och muskelvävnad förutom levern.
Säkerställa att tillräcklig volym av blod uppsamlas för att ge den erforderliga volymen av serum för analys. Vi samlar typiskt 200 - 300 pl blod per råtta.
Under collection av levervävnad för histologisk undersökning, rekommenderar vi provet erhållas från samma lob. Detta görs efter att ha kontrollerat att förändringarna i levern är enhetliga. DMN orsakar generella förändringar i levern. I de tidiga stadierna av studien, vi prov från vänster laterala och mediala lober samt rätt mediala lob. Vi observerade inte några skillnader i de mikroskopiska förändringarna mellan dessa lober.
Leversnitt bör fastställas i 10% buffrat formalin under minst 24 timmar och bearbetas snart efter. Långvarig nedsänkning bortom en vecka kan resultera i vävnaden blir spröda och svåra att avsnittet efter paraffininbäddning. Skär lämpliga 5 um tunna sektioner kräver övning och tålamod. Sektioner som bedöms vara lämpliga med blotta ögat (steg 4,11) kan undersökas med mikroskop för att kontrollera att de inte har artefakter som veck eller revor i sektionen. Färgningsproceduren är bäst genomförts enligt to tidsperioder för glid nedsänkning vid varje steg utan raster. Under färgningsprocessen, se till att sektionerna hålls fuktig hela tiden och överfördes från en färglösningen till nästa så snart som möjligt.
Utvärdering av Massons Trichome färgade sektioner för graden av fibros kräver en insats av ett veterinär patolog. Han / hon är en avgörande gruppmedlem som bör ingå i studien från början, eftersom han / hon skulle kunna ge råd och medverka i rätt organstölder i alla skeden av experimentet. Således nuvarande standarden för leverfibros scoring är bedömningen av lämpligt färgade vävnadssnitt av en patolog. Även om det skulle vara optimalt att ha effekt på mer än en patolog, kan detta inte vara möjligt i mindre organisationer. I sådana fall kan den objektivitet förbättras genom användning av bildteknik 26. Vi har funnit att resultaten från bildteknikär jämförbara med patologiska scoring (opublicerade data), och rekommenderar att den kan användas som en kompletterande metod för utvärdering.
Sammanfattningsvis den DMN inducerad modell av leverfibros har många fördelar jämfört med andra djurmodeller. Det är en förhållandevis enkel modell för att göra så att den inte kräver kirurgisk kompetens. DMN är miljömässigt säkrare och mindre giftiga för människor och djur än CCI4 och tar en kortare tid för att framkalla sjukdom än TAA. Jämfört med leversjukdom som produceras av CCI4, TAA, och gallgången ligation, DMN ger en närmare presentation av mänsklig leverfibros. Av dessa skäl, förutser vi att modellen kommer att fortsätta att användas i stor utsträckning för att studera mekanismerna för leverfibros liksom för att screena för potentiella anti-fibrotiska medel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichome stains | |||
| Aniline Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Phosphomolybdic Acid Hydrate | Sigma SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Mounting Medium | Merck | HX066873 | |
| Tissue processor | Leica | Leica TP 1020 | |
| Embedding machine | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Vet Test Analyzer | Idexx | Vet Test 8008 |
References
- Magee, P. N. Toxic liver injury; the metabolism of dimethylnitrosamine. Biochem J. 64 (4), 676-682 (1956).
- Pritchard, D. J., Butler, W. H. Apoptosis-the mechanism of cell death in dimethylnitrosamine-induced hepatotoxicity. J Pathol. 158 (3), 253-260 (1989).
- Madden, J. W., Gertman, P. M., Peacock, E. E. Dimethylnitrosamine-induced hepatic cirrhosis: a new canine model of an ancient human disease. Surgery. 68 (1), 260-267 (1970).
- Jenkins, S. A., Grandison, A., Baxter, J. N., Day, D. W., Taylor, I., Shields, R. A dimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat. J Hepatol. 1 (5), 489-499 (1985).
- Jézéquel, A. M., Mancini, R., Rinaldesi, M. L., Macarri, G., Venturini, C., Orlandi, F. A morphological study of the early stages of hepatic fibrosis induced by low doses of dimethylnitrosamine in the rat. J Hepatol. 5 (2), 174-181 (1987).
- George, J., Chandrakasan, G. Molecular characteristics of dimethylnitrosamine induced fibrotic liver collagen. Biochim Biophys Acta, Protein Struct Mol Enzymol. 1292 (2), 215-222 (1996).
- Winwood, P. J., Arthur, M. J. Kupffer cells: their activation and role in animal models of liver injury and human liver disease. Semin Liver Dis. 13 (1), 50-59 (1993).
- Nakamura, T., Sakata, R., Ueno, T., Sata, M., Ueno, H. Inhibition of transforming growth factorβ prevents progression of liver fibrosis and enhances hepatocyte regeneration in dimethylnitrosamine-treated rats. Hepatology. 32 (2), 247-255 (2000).
- Shek, F. W., Benyon, R. C. How can transforming growth factor beta be targeted usefully to combat liver fibrosis? Eur J Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 123-126 (2004).
- Wang, J. H., Shin, J. W., Son, J. Y., Cho, J. H., Son, C. G. Antifibrotic effects of CGX, a traditional herbal formula, and its mechanisms in rats. J Ethnopharmacol. 127 (2), 534-542 (2010).
- Su, L. J., Hsu, S. L., Yang, J. S., Tseng, H. H., Huang, S. F., Huang, C. Y. F. Global gene expression profiling of dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis: from pathological and biochemical data to microarray analysis. Gene Expr. 13 (2), 107-132 (2006).
- Müller, A., Machnik, F., Zimmermann, T., Schubert, H. Thioacetamide-induced cirrhosis-like liver lesions in rats usefulness and reliability of this animal model. Exp Pathol. 34 (4), 229-236 (1988).
- Martinez-Hernandez, A. The hepatic extracellular matrix. II. Electron immunohistochemical studies in rats with CCl4-induced cirrhosis. Lab Invest. 53 (2), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3894794 166-186 (1985).
- Pritchard, M. T., Apte, U. Models to Study Liver Regeneration. Liver Regeneration. , 15-40 (2015).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Marques, T. G., Chaib, E., et al. Review of experimental models for inducing hepatic cirrhosis by bile duct ligation and carbon tetrachloride injection. Acta Cir Bras. 27 (8), 589-594 (2012).
- Wasser, S., Tan, C. E. Experimental models of hepatic fibrosis in the rat. Ann Acad Med Singapore. 28 (1), 109-111 (1999).
- George, J., Chandrakasan, G. Biochemical abnormalities during the progression of hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine. Clin Biochem. 33 (7), 563-570 (2000).
- Shimizu, I., Ma, Y. R., et al. Effects of Sho-saiko-to, a Japanese herbal medicine, on hepatic fibrosis in rats. Hepatology. 29 (1), 149-160 (1999).
- Wang, Y., Gao, J., Zhang, D., Zhang, J., Ma, J., Jiang, H. New insights into the antifibrotic effects of sorafenib on hepatic stellate cells and liver fibrosis. J Hepatol. 53 (1), 132-144 (2010).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat. J Vis Exp. (99), (2015).
- Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. J Vis Exp. (54), (2011).
- Ruehl-Fehlert, C., Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Ishak, K., Baptista, A., et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol. 22 (6), 696-699 (1995).
- Sant'Anna, L. B., Sant'Anna, N., Parolini, O. Application of computer assisted image analysis for identifying and quantifying liver fibrosis in a experimental model. J Comput Interdiscip Sci. 2 (2), 139-148 (2011).
