Summary
El método en el talón para el marcaje de anticuerpos con moléculas pequeñas permite el etiquetado de una pequeña cantidad de anticuerpos directamente desde el soporte celular. Este método es compatible con la amina y la química de tiol, y puede manejar múltiples muestras en paralelo, de forma manual o utilizando plataformas automatizadas.
Abstract
Anticuerpos marcados con pequeñas moléculas como colorantes fluorescentes, fármacos citotóxicos, y trazadores radiactivos son herramientas esenciales en la investigación biomédica, inmunodiagnóstico y más recientemente como agentes terapéuticos. Los métodos tradicionales para marcar anticuerpos con moléculas pequeñas requieren anticuerpos purificados a una concentración relativamente alta, implican múltiples etapas de diálisis y han limitado el rendimiento. Sin embargo, varias aplicaciones, incluyendo el campo de Drogas de anticuerpos conjugados (ADC), se beneficiarán de nuevos métodos que permitan el etiquetado de anticuerpos directamente desde el soporte de células. Tales métodos pueden permitir que los anticuerpos que se proyectarán en ensayos biológicamente relevantes, por ejemplo, el ensayo de internalización de anticuerpos mediada por el receptor en el caso de ADCs. A continuación, describimos un (método on-perla) método que permite el etiquetado de pequeñas cantidades de anticuerpos directamente desde el soporte celular. Este enfoque utiliza la alta capacidad de la proteína magnética A y la proteína G perlas de afinidad para capturar anticuerposde los medios de células seguido de marcaje con moléculas pequeñas usando ya sea química de amina o tiol y la posterior elución de los anticuerpos marcados. Tomando tintes fluorescentes como sustitutos de moléculas pequeñas, se demuestra el etiquetado en el cordón de tres diferentes anticuerpos de ratón directamente desde el soporte de células utilizando tanto la química amina y tiol etiquetado. La alta afinidad de unión de anticuerpos a la proteína A y la proteína G asegura recuperaciones altas así como una alta pureza de los anticuerpos marcados. Además, el uso de perlas magnéticas permite múltiples muestras para ser manejados manualmente, con lo que mejora significativamente el rendimiento de etiquetado.
Introduction
Anticuerpos marcados con moléculas pequeñas son, quizás, los reactivos usados más comúnmente en biología 1,2. Los anticuerpos marcados con colorantes fluorescentes y biotina se utilizan ampliamente en formación de imágenes, inmunoensayos, citometría de flujo, transferencias de Western, inmunoprecipitación y entre otras aplicaciones 3-6. Los anticuerpos radiomarcados 3,7 encuentran un amplio uso en formación de imágenes y terapia, anticuerpos marcados con fármacos citotóxicos (ADCs) están ofreciendo nuevas opciones para el tratamiento de cánceres, y dos ADC ya han sido aprobados para su uso terapéutico 8. A pesar de su amplio uso, los métodos para marcar anticuerpos se han mantenido sorprendentemente sin cambios y por lo general involucran a múltiples reacciones y desalado pasos 9-12. métodos de solución funcionan muy bien en los casos en que sólo unos pocos anticuerpos deben ser etiquetados y están disponibles en forma altamente purificada en una concentración elevada y en volúmenes suficientes. Sin embargo, para nuevas aplicaciones como ADCs, hay unatenga que marcar anticuerpos en la fase temprana de hibridoma para que puedan ser evaluados para propiedades biológicamente relevantes, por ejemplo, la internalización de anticuerpos mediada por receptores 13-16. En la etapa de hibridoma, los volúmenes de muestra son limitados, los anticuerpos se expresan en concentraciones bajas y un número de muestras son grandes, por lo tanto, métodos de etiquetado a base de soluciones no son adecuados.
Para simplificar y mejorar el rendimiento de los métodos tradicionales de etiquetado de anticuerpos, algunos enfoques alternativos se han propuesto 17,18. Un enfoque consiste en utilizar las proteínas no magnético A perlas de afinidad envasados en pequeñas columnas para capturar anticuerpos seguido de la reacción de marcaje y la elución de la proteína marcada y purificada. Este método se puede utilizar para marcar anticuerpos directamente desde el soporte de células, sin embargo, el uso de columnas puede ser laborioso. Un método basado perla magnética Recientemente se ha informado 19 que elimina el uso de columnas y mejora el rendimiento pero debidoa la capacidad de las perlas de la unión del anticuerpo limitado, solamente nanogramo a cantidades de microgramos bajos de los anticuerpos podría ser etiquetado.
Recientemente hemos desarrollado y utilizado de alta capacidad magnética Proteína A y Proteína G cuentas (> 20 mg de IgG humana / ml de perlas sedentarios) para etiquetar los anticuerpos presentes en los medios de comunicación celular con moléculas pequeñas 20. La alta capacidad de las perlas permite decenas a cientos de microgramos de anticuerpo a ser etiquetados convenientemente y la respuesta magnética rápida de las perlas simplifica el manejo y procesamiento de un gran número de muestras en paralelo. El uso de colorantes fluorescentes como sustitutos de moléculas pequeñas, se muestra que el método es compatible con amina y tiol química etiquetado y ofrece altas recuperaciones de anticuerpos marcados y muy puros.
Este protocolo y el video que lo acompaña describen etiquetado en cordón de anticuerpos de ratón presentes en los medios de células utilizando cuentas de Proteína G magnética A y proteína. El protocolo esdividida en cuatro secciones: Sección 1 describe la captura de anticuerpos en la perla a partir de muestras biológicas. Después de la captura, el etiquetado de los anticuerpos con colorante fluorescente usando química de amina o tiol usando química se describe en las secciones 2 y la sección 3, respectivamente. Finalmente, la sección 4 se describe el método para el cálculo de la concentración de anticuerpos y el colorante a la proporción de anticuerpos.
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Protocol
1. anticuerpo de captura sobre perlas de proteína de alta capacidad magnética A o proteína G Magnética
- Uniformemente vuelva a suspender las perlas magnéticas de agitación suave. Mantener la suspensión uniforme cuando alícuotas de perlas.
- Añadir 50 l de suspensión de perlas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Colocar en el soporte magnético durante 10 s. Con cuidado eliminar el tampón de almacenamiento.
- Añadir 250 l de tampón de unión del anticuerpo.
- Mezclar y colocar en el soporte magnético durante 10 s. Con cuidado, retire el tampón de unión.
- Añadir 1,0 ml de la muestra que contiene 50 a 100 mg de anticuerpo a las perlas. Las muestras se pueden purificar anticuerpos o anticuerpos en los medios de comunicación celular.
- Mezclar la muestra durante 60 min a RT usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo.
- Colocar el tubo en el soporte magnético durante 10 segundos y retirar el sobrenadante.
- Añadir 250 l de tampón de unión / lavado de anticuerpo y mezclar. Colocar en el soporte magnético durante 10 segundos y retirar tampón de unión / lavado. Repita este sTEP para un total de dos lavados.
- Proceda a la Sección 2 de anticuerpos marcadores utilizando la química de amina o la Sección 3 para anticuerpos marcadores utilizando la química de tiol.
2. El anticuerpo etiquetado Uso de Química Amina
- Anticuerpo conjugado
- Añadir 100 ml de tampón de conjugación de amina a las perlas.
- Disolver los colorantes fluorescentes de amina reactiva (AlexaFluor 532-SE) en 10 mg / ml mediante la adición de 100 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 1,0 mg de tinte. Mezclar mediante agitación. Hacer esta solución justo antes de su uso.
- Añadir 2,5 l de colorante reactivo con aminas de 100 mg de anticuerpo.
Nota: Por lo general se recomienda un exceso molar de 5-20 colorante reactivo. Sin embargo, la cantidad de colorante reactivo añadido a necesita ser optimizado empíricamente dependiendo de tinte deseado a la proporción de anticuerpo y las propiedades de anticuerpos intrínsecos la reacción. - Mezclar la muestra durante 60 min a RT usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. Asegúrese de que las cuentas se mantienen en suspensionorte.
- Colocar el tubo en el soporte magnético durante 10 segundos y retirar el sobrenadante.
- Añadir 250 l de tampón de unión / lavado de anticuerpo y mezclar. Colocar en el soporte magnético durante 10 s. Retire y deseche tampón de unión / lavado. Repita este paso para un total de dos lavados.
- recuperación de anticuerpos
- Añadir 50 l de tampón de elución a las perlas.
- Mezclar durante 5 minutos a temperatura ambiente usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. Asegúrese de que las cuentas se mantienen en suspensión.
- Colocar el tubo en el soporte magnético durante 10 s. Retirar la muestra y la transferencia se eluyó a un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene 5 l de tampón de neutralización.
- Repetir el proceso una vez más y aunar las muestras eluidas.
- Cuantificar la concentración de anticuerpos y teñir-a-anticuerpo relación como se describe en la Sección 4.
3. El anticuerpo etiquetado Usando tiol Química
- Reducción de anticuerpos
- Añadir 250 lde tampón de conjugación de tiol y mezcla. Se coloca el tubo en el soporte magnético durante 10 s. Retirar y desechar el tampón. Repita este paso dos veces.
- Añadir 100 ml de tampón de conjugación de tiol.
- Añadir ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 2,5 mM.
- Mezclar la muestra durante 60 min a RT usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. Asegúrese de que las cuentas se mantienen en suspensión.
- Se coloca el tubo en el soporte magnético durante 10 segundos y desechar el tampón.
- Añadir 250 l de tampón de conjugación de tiol y mezclar. Se coloca el tubo en el soporte magnético durante 10 s. Retirar y desechar el tampón. Repita este paso para un total de dos lavados.
- Añadir 100 ml de tampón de conjugación de tiol.
- Anticuerpo conjugado
- Se disuelve el colorante reactivo con tiol en 10 mg / ml mediante la adición de 100 l de DMSO a 1,0 mg de tinte. Mezclar mediante agitación. Hacer esta solución justo antes de su uso.
- Añadir 2,5 l de colorante reactivo con tiol de 100 mg de anticuerpos anticuerpo.
Nota: Por lo general se recomienda un exceso molar de 5-20 colorante reactivo. Sin embargo, la cantidad de colorante reactivo añadido a necesita ser optimizado empíricamente dependiendo de tinte deseado a la proporción de anticuerpo y las propiedades de anticuerpos intrínsecos la reacción. - Mezclar la muestra durante 60 min a RT usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. Asegúrese de que las cuentas se mantienen en suspensión.
- Se coloca el tubo en el soporte magnético durante 10 segundos y retirar el sobrenadante.
- Añadir 250 l de tampón de conjugación de tiol y mezclar. Colocar en el soporte magnético durante 10 segundos y retirar el tampón. Repita este paso para un total de dos lavados.
- Eluir Anticuerpo
- Añadir 50 l de tampón de elución a las perlas.
- Mezclar durante 5 minutos a temperatura ambiente usando un mezclador de vórtice o mezclador de extremo sobre extremo. Asegúrese de que las cuentas se mantienen en suspensión.
- Colocar el tubo en el soporte magnético durante 10 s. Retirar la muestra y la transferencia se eluyó a un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene 5 l de neutralization tampón.
- Repetir el proceso una vez más y aunar las muestras eluidas.
- Cuantificar la concentración de anticuerpos y teñir-a-anticuerpo relación como se describe en la Sección 4.
Relación 4. Calcular la Teñir-a-Anticuerpo
- Medir la absorbancia del conjugado anticuerpo-colorante a 280 nm (A280) y en la λmax para el tinte (Amax).
- Calcular la concentración de anticuerpo:
Anticuerpo Concentración (mg / ml) = A280 - (A max × CF) / 1,4
donde CF = factor de corrección del colorante (proporcionado por el fabricante). - Se calcula la relación de colorantes-anticuerpo a:
Teñir-a-Antibody Ratio (DAR) = (A max × 150.000) / Ab Concentración (mg / ml) x ε colorante
donde, tinte ε = el coeficiente de extinción del colorante en su absorbancia máxima y el peso molecular del anticuerpo = 150000 Da.
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Representative Results
Un esquema para el marcaje de anticuerpos con moléculas pequeñas usando G bolas de alta capacidad de la proteína magnética A y proteína se muestra en la Figura 1. Los anticuerpos capturados en la proteína magnético G cuentas se pueden marcar con moléculas pequeñas, por ejemplo, colorantes fluorescentes, utilizando la química de amina que las etiquetas aminas primarias de los ácidos amino de la lisina o usando química de tiol que las etiquetas en los tioles reducidos en la región bisagra de los anticuerpos. La afinidad entre los anticuerpos y la proteína G es fuerte 21 y da como resultado una pérdida mínima de anticuerpos durante la reacción de marcaje. Esto se refleja en la recuperación eficiente (50-90%) de los tres isotipos de anticuerpos de ratón diferentes (Tabla 1) después de marcar con los colorantes fluorescentes en comparación con la purificación simple. La recuperación eficiente (similar a la reportada antes del 19) también es evidente en los geles de Coomassie (Figura 2), donde la banda intensilazos de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos purificados y anticuerpos marcados reflejar el resultado reportado en la Tabla 1. Proteína Magnetic G bolas tienen propiedades de unión no específica baja resultantes en los anticuerpos de alta pureza como se ve en el gel de Coomassie (Figura 2) y ambos las cadenas pesadas y ligeras están etiquetados con fluorescencia (Figura 2). Etiquetado on-talón también se puede hacer sobre perlas de proteína A magnéticos y es compatible con múltiples colorantes fluorescentes que resultan en alta recuperación y buena tinte a las relaciones de anticuerpos (Tabla 2).
Figura 1. Esquema de etiquetado en el cordón de anticuerpos con moléculas fluorescentes. (A) el etiquetado de anticuerpos usando química de tiol. Los anticuerpos son capturados en alta capacidad magnética proteína A o proteína G magnética bEADS seguido de la reducción de los enlaces disulfuro entre cadenas utilizando agentes reductores como la TDT o tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP). maleimida tiol-reactivo que contiene colorantes fluorescentes se añaden a los anticuerpos de la etiqueta. anticuerpos marcados se recuperan por elución bajo pH y neutralizaron inmediatamente. (B) el etiquetado de anticuerpos usando química de amina. Los anticuerpos capturados en la alta capacidad de la proteína magnética A y proteína g de perlas se hacen reaccionar con los colorantes fluorescentes de amina reactiva para marcar anticuerpos en las aminas primarias de las lisinas. anticuerpos marcados se eluyen por la baja elución de pH y neutralizaron inmediatamente. Adaptado de Nath, N. et al., 20 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La desnaturalización SImágenes de gel DS-PAGE de tres ratón isotipos de IgG purificada y marcada con AlexaFluor 532, utilizando el método on-perla. (A) amina de reacción (B) reacción de tiol. Gel imágenes de anticuerpos marcados con colorante reactivo con tiol. Los carriles 1-6 corresponde a las muestras mostradas en la Tabla 1. Los geles fueron imágenes primero usando escáner fluorescente y muestran sólo AlexaFluor 532 anticuerpo marcado cadenas pesadas y ligeras. Muestras en las que solamente anticuerpos se purificaron no son visibles. Los geles se tiñeron posteriormente con tinción de Coomassie para mostrar cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos que se purificaron así como anticuerpos que fueron etiquetados. Adaptado de Nath, N. et al., 20 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reacción amina | La reacción de tiol | |||||
| Bien | isotipo | Anticuerpo de recuperación (g) | Dye a Relación de anticuerpos | Anticuerpo de recuperación (g) | Dye a Relación de anticuerpos | |
| 1 | ratón IgG1 | Purificación | 54,8 ± 1,8 | 0 | 49,2 ± 2,0 | 0 |
| 2 | Conjugación | 27,4 ± 3,2 | 4,2 ± 0,2 | 46,2 ± 3,5 | 1,6 ± 0,2 | |
| 3 | IgG2a de ratón | Purificación | 85,9 ± 6,4 | 0 | 75,3 ± 8,0 | 0 |
| 4 | Conjugación | 60,7 ± 3,2 | 4,4 ± 0,1 | 61,5 ± 7,4 | 5,5 ± 0,4 | |
| 5 | IgG2b de ratón | Purificación | 79,9 ± 6,9 | 0 | 73,3 ± 1,4 | 0 |
| 6 | Conjugación | 66,7 ± 0,5 | 5,6 ± 0,1 | 55,7 ± 0,9 | 5,2 ± 0,5 | |
Tabla 1:.-Etiquetado de bolas en de tres isotipos de IgG de ratón directamente desde el soporte de células usando químicas amina y tiol Para cada muestra, una alícuota de 1,0 ml de medio celular fue utilizado sólo para la purificación de anticuerpos utilizando proteína G cuentas magnéticas (suspensión al 50 l) y segunda alícuota se utilizó para etiquetar en-perlas con 532 AlexaFluor colorante reactivo con aminas. Se calcularon las recuperaciones de anticuerpos en ambos casos (como se describe en el texto) unad en comparación para determinar las pérdidas de anticuerpos durante la reacción de marcaje. Dye a relación de anticuerpo también se calculó para los tres anticuerpos. Todas las reacciones se realizaron por triplicado. Adaptado de Nath, N. et al. 20
| Cuentas de Proteína G magnética | Cuentas de Proteína A magnética | ||||
| Anticuerpo de recuperación (g) | Dye a Relación de anticuerpos | Anticuerpo de recuperación (g) | Dye a Relación de anticuerpos | ||
| 1 | Purificación | 263,7 ± 10,4 | 0 | 269,4 ± 5,1 | 0 |
| 2 | AlexaFluor532 | 182,9 ± 15,3 | 5.377; 0.04 | 189,1 ± 6,9 | 6,9 ± 0,2 |
| 3 | AlexaFluor647 | 192,5 ± 2,9 | 3,3 ± 0,1 | 112,3 ± 11,4 | 3,6 ± 0,2 |
| 4 | fluoresceína | 179,5 ± 5,3 | 6,8 ± 0,1 | 201,5 ± 6,5 | 6,8 ± 0,1 |
Tabla 2:. Etiquetado On-cordón de IgG2a de ratón con tres diferentes colorantes fluorescentes tiol reactiva muestras de medio de células concentradas se utilizaron en este experimento para mostrar que el método también puede adoptarse para diferentes cantidades de anticuerpo. Además, las reacciones de conjugación se realizaron utilizando proteína G magnética, así como la proteína magnética A. Una alícuota de 1,0 ml se concentraron medio celular fue utilizado para la purificación de anticuerpos usando proteína Magnetic perlas de G (100 en suspensión espesa l). otros tres alícuota de 1,0 mls se marcaron y se purificó con AlexaFluor reactivo con tiol 532, AlexaFluor 647 y fluoresceína. Se calcularon las recuperaciones de anticuerpo (como se describe en el texto) y comparación de varias reacciones de etiquetado. Dye a relación de anticuerpo también se calculó para los tres colorantes fluorescentes. purificación y etiquetado similar fue realizado usando perlas de Proteína A magnética. Todas las reacciones se realizaron por triplicado. Adaptado de Nath, N. y col '20.
| Buffer | Comentarios / Descripción |
| tampón amina conjugación (tampón bicarbonato sódico 10 mM, pH 8,5) | 1. 0.084 g de bicarbonato de sodio 2. Disolver en agua desionizada. Ajustar a pH 8,5. 3. Ajuste el volumen final a 100 ml con agua desionizada. |
| tampón de conjugación de tiol (tampón fosfato 10 mM con EDTA 1 mM, pH 7.0) | 1. 0,0378 g de fosfato de sodio monobásico, monohidrato 2. 0,195 g de fosfato de sodio dibásico, heptahidrato 3. Disolver en agua desionizada. 4. Añadir EDTA a una concentración final de 1,0 mM. 5. Ajustar a pH 7. 6. Ajuste el volumen final a 100 ml con agua desionizada. |
| tampón de unión de anticuerpo / de lavado (tampón fosfato 10 mM, pH 7,0) | 1. 0,0378 g de fosfato de sodio monobásico, monohidrato 2. 0,195 g de fosfato de sodio dibásico, heptahidrato 3. Disolver en agua desionizada. Ajustar a pH 7. 4. Ajuste el volumen final a 100 ml con agua desionizada. |
| tampón de elución (50 mM de tampón glicina, pH 2,7) | 1. 0,188 g de glicina 2. Disolver en agua desionizada. Ajustar el pH a 2,7 con HCl. 3. Ajuste el volumen final a 50 ml con agua desionizada. |
| tampón de neutralización (2 M Tris, pH 7,5) | 1. 0,472 gla base de trizma 2. 2,54 g de clorhidrato de Trizma 3. Disolver en agua desionizada. Ajustar a pH 7,5. 4. Ajuste el volumen final a 10 ml con agua desionizada. |
Tabla 3: composiciones de búfer.
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Discussion
El objetivo de este estudio fue desarrollar un método para marcar anticuerpos, presentes en el medio celular a bajas concentraciones, con una variedad de moléculas pequeñas. Tal método permitirá a un gran número de anticuerpos, durante las primeras etapas de descubrimiento de anticuerpos, para ser etiquetados con moléculas pequeñas y se tamiza usando un ensayo biológicamente relevante. Uno de tales ensayos es el ensayo de internalización de anticuerpos mediada por el receptor, donde la internalización puede variar entre los anticuerpos incluso con afinidades de unión similares. Por lo tanto, es importante para detectar anticuerpos específicamente por sus propiedades de internalización, además de la enzima tradicional cribado basado ensayo inmunoenzimático (ELISA). Los requisitos fundamentales para el método para marcar anticuerpos en la fase de desarrollo de anticuerpos principios son los siguientes: a) capacidad para marcar anticuerpos directamente desde los medios de comunicación celular; b) la capacidad para marcar anticuerpos presentes en bajas concentraciones, por ejemplo, cuando la concentración de anticuerpo en los medios de células es de 50 mg / ml; do)pureza de la concentración de anticuerpo y el anticuerpo marcado debe ser compatible con las aplicaciones posteriores; d) el método debería ser compatible tanto con amina y química de conjugación basado tiol; e) el método debería ser compatible con el procesamiento de múltiples muestras simultáneamente.
Teniendo en cuenta estos requisitos, hemos desarrollado un método de marcaje y purificación de grano-anticuerpo utilizando magnética de alta capacidad de la proteína A y la proteína G bolas. Estas perlas se basan en celulosa hidrófila con propiedades de unión no específica baja y resultan en la preparación de anticuerpos de alta pureza como se muestra en la Figura 2. La alta capacidad de las perlas significa que una pequeña cantidad de perlas puede capturar eficientemente anticuerpos a partir de los medios de comunicación y los anticuerpos pueden eluirse en un pequeño volumen, por tanto, la concentración de los anticuerpos. En la Tabla 1, sólo 10 l establecieron perlas se utilizan para capturar los anticuerpos a partir de 1,0 ml de muestras (concentraciones esperadas 50-100 g / ml) unad anticuerpos marcados se eluyeron en un volumen de 120 l a concentraciones entre 200 a 500 mg / ml. Estas concentraciones son compatibles con basados en células experimentos de internalización donde las concentraciones típicas de anticuerpo intervalo de 1,0 mg / ml a 10 ng / ml 15,16. El método de etiquetado en el talón es compatible tanto con amina y químicas de tiol y una amplia gama de relaciones de colorantes-a anticuerpo puede lograrse junto con la recuperación eficiente de los anticuerpos marcados (Tabla 1). Los experimentos se realizaron por triplicado y hasta 12 muestras fueron manejados en paralelo de forma manual, lo que reduce significativamente el tiempo de procesamiento. El rendimiento de la etiqueta se podría aumentar aún más mediante el uso de plataformas robóticas como se ha demostrado en otras aplicaciones que utilizan perlas magnéticas 19,22.
Las muestras con anticuerpo cantidad más alta se puede acomodar fácilmente mediante el aumento de la cantidad de perlas utilizado para la captura mientras se mantiene la recuperación de anticuerpos y efficie etiquetadoNCY (Tabla 2). El método también es compatible con múltiples tintes de manera que diversos conjugados de anticuerpo de tinte se pueden hacer, sin embargo, tendrán que ser optimizado relaciones de colorantes-a anticuerpos. Dye a relación de anticuerpo de 2 a 4 se ha determinado que es óptima 11,12 y en el caso de ADCs aprobados una media de 3,5 fármacos por anticuerpo ha informado 23. Con química de conjugación en el talón, es relativamente fácil de ajustar un número óptimo de molécula pequeña por anticuerpo en función de los requisitos de la aplicación de aguas abajo. Además, tanto la química tiol y amina para el etiquetado puede ser analizada para determinar la mejor opción química que es crítico para ADCs ya que se ha demostrado que el antígeno y la unión al receptor, la estabilidad in vivo, y la actividad terapéutica de anticuerpo depende de la química de conjugación 24 , 25.
Hay algunos factores clave para alcanzar un buen etiquetado de anticuerpos y la recuperación. Las propiedades de la molécula pequeña unare el conductor fundamental tanto para la recuperación del anticuerpo y el tinte a la proporción de anticuerpos. Para una pequeña molécula hidrófoba, de alta colorante a la proporción de anticuerpo hará que se pegue no específica del anticuerpo marcado a la perla y la recuperación de anticuerpo reducido de manera significativa. A veces, dependiendo el tinte y las características de anticuerpos, se encontró que una perla puede funcionar mejor que otro, por lo tanto, las pruebas tanto de los granos durante la optimización puede ser útil. La proteína A y la proteína G tienen diferentes afinidades para 21 anticuerpos de diferentes especies y de diferentes subtipos, que deben tenerse en cuenta al seleccionar las cuentas apropiadas. Por ejemplo, la proteína A tiene una baja afinidad por IgG1 de ratón, por tanto, la proteína G bolas son muy recomendables. Para la química tiol, agentes reductores de TDT y TCEP funcionan igual de bien. Sin embargo TDT va a interferir con la reacción de maleimida, por tanto, debe ser eliminado por completo mediante lavado. El pH bajo de 2,7, se recomienda para la elución, pero pH menor de 2,2 se puede requerir para rec eficienteovery en algunos casos. Para los anticuerpos marcados que pueden desnaturalizar a pH bajo un equilibrio entre la recuperación eficiente y la funcionalidad del anticuerpo tendrá que ser determinado empíricamente. Es bien conocido que la química de etiquetado puede afectar a la actividad de unión antígeno-anticuerpo 11,23, por lo tanto, es absolutamente necesario para la prueba de funcionalidad de anticuerpos después de etiquetado usando la aplicación de aguas abajo deseada.
En resumen, se describe un método para marcar anticuerpos con colorantes fluorescentes directamente desde los medios de comunicación celular sin ninguna etapa de purificación anteriores. Este método aprovecha la alta capacidad de la proteína magnética A y la proteína G perlas y es una mejora significativa sobre el método de etiquetado basado solución que requiere anticuerpos de alta pureza a altas concentraciones de 10,11. El uso de perlas magnéticas permite manual, así como el manejo de muestras automatizado, que es una ventaja sobre las técnicas de etiquetado de talón no magnético basado 17,18. Por último, el uso de alta capacidad beads permiten escala de reacción de marcaje de anticuerpos de los bajos niveles de microgramos a cientos de microgramos utilizando pequeñas cantidades de granos y diferencia este método de otros métodos de marcaje basados perla magnética 19. El protocolo que se presenta aquí describe el etiquetado de anticuerpos con colorantes fluorescentes, pero el método puede ser extendido a otras etiquetas que incluyen biotina, fármacos citotóxicos y posiblemente enzimas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
References
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