Summary
Il metodo on-tallone per etichettare anticorpi con piccole molecole permette l'etichettatura di una piccola quantità di anticorpi direttamente dal supporto cellulare. Questo metodo è compatibile con ammina e chimica tiolo, e può gestire campioni multipli in parallelo, manualmente o utilizzando piattaforme automatizzate.
Abstract
Anticorpi marcati con piccole molecole come coloranti fluorescenti, farmaci citotossici, e traccianti radioattivi sono strumenti essenziali nella ricerca biomedica, immunodiagnostica e più recentemente come agenti terapeutici. I metodi tradizionali per gli anticorpi di etichettatura con piccole molecole richiedono anticorpi purificati in concentrazione relativamente alta, coinvolgono più passaggi dialisi ed hanno limitato il throughput. Tuttavia, diverse applicazioni, tra cui il campo di anticorpi coniugati farmaco (ADC), potranno beneficiare di nuovi metodi che consentano l'etichettatura di anticorpi direttamente dal supporto di cellule. Tali metodi possono consentire anticorpi proiettati in saggi biologicamente rilevanti, ad esempio, il dosaggio degli anticorpi internalizzazione mediata da recettori nel caso di ADC. Qui, descriviamo un (metodo on-tallone) metodo che consente l'etichettatura di piccole quantità di anticorpi direttamente dal supporto di cellule. Questo approccio utilizza ad alta capacità magnetica proteina A e la proteina G perline affinità per catturare gli anticorpidal supporto di cellule seguita da marcatura con piccole molecole utilizzando sia ammina o chimica tiolo e successiva eluizione degli anticorpi marcati. Prendendo coloranti fluorescenti come surrogati per le piccole molecole, dimostriamo l'etichettatura on-tallone di tre diversi anticorpi di topo direttamente dal supporto di cellule utilizzando sia ammina e tiolo chimica etichettatura. L'elevata affinità di legame di anticorpi anti proteine A e proteine G garantisce elevati recuperi, nonché di elevata purezza degli anticorpi marcati. Inoltre, l'uso di sfere magnetiche consente a più campioni vengano maneggiati manualmente, migliorando così significativamente il throughput di etichettatura.
Introduction
Gli anticorpi marcati con piccole molecole sono forse i reagenti più utilizzati in biologia 1,2. Anticorpi marcati con coloranti fluorescenti e biotina sono ampiamente utilizzati nella diagnostica per immagini, immunodosaggi, citometria a flusso, Western blot e immunoprecipitazione tra le altre applicazioni 3-6. Anticorpi radiomarcati 3,7 trovano ampio utilizzo nella diagnostica per immagini e la terapia, gli anticorpi marcati con farmaci citotossici (ADC) stanno offrendo nuove opzioni per il trattamento dei tumori, e due ADC sono già stati approvati per uso terapeutico 8. Nonostante il loro ampio uso, le modalità di etichettatura anticorpi sono rimasti sorprendentemente invariate e di solito sono molteplici reazioni e dissalazione passi 9-12. metodi di soluzione funzionano molto bene nei casi in cui deve essere etichettato solo pochi anticorpi e sono disponibili in forma altamente purificata ad alta concentrazione e in volumi sufficienti. Tuttavia, per le applicazioni più recenti come ADC, vi è unnecessario etichettare anticorpi nella fase ibridoma presto in modo che possano essere sottoposti a screening per proprietà biologicamente rilevanti, ad esempio, recettore-mediata anticorpo internalizzazione 13-16. Nella fase ibridoma, volumi di campione sono limitati, gli anticorpi sono espressi a basse concentrazioni e un numero di campioni sono grandi, quindi metodi di etichettatura di soluzioni basate non sono adatti.
Al fine di semplificare e migliorare il throughput dei tradizionali metodi di etichettatura degli anticorpi, alcuni approcci alternativi sono stati proposti 17,18. Un approccio consiste nell'utilizzare Protein amagnetico A perline affinità confezionati in piccole colonne di catturare anticorpi seguita dalla reazione di marcatura ed eluizione di proteina marcata e purificata. Questo metodo può essere utilizzato per etichettare anticorpi direttamente dal supporto cellulare, tuttavia, l'uso di colonne può essere laborioso. Un metodo basato branello magnetico è stato recentemente riportato 19 che elimina l'uso di colonne e produttività ma a causa miglioraall'anticorpo limitata capacità delle perline vincolante, solo nanogrammo a basse quantità microgrammi di anticorpi potrebbe essere etichettato.
Recentemente abbiamo sviluppato e usato ad alta capacità magnetica Proteina A e Proteine perline G (> 20 mg di IgG umana / ml di perline stanziali) di etichettare gli anticorpi presenti nei mezzi di cella con piccole molecole 20. L'elevata capacità delle perle permette decine a centinaia di microgrammi di anticorpo da etichettare convenientemente e la risposta magnetica rapida delle perline semplifica la gestione e il trattamento di un gran numero di campioni in parallelo. Utilizzando coloranti fluorescenti come surrogati per le piccole molecole, si dimostra che il metodo è compatibile con ammina e tiolo etichettatura chimica e offre alti recuperi di anticorpi marcati e molto puri.
Questo protocollo e il video di accompagnamento descrivono l'etichettatura on-tallone di anticorpi di topo presenti nei mezzi di comunicazione cellulari che utilizzano proteine magnetica A e G proteina perline. Il protocollo èsuddiviso in quattro sezioni: Sezione 1 descrive la cattura di anticorpi sul tallone da campioni biologici. Dopo la cattura, l'etichettatura di anticorpi con colorante fluorescente che utilizzano la chimica ammina o che utilizzano la chimica tiolo è descritta nelle sezioni 2 e la sezione 3, rispettivamente. Infine, la sezione 4 descrive il metodo per il calcolo della concentrazione di anticorpo e il colorante rapporto anticorpo.
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Protocol
1. anticorpo di cattura su Perle G ad alta capacità di proteine magnetica A o proteine magnetica
- Uniformemente ri-sospendere sfere magnetiche di agitando delicatamente. Mantenere la divisa di sospensione quando si dispensa perle.
- Aggiungere 50 ml di perline liquami in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Mettere nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere con attenzione il buffer di stoccaggio.
- Aggiungere 250 microlitri di anticorpi tampone vincolante.
- Mescolare e posizionare nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere con attenzione il tampone di legame.
- Aggiungere 1,0 ml di campione contenente 50-100 mg di anticorpi ai talloni. I campioni possono essere purificati anticorpi o anticorpi in supporti delle cellule.
- Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end.
- Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 250 microlitri di anticorpi tampone di legame / lavaggio e mescolare. Mettere nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il tampone vincolante / lavaggio. Ripetere questo sTEP per un totale di due lavaggi.
- Procedere alla sezione 2 di anticorpi di etichette che utilizzano la chimica ammina o alla Sezione 3 per gli anticorpi etichetta con tiolo chimica.
2. Anticorpo Labeling Utilizzando Amine Chimica
- Coniugato anticorpo
- Aggiungere 100 ml di tampone ammina coniugazione ai talloni.
- Sciogliere i coloranti fluorescenti ammina reattiva (AlexaFluor 532-SE): 10 mg / ml aggiungendo 100 ml di dimetilsolfossido (DMSO) a 1,0 mg di colorante. Mescolare nel vortex. Rendere questa soluzione al momento dell'uso.
- Aggiungere 2,5 ml di tintura amminico reattivo per 100 mg di anticorpo.
Nota: in genere si raccomanda un 5-20 molare eccesso di colorante reattivo. Tuttavia, quantità di colorante reattivo aggiunto alla reazione deve essere empiricamente ottimizzata a seconda colorante desiderato rapporto anticorpi e intrinseche proprietà anticorpi. - Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in suspension.
- Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 250 microlitri di anticorpi tampone di legame / lavaggio e mescolare. Mettere nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere e gettare tampone di legame / lavaggio. Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi.
- anticorpo di recupero
- Aggiungere 50 ml di tampone di eluizione ai talloni.
- Mescolare per 5 minuti a temperatura ambiente usando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione.
- Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere campione eluito e trasferimento in un nuovo tubo micro-centrifuga contenente 5 ml di tampone di neutralizzazione.
- Ripetere il processo ancora una volta e in comune i campioni eluiti.
- Quantificare la concentrazione di anticorpi e tingere-to-anticorpo rapporto come descritto nella Sezione 4.
3. Anticorpo etichettatura Utilizzando Thiol Chimica
- anticorpo Riduzione
- Aggiungere 250 microlitridi tampone coniugazione tiolo e mix. Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere ed eliminare il buffer. Ripetere questa operazione due volte.
- Aggiungere 100 ml di tampone coniugazione tiolo.
- Aggiungere ditiotreitolo (DTT) ad una concentrazione finale di 2,5 mM.
- Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione.
- Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e scartare il buffer.
- Aggiungere 250 ml di tampone coniugazione tiolo e mescolare. Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere ed eliminare il buffer. Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi.
- Aggiungere 100 ml di tampone coniugazione tiolo.
- Coniugato anticorpo
- Sciogliere il colorante tiolo reattivo a 10 mg / ml aggiungendo 100 ml di DMSO a 1,0 mg di colorante. Mescolare nel vortex. Rendere questa soluzione al momento dell'uso.
- Aggiungere 2,5 ml di tintura tiolo reattivo per 100 mg di anti-corpo.
Nota: in genere si raccomanda un 5-20 molare eccesso di colorante reattivo. Tuttavia, quantità di colorante reattivo aggiunto alla reazione deve essere empiricamente ottimizzata a seconda colorante desiderato rapporto anticorpi e intrinseche proprietà anticorpi. - Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione.
- Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 250 ml di tampone coniugazione tiolo e mescolare. Posizionare nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il tampone. Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi.
- Elute anticorpo
- Aggiungere 50 ml di tampone di eluizione ai talloni.
- Mescolare per 5 minuti a temperatura ambiente usando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione.
- Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere campione eluito e trasferimento in un nuovo tubo micro-centrifuga contenente 5 ml di neutBuffer ralization.
- Ripetere il processo ancora una volta e in comune i campioni eluiti.
- Quantificare la concentrazione di anticorpi e tingere-to-anticorpo rapporto come descritto nella Sezione 4.
Rapporto 4. Calcolare Dye-to-anticorpo
- Misurare l'assorbanza del coniugato anticorpo-dye a 280 nm (A280) e alla λmax per il colorante (Amax).
- Calcolare la concentrazione di anticorpi:
Anticorpo Concentrazione (mg / ml) = A280 - (A max × CF) / 1.4
dove CF = fattore di correzione del colorante (fornita dal produttore). - Calcolare il rapporto dye-to-anticorpi:
Dye-to-anticorpo Ratio (DAR) = (A max × 150.000) / Ab Concentrazione (mg / ml) × ε colorante
dove, tintura ε = coefficiente di estinzione del colorante al massimo assorbimento e il peso molecolare di anticorpo = 150.000 Da.
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Representative Results
Uno schema per l'etichettatura anticorpi con piccole molecole con elevata capacità Protein magnetico A e proteina G perline è mostrato in Figura 1. Anticorpi catturato sulla proteina magnetica perline G possono essere etichettati con piccole molecole, per coloranti fluorescenti esempio, utilizzando la chimica ammina quali etichette ammine primarie degli acidi lisina amminoacidi o utilizzando la chimica tiolo che le etichette ai tioli ridotti nella regione cerniera degli anticorpi. Affinità fra gli anticorpi e proteine G è forte 21 e si traduce in perdita minima di anticorpi durante la reazione di marcatura. Ciò si riflette nel recupero efficiente (50-90%) di tre differenti isotipi anticorpali topo (Tabella 1) dopo marcatura con coloranti fluorescenti rispetto al semplice depurazione. Recupero efficiente (simile a quello riportato prima del 19) è evidente anche nei gel Coomassie (Figura 2), dove banda intensilegami delle catene pesanti e leggere di anticorpi purificati e anticorpi marcati riflettere il risultato riportato in Tabella 1. Proteina magnetico G perline hanno bassi proprietà non specifici vincolanti conseguente anticorpi altamente purificati come visto nel gel Coomassie (Figura 2) ed entrambi le catene pesanti e leggere sono fluorescente (Figura 2). Etichettatura on-tallone può anche essere fatto su proteina A perline magnetiche ed è compatibile con coloranti fluorescenti multipli con conseguente forte recupero e tintura ai rapporti di anticorpi (Tabella 2).
Figura 1. Schema di etichettatura sul cordolo di anticorpi con molecole fluorescenti. (A) l'etichettatura di anticorpi usando la chimica tiolo. Gli anticorpi vengono catturati sulla capacità elevata di proteine magnetico A o proteine magnetica G Beads seguita da riduzione dei ponti disolfuro inter-catena con agenti riducenti come DTT o tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP). maleimmide tiolo-reattiva contenente coloranti fluorescenti vengono aggiunti agli anticorpi di etichette. anticorpi marcati vengono recuperati da una bassa eluizione pH e neutralizzati immediatamente. (B) l'etichettatura degli anticorpi usando la chimica ammina. Gli anticorpi catturati sulla capacità elevata di proteine magnetico A e proteine perline G vengono fatte reagire con coloranti fluorescenti ammina reattiva per etichettare gli anticorpi alle ammine primarie delle lisine. anticorpi marcati sono eluiti dal basso eluizione pH e neutralizzati immediatamente. Adattato da Nath, N. et al. 20 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. La denaturazione SDS-PAGE immagini gel di tre topo IgG isotipi purificato e marcato con AlexaFluor 532, utilizzando il metodo on-tallone. (A) Amine reazione (B) reazione Thiol. immagini di gel di anticorpi marcati con la tintura tiolo-reattiva. Lanes 1-6 corrisponde ai campioni indicati nella tabella 1. Gel sono stati prima ripreso con scanner a fluorescenza e mostrare solo AlexaFluor 532 anticorpo marcato catene pesanti e leggere. I campioni in cui anticorpi sono stati purificati solo non sono visibili. I gel sono stati successivamente colorati con Coomassie macchia visualizzare catene pesanti e leggere di anticorpi che sono stati purificati e anticorpi che sono stati etichettati. Adattato da Nath, N. et al. 20 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Amine Reazione | Reazione tiolo | |||||
| Bene | isotipo | Anticorpo di recupero (mg) | Dye Rapporto Anticorpo | Anticorpo di recupero (mg) | Dye Rapporto Anticorpo | |
| 1 | topo IgG1 | Purificazione | 54.8 ± 1.8 | 0 | 49.2 ± 2.0 | 0 |
| 2 | Coniugazione | 27.4 ± 3.2 | 4.2 ± 0.2 | 46.2 ± 3.5 | 1.6 ± 0.2 | |
| 3 | topo IgG2a | Purificazione | 85.9 ± 6.4 | 0 | 75.3 ± 8.0 | 0 |
| 4 | Conjugzione | 60.7 ± 3.2 | 4.4 ± 0.1 | 61.5 ± 7.4 | 5.5 ± 0.4 | |
| 5 | topo IgG2b | Purificazione | 79.9 ± 6.9 | 0 | 73.3 ± 1.4 | 0 |
| 6 | Coniugazione | 66,7 ± 0,5 | 5.6 ± 0.1 | 55.7 ± 0.9 | 5.2 ± 0.5 | |
Tabella 1:. Etichettatura on-goccia di tre isotipi IgG di topo direttamente da supporti cellulare utilizzando ammine e tiolo chimiche Per ogni campione, una aliquota di 1,0 ml di mezzi delle cellule è stata utilizzata solo per la purificazione degli anticorpi utilizzando proteine magnetica G perline (50 ml) e liquami seconda aliquota è stato utilizzato per l'etichettatura sul tallone con AlexaFluor 532 tintura ammina-reattiva. recuperi Anticorpo in entrambi i casi sono stati calcolati (come descritto nel testo) undie rispetto per determinare le perdite di anticorpi durante la reazione di marcatura. Dye rapporto anticorpo è stato anche calcolato per tutti i tre anticorpi. Tutte le reazioni sono state fatte in triplicato. Adattato da Nath, N. et al. 20
| Perle G proteine magnetica | Perle di proteine magnetica A | ||||
| Anticorpo di recupero (mg) | Dye Rapporto anticorpo | Anticorpo di recupero (mg) | Dye Rapporto anticorpo | ||
| 1 | Purificazione | 263,7 ± 10,4 | 0 | 269,4 ± 5.1 | 0 |
| 2 | AlexaFluor532 | 182,9 ± 15.3 | 5.377; 0.04 | 189.1 ± 6.9 | 6.9 ± 0.2 |
| 3 | AlexaFluor647 | 192.5 ± 2.9 | 3.3 ± 0.1 | 112.3 ± 11.4 | 3.6 ± 0.2 |
| 4 | fluoresceina | 179.5 ± 5.3 | 6.8 ± 0.1 | 201.5 ± 6.5 | 6.8 ± 0.1 |
Tabella 2:. Etichettatura On-tallone di IgG2a mouse con tre diversi coloranti fluorescenti tiolo reattivo campioni di supporti cellulare concentrata vengono usati in questo esperimento per dimostrare che il metodo può essere adottata anche per diverse quantità di anticorpi. Inoltre, le reazioni di coniugazione sono stati eseguiti utilizzando proteine G magnetico oltre che di proteine magnetico A. Una aliquota di 1,0 ml concentrato supporti cellulare è stato utilizzato per la purificazione degli anticorpi utilizzando proteine magnetica G perline (100 ml slurry). altri tre aliquota 1,0 mls sono stati etichettati e purificato con tiolo-reattiva AlexaFluor 532, 647 e AlexaFluor fluoresceina. recuperi Anticorpo sono stati calcolati (come descritto nel testo) e confrontati per varie reazioni di marcatura. Dye rapporto anticorpo è stato anche calcolato per tutti e tre i coloranti fluorescenti. purificazione simile e l'etichettatura è stato fatto utilizzando proteine Magnetic un perline. Tutte le reazioni sono state fatte in triplicato. Adattato da Nath, N. et al '20.
| Buffer | Commenti / Descrizione |
| tampone Amine coniugazione (10 mM tampone bicarbonato di sodio, pH 8,5) | 1. 0,084 g di bicarbonato di sodio 2. Sciogliere in acqua deionizzata. Regolare a pH 8,5. 3. Regolare il volume finale di 100 ml con acqua deionizzata. |
| tampone di coniugazione tiolo (10 mM tampone fosfato con 1 mM EDTA, pH 7.0) | 1. 0,0378 g di sodio fosfato monobasico, monoidrato 2. 0,195 g di sodio fosfato, dibasico, eptaidrato 3. Sciogliere in acqua deionizzata. 4. Aggiungere EDTA ad una concentrazione finale di 1,0 mM. 5. Regolare a pH 7. 6. Regolare il volume finale di 100 ml con acqua deionizzata. |
| Anticorpo tampone di legame / lavaggio (10 mM tampone fosfato, pH 7.0) | 1. 0,0378 g di sodio fosfato monobasico, monoidrato 2. 0,195 g di sodio fosfato, dibasico, eptaidrato 3. Sciogliere in acqua deionizzata. Regolare a pH 7. 4. Regolare il volume finale di 100 ml con acqua deionizzata. |
| tampone di eluizione (50 mm Glycine Buffer, pH 2.7) | 1. 0,188 g glicina 2. Sciogliere in acqua deionizzata. Regolare il pH a 2,7 con HCl. 3. Regolare il volume finale di 50 ml con acqua deionizzata. |
| tampone di neutralizzazione (2 M tampone tris, pH 7.5) | 1. 0,472 gTrizma base 2. 2,54 g trizma cloridrato 3. Sciogliere in acqua deionizzata. Regolare a pH 7.5. 4. Regolare il volume finale di 10 ml con acqua deionizzata. |
Tabella 3: composizioni buffer.
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Discussion
L'obiettivo di questo studio era di sviluppare un metodo per etichettare anticorpi, presenti nei mezzi di cella a basse concentrazioni, con una varietà di piccole molecole. Tale metodo permette un gran numero di anticorpi, durante le prime fasi di scoperta di anticorpi, etichettato con piccole molecole e schermati con un saggio biologicamente rilevante. Uno di questi test è il test degli anticorpi internalizzazione mediata dai recettori in cui internalizzazione può variare tra gli anticorpi anche con affinità simili vincolanti. Quindi, è importante per lo screening anticorpi specificamente per le loro proprietà internalizzazione oltre a Enzyme tradizionale Immunoenzimatico Assay (ELISA) di screening basato. I requisiti fondamentali per il metodo di etichettare gli anticorpi in fase di sviluppo di anticorpi precoce sono: a) la capacità di etichettare gli anticorpi direttamente da supporti delle cellule; b) capacità di etichettare anticorpi presenti a basse concentrazioni, per esempio quando la concentrazione dell'anticorpo nel supporto cella è di 50 mg / ml; c)purezza della concentrazione dell'anticorpo e anticorpo marcato dovrebbe essere compatibile con applicazioni a valle; d) il metodo dovrebbe essere compatibile sia con ammine e tiolo chimica coniugazione base; e) il metodo deve essere compatibile con l'elaborazione di campioni multipli contemporaneamente.
Considerando queste esigenze, abbiamo sviluppato un metodo di etichettatura e purificazione on-tallone di anticorpi con alta capacità magnetica proteina A e proteine G perline. Queste perle sono basati su cellulosa idrofilo con bassa non-specifiche proprietà leganti e determinano la preparazione di anticorpi altamente puro come mostrato in Figura 2. L'elevata capacità delle perline significa che una piccola quantità di perline può catturare efficacemente anticorpi dei media e anticorpi possono essere eluita in un piccolo volume quindi concentrare gli anticorpi. In Tabella 1, solo 10 microlitri regolate perline sono stati usati per catturare anticorpi da 1,0 ml campioni (concentrazioni previste 50-100 ug / ml) and anticorpi marcati sono stati eluiti in un volume di 120 microlitri a concentrazioni comprese tra 200-500 mcg / ml. Queste concentrazioni sono compatibili con gli esperimenti di internalizzazione delle cellule basato in cui le concentrazioni di anticorpi tipici vanno da 1,0 mg / ml a 10 ng / ml 15,16. Il metodo di etichettatura on-perla è compatibile sia con ammina e chimiche tiolo e una vasta gamma di rapporti dye-to-anticorpo può essere realizzato insieme con recupero efficiente degli anticorpi marcati (Tabella 1). Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e fino a 12 campioni sono stati trattati in parallelo manualmente, riducendo notevolmente il tempo di elaborazione. La velocità di etichettatura può essere ulteriormente aumentata utilizzando piattaforme robotiche come è stato dimostrato in altre applicazioni utilizzando biglie magnetiche 19,22.
Campioni con quantità di anticorpi superiore possono essere facilmente adattati aumentando la quantità di perline utilizzato per la cattura mantenendo il recupero anticorpi e etichettatura efficiency (Tabella 2). Il metodo è anche compatibile con più coloranti modo che i vari coniugati di anticorpi colorante può essere fatto, tuttavia, dovranno essere ottimizzati dye-to-anticorpo rapporti. Dye rapporto anticorpo di 2-4 è stato determinato per essere ottimali 11,12 e, nel caso di ADC approvato una media di 3,5 farmaci per anticorpo è stato segnalato 23. Con on-tallone chimica coniugazione, è relativamente facile da sintonizzare un numero ottimale di piccola molecola per anticorpi a seconda delle esigenze dell'applicazione valle. Inoltre, sia il tiolo e ammina chimica per l'etichettatura può essere testato per determinare la migliore opzione chimica che è critica per ADC come è stato dimostrato che l'antigene e legame al recettore, la stabilità in vivo, e l'attività terapeutica di anticorpi dipende dalla coniugazione chimica 24 , 25.
Ci sono alcuni fattori chiave per raggiungere una corretta etichettatura degli anticorpi e di recupero. Proprietà della piccola molecola unre il driver critica sia per il recupero di anticorpi e tintura rapporto anticorpo. Per una piccola molecola idrofobica, alta colorante rapporto anticorpo causerà sticking non specifico dell'anticorpo marcato al tallone e significativamente ridotta recupero anticorpo. A volte, a seconda del colorante e caratteristiche anticorpi, abbiamo trovato che un tallone può funzionare meglio di un altro quindi, prove di entrambe le perline durante l'ottimizzazione può essere utile. Proteina A e proteine G hanno diverse affinità 21 per gli anticorpi di specie diverse e di diversi sottotipi, che devono essere considerati quando si seleziona le perline appropriate. Ad esempio, proteina A ha una bassa affinità per IgG1 del mouse, quindi, proteine g perle sono fortemente raccomandati. Per la chimica tiolo, DTT e TCEP agenti riducenti funzionano altrettanto bene. DTT sarà comunque interferire con la reazione maleimmide quindi dovrebbero essere completamente rimosso mediante lavaggio. Low pH di 2.7 è consigliato per eluizione, ma inferiore a pH di 2.2 può essere richiesto per rec efficienteovery in alcuni casi. Per anticorpi marcati che possono snaturare a basso pH un equilibrio tra recupero efficiente e funzionalità anticorpi dovrà essere determinato empiricamente. E 'noto che l'etichettatura chimica può influire l'anticorpo-antigene attività di legame 11,23, quindi, è assolutamente necessario verificare funzionalità anticorpi dopo marcatura con applicazione a valle desiderata.
In sintesi, si descrive un metodo per etichettare anticorpi con coloranti fluorescenti direttamente dal supporto di cellule senza fasi di purificazione precedenti. Questo metodo sfrutta ad alta capacità magnetica proteina A e proteine G perline ed è un miglioramento significativo rispetto metodo di etichettatura soluzione basata richiede anticorpi altamente purificati ad alte concentrazioni 10,11. L'uso di perline magnetiche abilita manuale e movimentazione automatizzata del campione, che è un vantaggio rispetto branello non magnetico base tecniche di marcatura 17,18. Infine, l'uso di alta capacità beads permettono scala di reazione di marcatura degli anticorpi da livelli bassi microgrammi per centinaia di microgrammi utilizzando piccole quantità di perline e differenzia questo metodo da altri metodi di etichettatura basati tallone magnetico 19. Il protocollo presentato qui descrive etichettatura di anticorpi con coloranti fluorescenti ma il metodo può essere esteso ad altre etichette tra biotina, farmaci citotossici e possibilmente enzimi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
References
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