Summary
Non agitata polimerizzazione precipitazione fornisce un rapido, riproducibile approccio prototipazione alla sintesi di stimoli-sensibili poli (N -isopropylacrylamide) microgel di distribuzione dimensionale ristretta. In questa sintesi protocollo, luce caratterizzazione dispersione e unico rilevamento di fluorescenza delle particelle di questi microgel in una configurazione di microscopia a largo campo sono dimostrati.
Abstract
Gli stimoli sensibili poli (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgel ha diverse applicazioni pratiche prospettici e utilizza nella ricerca fondamentale. In questo lavoro, usiamo singola particella monitoraggio microgel PNIPAM di fluorescente come una vetrina per dimensioni sintonizzazione Microgel da un procedimento di precipitazione di polimerizzazione rapida non si mosse. Questo approccio è adatto per prototipazione nuove composizioni di reazione e condizioni o per applicazioni che non richiedono grandi quantità di prodotto. sintesi Microgel, la dimensione delle particelle e la determinazione struttura per dispersione della luce dinamica e statica sono dettagliati nel protocollo. È dimostrato che l'aggiunta di comonomeri funzionali può avere una grande influenza sulla nucleazione delle particelle e la struttura. inseguimento singola particella grande campo microscopia a fluorescenza consente un'indagine della diffusione di microgel traccianti marcati in una matrice concentrata di microgel non etichettati, un sistema non facilmente indagine daaltri metodi come dynamic light scattering.
Introduction
Gli stimoli sensibili poli (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgel 1,2 hanno attirato l'interesse continuo nel corso degli ultimi due decenni a causa del loro potenziale in varie applicazioni intelligenti. Casi d'uso dimostrate includono stabilizzatori commutabili emulsione 3-8, microlenti 9, substrati di coltura cellulare per facilitare la raccolta di cellule 10,11, e trasportatori intelligenti per i composti a basso peso molecolare e altri usi biomedici 12. Da un punto di vista fondamentale di ricerca queste particelle hanno dimostrato di essere utile per indagare temi come le interazioni colloidali 13-15 e le interazioni polimero-solvente 16-18.
uso di successo di microgel PNIPAM e loro derivati in qualsiasi applicazione in genere richiede la conoscenza della dimensione media delle particelle e la larghezza della distribuzione granulometrica. Per una corretta interpretazione dei risultati sperimentali che coinvolgono PNIPAM microgel, la struttura delle particelle, che può essere influenzata da comonomeri funzionali, deve essere conosciuta. Dinamico e statico Light Scattering (DLS e SLS, rispettivamente) sono particolarmente adatto per l'acquisizione di queste informazioni perché questi metodi sono veloci e relativamente facile da usare; e sondare le proprietà delle particelle in modo non invasivo nel loro ambiente nativo (dispersione). DLS e SLS raccolgono anche i dati provenienti da gran numero di particelle evitando la distorsione derivante da campioni di piccole dimensioni, tipiche per i metodi di microscopia. Pertanto, il primo obiettivo di questo lavoro è quello di introdurre buone pratiche in materia di dispersione della luce per gli operatori nuovi alla caratterizzazione colloidale.
Tipicamente, precipitazione polimerizzazione viene effettuata in scala di laboratorio e cercando le giuste condizioni di reazione per le proprietà delle particelle specifici possono essere laborioso e richiede molte ripetizioni della sintesi. In contrasto con la sintesi in grande serie, precipitazione polimerizzazione non agitata 19,20 è arProcedura APID in cui gruppi di diversa composizione reagente può essere polimerizzato particelle contemporaneamente rendimento di distribuzione delle dimensioni stretta. polimerizzazione simultanea riduce al minimo la variazione sperimentale e grande uscita significa che le condizioni di reazione di destra può essere trovato veloce per l'upscaling la reazione. Quindi, il secondo scopo è quello di dimostrare l'utilità di polimerizzazione non agitata precipitazione nella prototipazione e in applicazioni che non richiedono una grande quantità di prodotto.
Diversi aspetti della sintesi e caratterizzazione si incontrano nel esempio di applicazione fluorescenti etichettati microgel PNIPAM nella ricerca interazione colloidale. Qui usiamo altamente accurato monitoraggio singola particella di indagare la diffusione di microgel traccianti marcati in dispersione di microgel matrice senza etichetta in un ampio intervallo di concentrazione della matrice e risolvere l'effetto gabbia in dispersione colloidale concentrata. Wide-field microscopia a fluorescenza è adatto FOr tale scopo, come si può caratterizzare il comportamento specifico di alcune molecole traccianti tra un gran numero di diverse specie potenzialmente matrice. Questo è in contrasto con tecniche come DLS, SLS e reologia, che misurano le proprietà medie insieme di sistemi e quindi non può risolvere comportamento del piccolo numero di particelle sonda in un grande sistema. Inoltre, in questo esempio specifico metodi di diffusione della luce convenzionali non possono essere utilizzati anche per concentrazione elevata di particelle, che porta ad una forte scattering multiplo invalidazione analisi standard. L'utilizzo di trattamento automatizzato di dati e metodi statistici consentire l'analisi del comportamento del sistema globale anche per il monitoraggio singola particella, quando in media su campioni di grandi dimensioni.
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Protocol
1. Sintesi Microgel
NOTA: N -isopropylacrylamide (NIPAM) è stato ricristallizzato da n-esano. Altri reagenti sono stati utilizzati come ricevuti.
- Convenzionale Batch sintesi di poli (NIPAM) microgel Matrix
- Sciogliere 1.8 g NIPAM e 24 mg N, N '-bisacrylamide (BIS) in 245 ml filtrati (0,2 micron cellulosa rigenerata (RC) filtro a membrana) acqua bidistillata in 500 ml a tre colli pallone a fondo tondo dotato di un condensatore a riflusso, un agitatore e di un setto di gomma.
- Inserire un termometro e un ago 120 mm per l'ingresso di azoto attraverso il setto.
- Riscaldare la soluzione a 60 ° C, sotto agitazione. Deoxygenate la soluzione da spurgo con azoto per 40 min.
- Contemporaneamente preparare una soluzione di iniziatore di 155 persolfato di potassio mg (KPS) in 5 ml di filtrati acqua bidistillata e bolla la soluzione con azoto per eliminare l'ossigeno.
- Trasferire i completi 5 ml KPS solution in siringa azoto lavato con ago 120 mm.
- Sollevare l'ago azoto sopra il livello della soluzione nel pallone a tre colli e aggiungere la soluzione KPS rapidamente attraverso il setto di gomma nel reattore.
- Sia la polimerizzazione procede per 1 ora sotto flusso di azoto e lenta agitazione a 60 ° C.
- Utilizzare un imbuto e filtro di carta Buchner filtrare la soluzione di reazione calda per scartare grandi aggregati. Lasciate che la dispersione raffreddare.
- Centrifuga e redisperse la dispersione tre volte per 40 min a 257.000 xg ed infine redisperse il sedimento in una quantità minima vitale di acqua bidistillata. In genere questo è di 2-4 ml.
- Lyophilize la dispersione per la memorizzazione.
- Sintesi non si mosse di poli (NIPAM) microgel fluorescente
- Pesare 257,7 mg NIPAM, 3,5 mg BIS, e 1,5 mg methacryloxyethyl thiocarbamoyl rodamina B (dye) nel recipiente di vetro e aggiungere 10 ml di filtrato doppio distillareacqua ed.
- Ultrasonicate soluzione colorante-monomero per 15 minuti per sciogliere il colorante in acqua.
- Preparare la stessa soluzione senza il colorante in un recipiente di vetro separata.
- Preparare varie diluizioni della soluzione monomero con il colorante utilizzando la soluzione di monomero senza colorante per ottenere una serie di concentrazione con varie concentrazioni di colorante. In questo lavoro, utilizzare colorante nella gamma di concentrazione di 0,02-0,1 mmol / L.
- Sciogliere 8.4 mg KPS in 10 ml filtrati acqua bidistillata per ottenere la soluzione di iniziatore.
- Trasferire 0,5 ml della serie concentrazione e 0,5 ml della soluzione KPS per testare tubi con diametro di 10 mm per ottenere le soluzioni di reazione finale e sigillare con setti di gomma.
- Preriscaldare un bagno d'olio in un recipiente a doppia parete in vetro collegata ad un circolatore riscaldamento a 63 ° C.
- Deoxygenize le soluzioni di reazione spurgando con azoto attraverso aghi 120 mm per 20 min.
- Inserire i tubi in AFloating piattaforma ed immergere la piattaforma in bagno d'olio già caldo. Impostare la temperatura a 60 ° C. Inizialmente la temperatura più alta nel bagno è necessario in quanto le soluzioni a temperatura ambiente raffreddare il bagno. Per l'alta sintonia precisione di formato delle particelle del controllo della temperatura durante la reazione iniziale deve essere rigorosi, tipicamente ± 0,1 ° C.
- Lasciate che la reazione procede per un tempo adeguato. Tipicamente 1 ora è sufficiente.
- Trasferire le provette di reazione rapida in stufa a 60 ° C e mettere una goccia della dispersione calda a 10 ml filtrata acqua bidistillata preriscaldata sopra la temperatura di volume PNIPAM transizione di fase (VPTT, 32 -34 ° C) 1, per la caratterizzazione DLS nel stato compresso.
- Lasciare il resto delle dispersioni raffreddare a temperatura ambiente e trasferirli in provette da centrifuga.
- Centrifugare la soluzione tre volte per 40 min a 257.000 xg e diluire le microgel finalmente in 2 ml di filtrati acqua bidistillata FOr uso come particelle traccianti.
2. Light Scattering Caratterizzazione
- Idrodinamica Raggio Determinazione in stato compresso da Dynamic Light Scattering
- Lavare le provette e cristalleria con il vapore di acetone.
- Calore 10 ml di filtrato (ad esempio, 200 nm o più piccolo filtro RC) acqua bidistillata oltre PNIPAM VPTT.
- Trasferire una goccia di dispersioni di calore per l'acqua filtrata con un ago preriscaldato (0,9 x 40 mm) e la siringa (1 ml).
- Temperare il DLS goniometro indice delle corrispondenze bagno a 50 ° C e trasferire il campione allo strumento senza farla raffreddare.
- Trova il grande angolo di diffusione in cui l'intensità diffusa è sufficiente per acquisire un correlogramma eseguendo misurazioni di prova.
- Inserire cuvetta campione (10 mm tubo di vetro del diametro di 1 ml di dispersione di particelle). Spostare il braccio rivelatore di angolo di diffusione di piccole dimensioni (qui 30 °).
- Controllare il profilo del fascio FOR scattering multiplo: nessun bagliore attorno al fascio primario, non scattering multiplo, ecc Controllare che il campo di conteggio è adatto per la misurazione con l'angolo di scattering più basso (circa tra i 30 ei 600 kHz; in alto a destra della finestra del software..)
- Spostare il braccio del goniometro al più alto angolo di diffusione (scegliere 120 ° qui). Verificare che il tasso di conteggio è ancora abbastanza alta per la misura (tra 30 e 600 kHz). Se l'intensità è troppo bassa, muovere il braccio per abbassare dispersione angolare.
- Controllare il fascio visivamente attraverso il vetro vasca toluene a l'angolo di scattering basso, se bagliore attorno al fascio incidente si osserva scattering multiplo avviene. In questo caso, ridurre l'intensità del laser o utilizzare una diluizione più elevata.
- Acquisire 20 correlogrammi tra l'angolo di scattering minima e massima (ad esempio, 30 ° - 140 °) con tempo minimo di acquisizione 60 sec. Aumentare il tempo di acquisizione per intensità debole grandi angoli di scatteringse necessario.
- Analisi dei dati 37
- Calcola la dispersione grandezze vettoriali per l'angolo di scattering in base alle
, Dove n è l'indice di rifrazione della dispersione, 
la lunghezza d'onda del laser a vuoto e 
l'angolo di scattering. - Nel caso il software di misura fornisce la funzione di correlazione intensità
, Trasformarlo in funzione di correlazione campo elettrico 
secondo 
. Parametro 
è un interessante parametro strumentale correlato al grado di coerenza spaziale del ove luce diffusar zona rivelatore. - Effettuare analisi cumulant su correlogrammi, vale a dire, in forma polinomio di secondo grado al logaritmo di ogni funzione di correlazione campo elettrico
da minimi quadrati lineari. appare come l'intercetta della forma e il suo valore esatto è irrilevante per quanto riguarda l'analisi dei dati. Limitare la misura per un valore di τ ritardo significativo, ad esempio, in modo che l'ampiezza di correlazione è del 10 - 20% dell'ampiezza massima. Il coefficiente del primo termine di ordine è il tasso di decadimento media della funzione di correlazione, 
. - Trova il valore più probabile per il coefficiente di diffusione media
delle particelle di minimi quadrati lineari stare su 
. Se contro 
non appare lineare e passare attraverso l'origine entro l'errore, la distribuzione granulometrica è ampio e idrodinamica raggio sarà poco definito. - Calcolare il raggio idrodinamico dal rapporto Stokes-Einstein
, dove 
è il coefficiente di Boltzmann, 
la temperatura assoluta e 
la viscosità della dispersione a . Propagare la deviazione standard di a 
. - Particle Struttura Determinazione di Static Light Scattering
- Lavare le provette e cristalleria con il vapore di acetone. Utilizzare diametro 20 mm o cuvette più grandi per minimizzare l'effetto lente cilindrica.
- Filter (filtro RC 200 nm o più piccola) di circa 20 ml di acqua bidistillata a un flacone di vetro e trasferire una goccia della dispersione purificata al flaconcino. Lavare il filtro con 10 ml di acqua prima di utilizzarla per la preparazione del campione per rimuovere le impurità residue dal processo di fabbricazione.
- Controllo a campione nei confronti di qualsiasi fonte di luce ambientale. Se si osserva la tonalità blu, il campione rischia di essere troppo concentrato. Diluire conseguenza.
- Predisporre il campione sfondo svuotando la cuvetta più volte con acqua filtrata e poi portare a volume del campione appropriata, a seconda della cuvetta e la posizione del laser nello strumento. Il laser deve passare attraverso il campione senza essere rifratta dal menisco.
- Calibrare il instrument utilizzando un campione toluene.
- Misurare la dispersione di acqua (sfondo) su tutta la gamma angolare disponibile.
- Misurare l'intensità di scattering dal campione in tutto il campo angolare disponibile preferibilmente a più lunghezze d'onda. Il modello di dispersione normalizzato all'intensità forward scattering è noto come il fattore di forma.
- Se la struttura delle particelle è noto, l'espressione modello appropriato per calcolare in forma globale sui set di dati misurati a diverse lunghezze d'onda.
- In struttura particellare Sconosciuto regolarizzata diretta (ad esempio FitIt! 33) o inversa indiretta più generale Fourier trasformare 21,22 di routine unitamente deconvoluzione della funzione di distribuzione a coppie distanza (solo per particelle sferiche) 23,24 per la classificazione approssimativa di particelle Digitare.
- Nel caso la routine raccordo o inversione fornisce una stima della funzione di distribuzione delle particelle di raggio, calcolare la polidispersitàindex (deviazione standard della distribuzione diviso per la sua media).
3. Particle monitoraggio da Wide-field microscopia a fluorescenza
NOTA: Tracer e matrice particelle di 465 ± 7 nm e 405 nm ± 7 raggi idrodinamica a 20 ° C, rispettivamente, sono stati utilizzati per il monitoraggio delle particelle.
- Preparazione del campione
- Preparare concentrato dispersione matrice Microgel da redispersing quantità nota di liofilizzato Microgel senza etichetta alla quantità nota di acqua bidistillata. Aggiungere una piccola quantità di particelle traccianti marcati.
- Confermare la concentrazione del tracciante Microgel adeguato al microscopio. La concentrazione ottimale è un compromesso tra le acquisizioni simultanee del numero massimo di tracce, pur avendo la concentrazione di tracciante abbastanza basso in modo che la probabilità che le piste tracciante particelle attraversano durante l'acquisizione è trascurabile.
- Preparare dispersioni concentrate per evaporazionel'acqua in un forno. Determinare la concentrazione di peso confrontando il peso della dispersione al peso originale del campione prima dell'evaporazione.
- Acquisizione dati e analisi
- Utilizzare una lente obiettivo appropriata del ingrandimento desiderato e l'apertura per l'eccitazione dei rivelatori e la raccolta di fluorescenza simultanea dal campione. In questo lavoro, utilizzare un 100X / 1.3 NA immersione in olio lente dell'obiettivo.
- Posizionare la camera di umidità su un tavolo XYZ-piezo, che si inserisce in un microscopio commerciale.
- Per evitare che il campione si secchi, posizionare un plasma pulito vetrino nella camera di umidità e pipetta 10 ml di poli (NIPAM) dispersione della concentrazione desiderata sul slittamento.
- A seconda della eccitazione ed emissione spettri del colorante fluorescente, utilizzare un laser adatto per l'eccitazione e regolare la potenza del laser in modo appropriato. L'intensità deve essere sufficientemente bassa da evitare photobleaching rapida dei coloranti, maallo stesso tempo abbastanza forte per un accurato posizionamento singola particella (vedi sotto). In questo lavoro, utilizzare un 561 nm diodo pompato laser a stato solido e mantenere costante la potenza del laser a 16 mW (ca. 0,5 kW cm -2 al campione) per tutte le misurazioni.
- Per ottenere un'illuminazione campione omogeneo, utilizzare l'impostazione di illuminazione critica qui descritto. Per questo, due il laser in una fibra multimodale (NA 0.22 ± 0.02, 0.6 mm di diametro core), agitare la fibra utilizzando un vortex in modo da temporalmente media fuori macchioline laser, e proiettare terminare la fibra nel piano di campionamento.
- Calibrare la distanza z dalla riflessione retro del vetrino e mettere a fuoco diversi micrometri nel campione spostando l'obiettivo leggermente verso l'alto e fissare la posizione z utilizzando una z-compensatore. Questo consente di evitare eventuali effetti di interfaccia con il vetrino.
- Regolare i parametri del rivelatore, come il tempo di esposizione, la forza del segnale di fluorescenza. In questo caso, utilizzare una fotocamera EMCCDcon il tempo di esposizione di 0,1 sec, elettrone modalità e guadagno di 50 moltiplicarsi.
- Acquisire diversi film con il numero appropriato di fotogrammi per ottenere un adeguato lasso di tempo per calcolare lo spostamento quadratico medio dei microgel in diverse regioni del campione. In questo lavoro, utilizzare numeri di telaio di acquisizione di 500 o 1.000 fotogrammi.
- Analizzare i dati posizionando le particelle in ogni fotogramma usando raccordo gaussiana 25 e utilizzare un algoritmo di monitoraggio adeguato delle particelle 26 per ottenere lo spostamento quadratico medio. 27 Calcolare dire i valori e la deviazione standard dalla media su tutte le piste in tutti i film. Calcolare i coefficienti di diffusione lungo intervallo di tempo mediante regressione lineare da
, dove 
è lo spostamento quadratico medio, D il coefficiente di diffusione media e T si il tempo di ritardo. - EstiMate il parametro anomalia γ dall'equazione diffusione anomala
trasformando i dati in scala logaritmica, cedendo 
. Il parametro di anomalia 
è dato dalla derivata della trama. Il derivato può essere stimato dalle differenze finite dei punti di dati, o il montaggio dei punti dati da funzioni polinomiali e differenziando analiticamente. Determinare il grado sufficiente di funzioni polinomiale tracciando i residui in forma e norma residuale per aumentare ordine polinomiale. - Ripetere la stessa procedura per diverse concentrazioni delle matrici Microgel.
- Calcola la dispersione grandezze vettoriali per l'angolo di scattering in base alle
, Dove n è l'indice di rifrazione della dispersione, 
la lunghezza d'onda del laser a vuoto e 
l'angolo di scattering. 
, Trasformarlo in funzione di correlazione campo elettrico 
secondo 
. Parametro 
è un interessante parametro strumentale correlato al grado di coerenza spaziale del ove luce diffusar zona rivelatore. 
da minimi quadrati lineari. 
. 
delle particelle di minimi quadrati lineari stare su 
. Se
non appare lineare e passare attraverso l'origine entro l'errore, la distribuzione granulometrica è ampio e idrodinamica raggio sarà poco definito. 
, dove 
è il coefficiente di Boltzmann, 
la temperatura assoluta e 
la viscosità della dispersione a 
. 
, dove 
è lo spostamento quadratico medio, D il coefficiente di diffusione media e T si il tempo di ritardo. 
trasformando i dati in scala logaritmica, cedendo 
. Il parametro di anomalia 
è dato dalla derivata della trama. Il derivato può essere stimato dalle differenze finite dei punti di dati, o il montaggio dei punti dati da funzioni polinomiali e differenziando analiticamente. Determinare il grado sufficiente di funzioni polinomiale tracciando i residui in forma e norma residuale per aumentare ordine polinomiale. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il numero di particelle Microgel PNIPAM nel batch, e quindi il volume delle particelle finale, è determinata presto nella reazione durante la fase di nucleazione 20 idrofobo co-monomero dye methacryloxyethyl thiocarbamoyl rodamina B influenza la nucleazione riducendo particella densità numerica nel batch. La diminuzione della concentrazione di particelle per due diverse concentrazioni NIPAM iniziali può essere visto come aumento del volume delle particelle finale medio nello stato compresso con l'aumentare della concentrazione di colorante, mostrato in Figura 1. L'aumento del volume può essere attribuito al colorante comonomero idrofoba, che promuove Microgel aggregazione nuclei a tempi di reazione precoci, diminuendo la concentrazione di particelle e aumentare il volume delle particelle finale.
I risultati di un successo MISURE DLSts sono mostrati in Figura 2. Per la sei piccoli lotti di volume delle particelle finale dipendenza lineare del tasso di decadimento medio Γ 2 su q 2 e lo zero y-intercetta l'errore indicano che le distribuzioni granulometriche per questi lotti sono relativamente stretta e un ben stima -defined per il coefficiente di diffusione medio può essere ottenuto dalla pendenza della regressione lineare. la figura 3 mostra un risultato più complicato da due grandi lotti di volume, dove Γ 2 discosta dal comportamento lineare nell'intervallo q intermedio. La non linearità origine dalla minima fattore di forma (pattern dispersione angolare) che coincide con questi valori q. 28 Il fenomeno in questione può essere osservato per le particelle di dimensioni paragonabili alla lunghezza d'onda della radiazione laser incidente e anche una distribuzione granulometrica moderata larghezza. Determinazione del coefficiente di diffusione in questo q figura 3, Γ 2 riflette il comportamento medio nuovamente alta q, dove tutte le frazioni granulometriche contribuiscono in modo più uniforme per l'intensità totale dispersa. Un modo semplice per ottenere una stima ragionevole per il coefficiente medio di diffusione è quello di escludere i valori intermedi Γ 2 dalla forma lineare. Se il fattore di forma delle particelle sono noti, un metodo di montaggio più elaborato può essere utilizzato 28.
Determinazione del volume idrodinamico in stato compresso senza lasciare che i campioni raffreddare sotto l'PNIPAM VPTT assicura che la frazione sol-gel non non si è staccato dalle particelle. Pertanto il volume nello stato compresso riflette la massa e il numero delle particelle durante la polimerizzazione, che è importante se il fundamproprietà ental della polimerizzazione precipitazioni sono oggetto di indagine 20. Volume nello stato compresso fornisce anche una buona quantità per confrontare diversi parametri di reazione, perché è indipendente dalle proprietà di rigonfiamento e la frazione di polimero non gelificato nelle particelle regolata dalla quantità di reticolante nella miscela monomerica. Dimensioni ridotte e maggiore contrasto dispersione nello stato compresso facilitano anche la caratterizzazione DLS.
Dati luce statica di scattering misurata in due lunghezze d'onda di 642 nm e 404 nm per le particelle matrice e traccianti sono mostrati in Figura 4 visivo dei modelli di scattering angolari rivela che le particelle sono ben definiti:. Multiple oscillazioni illustri tipici per particelle sferiche tutto la q indica polidispersità stretta, in questo caso il 7% e 6% per i traccianti e matrici microgel rispettivamente. Smooth Behavior a basso q indica che i campioni sono sufficientemente diluiti e non aggregazione delle particelle significativo è presente. L'aumento di intensità sparse all'estremo q può essere attribuito alla dispersione dovuta al retro fascio riflesso dalla parete interna cuvetta. Inversione dei fattori di forma delle particelle matrice confermare tipica struttura Microgel 29 con nucleo denso e radialmente in decomposizione profilo di densità derivante dalla cross-linker cinetica di copolimerizzazione 30 (vedi riquadro). La linea tratteggiata mostra il fattore di forma della sfera disco di riferimento con lo stesso raggio medio di girazione come particelle matrice. Il fattore di forma sperimentale decade velocemente con q rispetto al disco fattore di forma sfera, che è tipico per le particelle con aspetto irregolare. Al contrario, le particelle traccianti esibiscono struttura Microgel non convenzionale. Questo può essere visto anche dal disco fattore di forma sfera di riferimento, il che dimostra che il fattore di forma sperimentale inizialmente non fadecadimento più veloce del riferimento. Questo risultato dimostra che le incorporano molecole di colorante per microgel possono influenzare la loro struttura, che deve essere contabilizzato interpretazione dei risultati.
L'elevata uniformità delle particelle sintesi è di grande interesse per gli studi della loro diffusione a frazioni di volume intorno alla temperatura di transizione vetrosa per determinare con precisione il comportamento evoluzione in questo regime 13, e confrontarlo con particelle dure 31. Pertanto, una bassa frazione di microgel marcati sono stati mescolati con Microgel non etichettati di dimensioni comparabili. Eccitazione ed emissione spettri delle molecole di colorante MicroGEL-costituita insieme con la lunghezza d'onda di eccitazione e di configurazione del filtro utilizzato nel percorso di emissione sono presentati in Figura 5. Assorbanza e massimi di emissione di methacryloxyethyl thiocarbamoyl rodamina B sono vicini alla lunghezza d'onda di eccitazione e la gamma di raccolta di fluorescenza,rispettivamente, consentendo ad alta efficienza di raccolta nella impostazione del monitoraggio delle particelle. L'evoluzione temporale dello spostamento quadratico medio per microgel traccianti in varie concentrazioni matrice Microgel non marcato sono mostrati in Figura 6 e Figura 7 in lineare e scala logaritmica, rispettivamente. A concentrazioni basse matrice MicroGEL le particelle traccianti diffondono rapidamente. Anche se sono visibili solo per un numero limitato di fotogrammi prima di passare fuori del piano focale, ragionevolmente buona stima dei loro spostamenti quadratici medi è possibile. L'aumento lineare dello spostamento quadratico medio con il tempo indica il comportamento di diffusione normale per tutti i tempi di latenza misurati. Tuttavia, per le concentrazioni Microgel vicino alla transizione vetrosa colloidale, cioè, 29-36 mg / ml, l'evoluzione temporale degli spostamenti quadratici medi diventa non lineare (vedere Figura 7). Il comportamento assomiglia a quella delle particelle di PMMA di dimensioni micrometriche colloidali come discribed da settimane e Weitz 31 e può essere correlato all'effetto gabbia. Come mostrato schematicamente in figura 10, un Microgel etichettato in una matrice densa può diffondere piuttosto liberamente all'interno della gabbia. Per questo motivo, lo spostamento quadratico medio aumenta linearmente nei primi millisecondi. Tuttavia, poiché le particelle sono intrappolate in gabbie transitori formate dai loro vicini, un riarrangiamento collettiva dei microgel circostanti è necessario per microgel di muoversi ulteriormente. Questo effetto gabbia si esprime in un pendio piuttosto superficiale nella seconda gamma di figura 7, e può essere confermata anche controllando le tracce delle particelle in figura 9. In tempi di latenza brevi le particelle jiggle nelle loro gabbie, da cui sfuggono solo per ottenere di nuovo in trappola. A tempi di latenza lunghi, il comportamento di diffusione lineare viene recuperato. effetti gabbia può essere analizzati utilizzando modelli di diffusione anomala in cui l'evoluzione temporale della (bidimensionalmente rilevato) Media d piazzaisplacement è espressa da una legge di potenza nel tempo: 
o in forma logaritmica 
con il parametro anomalia 
32. Per la diffusione normale, il parametro anomalia uguale a 1, subdiffusion è rappresentato da valori inferiori a 1. Figura 8 presenta l'evoluzione temporale del parametro anomalia determinata direttamente dalla pista nel log-log-plot Figura 7. Per le concentrazioni inferiori di microgel nel nostro studio, il parametro di anomalia è pari sostanzialmente a 1. per i tempi di ritardo 
nell'intervallo di alcuni secondi, il fattore discosta da 1 verso valori più bassi. Questo comportamento è un artefatto dovuto al fatto che l'assiale (z) intervallo di osservazione in microscopia ampio campo è limitato a solo pochi micrometri. Il Z- strettogamma polarizza l'analisi per diffusione veloce ad intervalli di tempo lunghi per la rapida diffusione rivelatori a concentrazioni basse matrice. Aumentando la concentrazione microgel, troviamo che il minimo del parametro anomalia diventa molto più pronunciato e il passaggio alla diffusione normale ( 
) Appare più tardi. Questa è una chiara indicazione del relativo effetto gabbia appare per sistemi microgel densi quando si avvicina il loro regime di transizione vetrosa.
Figura 1:. Il volume della particella singola in stato collassato con concentrazione di colorante iniziale nel lotto due diverse concentrazioni NIPAM iniziali sono stati utilizzati, 57,5 mmol dm -3 (cerchi neri) e 28.8 mmol dm -3 (rettangoli grigi). 1 schi% di cross-linker è stato utilizzato. Concentrazione iniziale KPS è stata la stessa in tutta la mazzaches a 1.56 mmol dm -3. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: tasso di decadimento con il quadrato della dispersione vettore grandezza per i quattro piccoli lotti di volume MicroGEL dipendenza lineare. 
su q 2 e lo zero intercetta indicare distribuzione granulometrica ristretta e indica che stima ben definito del coefficiente di diffusione medio può essere calcolato dalla pendenza della regressione lineare. Le concentrazioni NIPAM erano 57,5 mmol dm -3 (quadrati rossi e arancio invertito triangoli) e 28,8 mmol dm -3 (resto dei simboli). Le concentrazioni Dye erano 0.044 mmol dm -3 (quadrati rossi), 0,022 mmol dm -3 (arancione triangoli invertiti), 0,088 mmol dm -3 (triangoli verde), 0,066 mmol dm -3 (rombi ciano), 0,044 mmol dm -3 (triangoli blu scuro), e 0,022 mmol dm -3 (cerchi rosa). clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Tasso di decadimento con il quadrato della dispersione ampiezza del vettore per le due grandi lotti di volume comportamento non lineare di Γ 2 con q 2 nell'intervallo q centrale è causata da variazioni del coefficiente intensità del segnale di frazioni di dimensioni diverse in prossimità del minimo fattore di forma. la concentrazione NIPAM nei lotti entrambi erano 57.5 mmol dm-3, Le concentrazioni di colorante erano 0,088 mmol dm -3 (cerchi neri) e 0,066 mmol dm -3 (triangoli rossi). Simboli sbiaditi sono stati esclusi dalla forma lineare. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: fattori forma di tracciante marcato e le particelle della matrice senza etichetta Per entrambe le particelle del fattore di forma è stata misurata a due lunghezze d'onda, 642 nm (punti dati blu e rosso chiaro) e 404 nm (verde e punti di dati blu scuro).. Le linee continue sono attacchi globali al 642 nm e 404 nm set di dati. Le linee tratteggiate mostrano fattori di forma di particelle di riferimento sfera duri con lo stesso raggi di rotazione come particelle della matrice e traccianti (verde arancio e linee tratteggiate, rispettivamente.) riquadri mostrano particelle normalizzatoprofili di densità dal nucleo alla superficie calcolato, ad esempio, FitIt! Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Eccitazione ed emissione spettri di fluorescenza etichettati particelle MicroGEL linea blu indica lo spettro di emissione di eccitazione e la linea rossa. linea verticale solido è la lunghezza d'onda di eccitazione. L'area ombreggiata indica lunghezza d'onda raccolta di fluorescenza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: medio DISP piazzalacement con ritardo per le particelle traccianti. Le concentrazioni MicroGEL matrice Senza etichetta erano 15.56 mg / ml (a sinistra), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28.67 mg / ml, 30.32 mg / ml, 31.13 mg / ml e 35.35 mg / ml. Punti e barre di errore indicano valori sperimentali e deviazione standard, rispettivamente. Le linee continue sono adatta lineari ai punti di dati. Inserto mostra un grande campo di fluorescenza microfotografia di microgel traccianti a 35.35 mg / ml concentrazione della matrice. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7:. Significa spostamento quadratico con ritardo per le particelle traccianti in scala logaritmica concentrazioni Microgel matrice Unlabeled erano 15.56 mg / ml (a sinistra), 22.05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28.67 mg / ml, 30.32 mg / ml, 31.13 mg / ml e 35.3 5 mg / ml. Punti e barre di errore indicano valori sperimentali e deviazione standard, rispettivamente. Le linee continue sono adatta polinomi ai punti di dati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8:. Parametri anomalia ritardo per particelle traccianti concentrazioni Microgel matrice Unlabeled erano 15.56 mg / ml (a sinistra), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28.67 mg / ml, 30.32 mg / ml, 31.13 mg / ml e 35.35 mg / ml. Punti rappresentano derivati stimati dalle differenze finite e linee solide analiticamente calcolati derivati dagli attacchi polinomio nella Figura 7. Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 9:.. Tracce di particelle per 12 microgel traccianti in dispersione con 35.35 mg / concentrazione della matrice ml Clustering di brani risultati blob distintivi da particelle del traccianti essere intrappolati in gabbie transitori formate dai loro vicini non etichettati Cliccate qui per vedere una versione più grande questa figura.
Figura 10:. Schema di tracciante Microgel diffusione nel concentrato dispersione matrice Microgel senza etichetta traiettoria Rosso denota una rapida diffusione dei rivelatori all'interno delle gabbie transitori (linea blu tratteggiata), formata da particelle vicine. Blu traiettoria denota lungo ti lagMi diffusione abilitato dal riarrangiamento collettiva delle gabbie transitori. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 11:. Coefficienti di diffusione fase di latenza lunga con concentrazione matrice Microgel senza etichetta a bassa concentrazione di matrice la diffusione dei microgel traccianti non è influenzato dalle particelle di matrice. Con l'aumento della concentrazione della matrice Microgel la diffusione lungo tempo rallenta ordini di grandezza perché la diffusione richiede riassetto collettiva delle gabbie transitori, in cui sono intrappolati i traccianti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'aggiunta di piccole quantità di comonomero funzionale può avere un effetto significativo sulla dimensione delle particelle e la struttura dei PNIPAM derivato microgel. Simultanea su piccola scala provetta di polimerizzazione è un buon metodo per tenere conto di tali cambiamenti, e aiuta a trovare rapidamente le composizioni reagenti giusti per dimensioni di destinazione delle particelle per l'upscaling la reazione, se necessario. La massa delle particelle è approssimativamente esponenziale dipendente dalla temperatura di polimerizzazione quando decomposizione dell'iniziatore termicamente, come KPS, viene utilizzato 20, e quindi si deve stabilire un controllo stabile e preciso della temperatura all'interno del reattore per una buona riproducibilità. volumi particelle finali di reazione lotto convenzionale e la reazione non agitata sono tipicamente in buon accordo se si minimizza perturbazioni sintesi lotto correlati, come agitazione troppo violento della miscela di reazione a EVit out gradienti di temperatura nel grande reattore, o utilizzando quantità eccessiva di soluzione di iniziatore in modo che le variazioni di temperatura di reazione durante il periodo di apertura.
Light scattering dinamico è un metodo ben consolidata e veloce per determinare il comportamento diffusione di un gran numero di particelle in situ. È comunque indispensabile acquisire dati in più angoli di diffusione. DLS misurazioni a un angolo arbitrario, coincidente con un minimo fattore di forma o in caso di distribuzione ampia dimensione, porterà ad un coefficiente di diffusione apparente significativamente differente dal coefficiente di diffusione media del campione. Tali casi possono essere riconosciuti dal comportamento non lineare in Γ 2 vs 2 q trama. Per risolvere ampi o multimodali distribuzioni granulometriche, si può tentare di utilizzare un algoritmo di trasformazione di Laplace inversa come CONTIN 34. DLS è, tuttavia, non l'ideale per questo scopo a causa di NAT mal condizionataure del problema di inversione.
Per entrambi luce dinamica e statica disperdendo i campioni devono essere sufficientemente diluito per evitare scattering multiplo, che invalida l'analisi dei dati di routine. Per la determinazione fattore di forma da SLS anche la differenza di indice di rifrazione delle particelle e solventi deve essere bassa per evitare dispersione di Mie, che impedisce semplice analisi fattore di forma. Questa condizione è soddisfatta quando 
, dove 
è il raggio medio delle particelle e 
la differenza tra indici di rifrazione di solvente e particelle. Per microgel ampiamente gonfiate con del solvente questo criterio è soddisfatto, ma in generale le particelle devono essere contrasto abbinato con sufficientemente elevato indice di rifrazione del solvente. Mie dispersione può essere riconosciuto dal sbavature di tegli Fattore di forma minimi, un effetto, che diminuisce quando la differenza di indice di rifrazione diminuisce.
metodi di diffusione della luce forniscono insieme una media di informazioni, mentre il monitoraggio di particelle a livello di campo può essere utilizzato per studiare il comportamento diffusione di singole particelle nello spazio reale. In contrasto particle tracking basato su dispersione della luce, l'elevata sensibilità della fluorescenza consente di seguire piccole particelle e, nel caso estremo, anche singole molecole. Inoltre, il rapporto tra particelle etichettate e non etichettati può essere adattato per misurare con precisione anche in soluzioni altamente concentrate. Il monitoraggio delle particelle fornisce quindi un modo modello libero di determinare il modo di coefficiente di diffusione e la diffusione dei colloidi in situ anche per la comparazione tra i comportamenti di singole particelle. accuratezza Localizzazione dei singoli rivelatori è solitamente superiore al limite di diffrazione, ma dipende dal rapporto segnale-rumore rapporto tra la fluorescenza side segnal di singole particelle sulla configurazione a grande campo. Così, l'etichettatura con coloranti che presentano un alto resa quantica, buona fotostabilità e un massimo assorbimento vicino alla lunghezza d'onda di eccitazione è un prerequisito per buoni risultati. concentrazione di tracciante deve essere tenuta bassa in modo da minimizzare attraversamento delle traiettorie delle diverse particelle disturbare l'algoritmo di inseguimento. Per dispersioni concentrate, la densità di traccianti fluorescenti può essere regolata miscelando particelle etichettate e non marcate. I recenti lavori sulla funzione tecnica di diffusione di punto permette 3D particelle inseguimento 35,36, che può essere usato per studiare diffusione anisotropa in diverse direzioni dello spazio.
In sintesi, la caratterizzazione accurata DLS e su piccola scala provetta di polimerizzazione forniscono quadro solido per alta messa a punto di precisione del volume di particelle finale Microgel. tecniche di diffrazione della luce e di monitoraggio della fluorescenza delle particelle forniscono informazioni complementari sul complesso ecomportamento diffusione singola particella su un'ampia gamma di concentrazione di dispersione. La combinazione della sintesi di particelle morbide ben definiti con la possibilità di tenere traccia di loro in soluzioni di diversa concentrazione sarà di notevole importanza per lo studio delle dinamiche dei sistemi di particelle morbide e un confronto con i sistemi colloidali duri ben studiato.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | VWR Chemicals | KRAF13455 | |
| Bisacrylamid | AppliChem | A3636 | |
| n-Hexane | Merck | 104374 | |
| N-Isopropylacrylamide | Fisher Scientific | AC412785000 | recrystallized from n-hexane |
| Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences | 23591 | |
| Potassium peroxodisulfate | Merck | 105091 | |
| Silicone oil 47 V 350 | VWR Chemicals | 83851 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| F12 Refrigerated/heating circulator | Julabo | 9116612 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| XY(Z) Piezo System | Physik Instrumente | P-545.3R7 | |
| 100X Oil immersion objective | Olympus | UPLSAPO | |
| QuadLine Beamsplitter | AHF Analysentechnik | F68-556T | |
| Cobolt Jive 150 laser | Cobolt | 0561-04-01-0150-300 | |
| Multimode Fiber | Thorlabs | UM22-600 | |
| iXON Ultra 897 EMCCD camera | Andor | DU-897U-CS0-BV | |
| Laser goniometer | SLS Systemtechnik | Mark III | |
| CF40 Cryo-compact circulator | Julabo | 9400340 | |
| Laser goniometer system | ALV GmbH | ALV / CGS-8F | |
| Multi-tau corretator | ALV GmbH | ALV-7004 | |
| Light scattering electronics | ALV GmbH | ALV / LSE 5004 | |
| Photon counting module | PerkinElmer | SPCM-CD2969 | 2 units in pseudo cross-correlation mode |
| 633 nm HeNe Laser | JDS Uniphase | 1145P | |
| F32 Refrigerated/heating circulator | Julabo | 9312632 |
References
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