Summary
Den hund hjärnan är en värdefull modell för att studera vuxen neurogenes. Presenteras här är protokoll för att isolera och expandera vuxna hund hippocampus neurala prekursorceller från primär hjärnvävnad.
Protocol
I enlighet med New South Wales, Australien lag, post mortem hjärnvävnad förvärvades från vuxna hundar avlivades något samband med studien.
1. Beredning av odlingsmedium
- Bered en 0,1% gelatinlösning genom att tillsätta 0,1 g gelatinpulver till 100 ml destillerat vatten och omrörning vid 37 ° C tills det är upplöst. Sterilisera lösningen genom UV-bestrålning under 15 minuter. Detta media kan sedan lagras vid 4 ° C i upp till en månad.
- Bered en 3: 1 förhållande av Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) och näringsblandning F12 genom att tillsätta 167 ml av F-12 till 500 ml av DMEM (4,5 g / L D-glukos). Lägga 6,7 ml av penicillin / streptomycin-lösning (för en 1% slutlig koncentration). Detta media kan lagras i mörker vid 4 ° C i upp till en månad.
- Förbereda 500 ml serum medierna genom att kombinera 440 ml DMEM (4,5 g / L D-glukos), 5 ml L-alanyl-L-glutamin dipeptid (200 mM), 5 ml penicillin / streptomycin och 50 ml fetalt bovine serum (FBS). Detta media kan lagras i mörker vid 4 ° C i upp till en månad.
- Komplett tillväxtmedium består av Neural Stem Cell (NSC) Basal Medium och Proliferation Neural Supplement-A (NS-A), 2% FBS, 2 | j, g / ml heparin, 20 ng / ml epidermal tillväxtfaktor (EGF) och 10 ng / ml basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF). Göra detta medium färska, omedelbart före hjärnan dissektion, och värm till 37 ° C i ett vattenbad.
2. Brain Extraktion
- Börja utvinning inom sex timmar efter slakt av sterilisering av dorsala ytan av hundens huvud med hjälp av povidon-jod.
- Med användning av en skalpell görs en längsgående snitt längs med sagittala mittlinjen, över hela dorsala ytan av kraniet, för att exponera de underliggande massetermusklerna. Längden på denna minskning beror på arten och åldern på hunden.
- Vid rostralt och caudal gränser kraniet, göra ytterligare 5 - 10 cm vinkelräta snitt på båda sidor, passeraing bakom ögon och öron respektive att låta huden att återspeglas fullt ut.
- Med hjälp av en skalpell, separera tuggmuskler från sin infästning i sagittala krönet av skallen och skrapa eventuellt kvarvarande bindväv från kraniet.
- Användning av en oscillerande ben sågsnitt locket av skallen i en omkretslinje. Med hjälp av en sond eller skalpell bryta eventuella återstående bilagor med dura, och sedan försiktigt bort kalott för att exponera den dorsala ytan av hjärnan.
Varning: Tjockleken på benet varierar i olika regioner i skallen, så försiktighet måste iakttas för att inte tränga för djupt och skada underliggande hjärnan. - Sever ryggmärgen genom att sätta in en skalpell mellan den övre halskotorna.
- Med ena handen för att försiktigt lyfta hjärnan, använd en skalpell för att noggrant befria hjärnan från hjärn fossae och kapa anslutnings nerver och blodkärl som ligger på dess ventrala sida. Lyft försiktigt bregn ut ur skallen och i en behållare med DPBS.
Varning: De stora lukt lökar av hundens hjärna kan sträcka sig djupt in i främre skallgropen. Man måste vara försiktig när du tar bort hjärnan för att bevara dessa strukturer.
3. hippocampus Dissection
- Skölj hjärnan i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) för att avlägsna eventuellt blod och placera den dorsala sidan ned på en 150 mm petriskål.
- Långsamt bisect hjärnan i längdled genom mitten av sagittalplanet med användning av en våt hjärn kniv och en enda skiva, som utnyttjar den fulla längden av bladet. Applicera inte ytterligare tryck nedåt, eller använd en sågning rörelse, eftersom det kan skada vävnaden.
- Placera varje halvklotet mediala ytan upp, dissekera ut hippocampus med hjälp av en skalpell och fina pincett, och överföra den till en 35 mm vävnadsodlingsskål.
4. Isolering av neurala prekursorceller
- Finhacka temissions prover med ett skalpellblad i ungefär 1 mm 3 stycken.
- Överför vävnaden i ett 15 ml rör, tillsätt 2 ml av 0,1% trypsin-EDTA, och inkubera i 7 min i ett vattenbad vid 37 ° C.
- Stoppa enzymreaktionen genom tillsats av 4 ml av serummedier till röret. Pelle suspensionen genom centrifugering vid 100 x g under 7 min och avlägsna supernatanten.
- Resuspenderades pelleten i 300 | il DPBS, och dissocierades mekaniskt genom att försiktigt pipettera upp och ner, med användning av en 1000 mikroliter pipettspets, tills en jämn homogenat former.
- Lägga 14 ml av serummedier till röret och passera cellsuspensionen genom en 40 | im cellfilter. Pelle suspensionen genom centrifugering vid 100 x g under 7 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera i fullständigt tillväxtmedium.
5. neurosfär Kultur
- Från cellsuspensionen erhölls vid isolering, räkna antalet livsdugliga celler med hjälp av trypanblått färgämne utslagning och en hemocytometer.
- Späd cellsuspensionen i fullständigt tillväxtmedium och utsäde med 1 x 10 5 celler / cm 2 till obelagda brunnar i en 6-brunnsplatta.
- Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 och> 95% luftfuktighet under 14 - 28 dagar, ersätta 50% av tillväxtmedier var 7 dagar. Mät diametern på neurosfärerna regelbundet. Om de tillåts växa bortom 100 nm i diameter, kan celldöd och spontan differentiering ske inom neuro.
6. neurosfär Passage
- Till passagen som en flytande kultur, när neurosfärerna når approximativt 100 ^ m i diameter, kombinera alla neurosfären innehållande material i ett enda rör. Pelletera genom centrifugering vid 100 x g under 7 min och avlägsna supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml av 0,1% trypsin-EDTA och inkubera i 7 min i ett vattenbad vid 37 ° C. pipettera försiktigt upp och ner 100 gånger, med användning av en 200 mikroliter pipettspets, för att säkerställa dissociatipå de neuro.
- Stoppa enzymreaktionen genom tillsats av 5 ml av serummedier till röret och centrifugera vid 100 xg under 7 min.
- Avlägsna supernatanten, resuspendera cellpelleten i 1 ml komplett tillväxtmedium och räkna antalet viabla celler med användning av trypanblått färgämne utslagning och en hemocytometer.
- Späd cellsuspensionen i fullständigt tillväxtmedium och utsäde med 1 x 10 5 celler / cm 2 till obelagda brunnar i en 6-brunnsplatta. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 och> 95% fuktighet under 14 - 28 dagar, som ersätter 50% av tillväxtmedia var 7 dagar.
7. Vidhäftande kultur av neurala prekursorceller
- Lägga till en tillräcklig volym av 0,1% gelatinlösning för att täcka ytan av en vävnadsodlingsskål och härdning i en inkubator vid 37 ° C under 1 h före behandling av det neurosfärer för vidhäftande kultur.
- Från den flytande neurosphere kultur, kombinera alla medier i ett enda rör. Pellets den Neurospheres genom centrifugering vid 100 xg för 7 min och avlägsna supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml av 0,1% trypsin-EDTA och inkubera i 7 min i ett vattenbad vid 37 ° C. pipettera försiktigt upp och ner 100 gånger, med användning av en 200 mikroliter pipettspets.
- Tillsätt 5 ml av serum medier för att stoppa enzymreaktionen och centrifugera vid 100 xg under 7 min. Kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 1 ml komplett tillväxtmedium och räkna antalet viabla celler med användning av trypanblått färgämne utslagning och en hemocytometer.
- Späd cellsuspensionen i fullständigt tillväxtmedium, ta bort gelatin från vävnadsodlingskolvar och utsäde cellerna vid 1 x 10 4 celler / cm 2.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 och> 95% luftfuktighet. Byt ut media med färska, uppvärmd, komplett tillväxtmedium var tredje dag tills kulturen når ca 80% sammanflödet (efter ca 7 dagar).
8. Neural kolonibildande analys
- Kombinera Neural kolonibildande cell (NCFC) Analysmediakomponenter: NCFC serumfritt medium, Proliferation NS-A, och kollagen-lösning (3 mg / ml). Komplettera detta medium med 2 | j, g / ml heparin, 20 ng / ml EGF, och 10 ng / ml bFGF.
- Följande hippocampusvävnad dissociation resuspendera cellerna i neural kolonibildande analysmedium, förvärmda till 37 ° C i ett vattenbad. Ympa cellerna vid en klonal täthet av 1,1 x 10 5 celler / ml i en 35 mm odlingsskål.
- Inkubera cellerna i detta halvfasta kollagenmatrisen vid 37 ° C, 5% CO2 och> 95% luftfuktighet. Odling under 28 dagar, som ersätter 50% av tillväxtmediet var 7 dagar.
9. Differentiering av neurala prekursorceller
- Lägga till en tillräcklig volym av 5 | j, g / cm 2 laminin lösning för att täcka ytan av en vävnadsodlingsskål och härdning i en inkubator vid 37 ° C under 24 h före bearbetning av cellerna under differentiation.
Obs! Ta bort laminin lösning och skölj den belagda ytan två gånger i DPBS omedelbart före sådd. - När passage, utsäde cellsuspensionen vid 1 x 10 4 celler / cm 2 i DMEM-F12 (3: 1) media (värmts upp till 37 ° C) kompletterat med 20 ng / ml EGF och 40 ng / ml bFGF på lamininbelagda odlingsskål.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 och> 95% fuktighet och tillåter celler att proliferera i 3 dagar.
- För att skilja de vidhäftande neurala prekursorceller, efter 3 dagar ersätta media med differentiering medier innehållande DMEM-F12 (3: 1) media förvärmda till 37 ° C, kompletterat med 10 ng / ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
- Under differentiering ersätta 50% av media var 3 dagar. Differentieringen sker gradvis under ca 21-28 dagar.
Varning: När cellerna har börjat differentiera, byt endast 50% av media på ett timig som exponering för luft kan ha en skadlig effekt på hälsan hos cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom användning av in vitro-neurala prekursorceller analyser, neurogenes och neurala prekursorceller cellpopulationer karakteriserades och jämfördes över dorsoventral axeln av den vuxna canine hippocampus. Neurala prekursorceller härledda från isolerade hippocampus vävnad bildade flytande neurosfärer inom 14 dagar efter isolering och nådde en diameter av 100 um med 28 dagars odling. Neurosfärer erhållna från dorsala och ventrala isolat visade ingen skillnad i medelstorlek, och till följd av enzymatisk dissociation till enstaka celler, skulle kunna passera som flytande neurosfärkulturer. Sekundära flytande neurosfärer från båda hippocampala regioner kunde bilda inom 5 dagar från passagen. När såddes vid 1 x 10 4 celler / cm2 på 0,1% gelatinbelagda odlingsflaskor, neurala prekursorceller kunde också föröka sig som vidhäftande monolager (Figur 1A). Inga morfologiska skillnader observerades between dorsala och ventrala hippocampus neurala prekursorceller och båda vidhäftande kulturer kunde genomgå över 10 populationsfördubblingar utan observerade sakta i kanalen-tid (Figur 1B). Nestin och Sox2 neurala stamceller genuttryck i vidhäftande kultur var inte signifikant över hippocampus dorsoventral axeln (Figur 2). Mer omfattande karakterisering av gen- och proteinuttryck, bekräftar neurala föregångare identitet av dessa celler, redovisas i våra publicerade data 7.
Använda en anpassad Neural kolonibildande analys 4,6 vi bedömt neurala prekursor cellfrekvens för att kvantifiera eventuella skillnader i neurala prekursor cellpopulationer över rygg och ventrala regioner i hundens hippocampus. Celler såddes vid klonal densitet i en halvfast kollagen matris som utgör hinder för cellfusion, och odlades under 28 dagar (figur 3A F = 96,8, p = 0,001; figur 3B ).
Under differentieringsförhållanden vidhäftande hund neurala prekursorceller visade progressiva förändringar i brutto morfologi, utveckling av längre och mer avancerade processer. Proteinuttryck för neuronal (βIII-tubulin) och gliaceller (gliafibrillärt surt protein, GFAP) markörer ökade också efter differentiering (Figur 4). Ingen signifikant skillnad observerades i antalet positivt märkta celler mellan dorsala och ventrala isolat. Vår tidigare publicerade data bekräftar dessa proteinuttrycksförändringar, visar uppreglering av tillhörande gener tillsammans med nedreglering av neurala prekursor gener över 28 dagars differentiering period 7.
Figur 1:. In vitro Expansion av vuxna Canine hippocampus neurala prekursorceller Vuxen hund hippocampus neurala prekursorceller isolerade från rygg och ventrala hippocampus regioner expanderas som (A) flytande neurosfärer eller som (B) en vidhäftande monolager (C) som en. vidhäftande monolager dessa neurala prekursorceller kan genomgå passage över 10 gånger utan betydande nedgång i fördubbling hastighet. n = 5; skala = 50 pm. Modifierad från publicerade figur 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
/ftp_upload/54953/54953fig2.jpg "/>
Figur 2:. Gene Expression i prolifererande Vuxen Canine hippocampus Neural prekursorceller Expression av neurala stamcellsgener (A) nestin och (B) Sox2 bekräftades hos vuxna canine hippocampus neurala prekursorceller enligt adherenta proliferativa odlingsbetingelser. Uttryck av dessa gener var likvärdig i både rygg och ventrala hippocampus härledda celler. Vuxna canine fibroblaster användes som en styrledning för att jämföra skillnader i relativa genuttryck. n = 5; felstaplar = SEM. Modifierad från publicerade figur 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Neural kolonibildande analys (A)Vuxna hund neurala prekursorceller, sådda vid klonal densitet in i en halvfast kollagenmatrisen, bildar neurosfärer inom 28 dagars odling. (B) Neurala prekursorceller härledda från de dorsala hippocampus genererar betydligt större antal neurosfärer per ytenhet än de som härrör från den ventrala hippocampus. n = 5; felstaplar = SEM; skala = 50 pm. Modifierad från publicerade figur 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Immunocytokemi differentierade Adult Canine hippocampus neurala prekursorceller När odlas i BDNF i 28 dagar, vuxna hund neurala prekursorer från både dorsala och ventrala hippocampus differentierar till mogna neuronal (βIII-tubulin pokänslig) och gliaceller (GFAP positiva) celltyper. n = 5; skala = 50 pm. Modifierad från publicerade figur 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De protokoll som beskrivs här är optimerade för att bibehålla goda odlingsbetingelser för att maximera cellernas livskraft. Hastigheten och omsorg under extraktion, isolering och expansion är av kritisk betydelse. Ett kritiskt steg för att fastställa vidhäftande monolager expansion är en effektiv dissociation av de primära neuro. Efter passage, otillräckligt dissocierade neurosfärer kan generera sekundära flytande neurosfärer. Under media förändring, kan dessa neuro tas bort, dissocieras och såddes för vidhäftande monolager passage. Omvänt, om post-dissociation cellviabiliteten är under 80%, kan detta vara ett tecken på överdriven pipettering under dissociation. Neurala prekursorceller, och i synnerhet deras differentierade motsvarigheter, är känsliga för förändringar i pH utanför det fysiologiska området, och exponering för luft. Observationen av plötslig utbredd celldöd kan bero på dessa faktorer. Följaktligen ett kritiskt steg under media chanGES är för media att göras färskt varje gång, och för endast 50% av den volym som skall bytas ut. Slutligen medan mitogena faktorer EGF och bFGF stödjer överlevnaden och proliferationen av hippocampus neurala prekursorer under serumfria betingelser in vitro 22,23, är det cellulära svaret till dessa mitogener i hög grad beroende på cellutvecklingsålder och mitogen koncentration 24,25. Därför är det avgörande för att generera konsekventa, reproducerbara cellkulturer garanterar minimal experimentell variation i dessa komponenter.
För maximal lönsamhet, bör celler seedas för kultur inom 6 timmar efter slakt. Emellertid kan det extraherade hjärnan lagras temporärt i PBS vid 4 ° C. Denna modifiering kan göra det möjligt för isolering kommer att försenas med upp till 24 timmar med minimal minskning av cellutbyte 26,27. Tillväxtfaktor komplettering av odlingsmedia kan även modifieras för att öka proliferation eller för att stimulera differentiation av specifika neurala celltyper. Insulinliknande tillväxtfaktor 1 (vid 100 ng / ml) har visats ha en stödjande effekt på gnagare neurala stamceller in vitro 28,29, medan enligt differentiering betingelser pro-neuronal faktor BDNF 30 kan användas tillsammans med faktorer sådana som Interleukin 7 (vid 500 ng / ml) eller retinsyra (vid 0,1 ^ M) för att inducera en inriktning mot neuronal undertyp eller glial differentiering 31,32.
Beslutet om huruvida expandera neurala prekursorceller som flytande neurosfärer eller som en vidhäftande monolager beror till stor del på de önskade program nedströms och kulturegenskaper. Medan neurosphere odlingssystemet är förenklad och mycket reproducerbar, är den begränsad i sin förmåga att generera homogena populationer av celler. Den komplexa mikro inom varje sfär kan främja apoptos och spontan differentiering, uppmuntra en heterogen population 33, medan reported fusion av neurosfärer, som kan omintetgöra kvantifiering av neurala prekursorceller cellpopulationer 34. Vidare kan den upprepade mekanisk dissociation krävs för neurosfären passage också leda till skadlig stress, senescens eller till och med celldöd. Användningen av alternativa dissociation enzym, såsom papain, kan påverka den resulterande cellernas livskraft 16. Omvänt vidhäftande monokultursystemet, med jämnare exponering för miljö mitogener, uppmuntrar till större enhetlighet i celltyp och mer symmetrisk delning. Detta system har visat sig ge en nisch oberoende population av celler, baserat på uttrycket av viktiga markörer stamceller 35,36. Detta system kräver användning av pre-belagda odlingskärl för att främja cellulär vidhäftning. Valet av odlingssubstratet bör noga övervägas, eftersom det kan ge betydande effekter på differentieringsprofilen för de odlade neurala prekursorer 25,37.
Here vi presentera effektiva protokoll för isolering, expansion och differentiering av vuxna hund hippocampus neurala prekursorceller från färsk post mortem vävnad. Vuxen hund neurala prekursorer underrepresenterade i litteraturen 18; med fullständiga protokoll för deras isolering och expansion, än mindre 17. Våra protokoll kan sedan användas för att öka medvetenheten om denna värdefulla djurmodell och utgör ett betydande tillskott till denna blygsamma antal studier. Av betydelse, genom att använda vår unika metod, vuxen hund hippocampus neurala prekursorer kan framgångsrikt expanderat mer än 10 populationsfördubblingar. En liknande studie med vuxna hund hippocampus neurala prekursor rapporterade att större neuro, passe vid 100-150 nm i diameter, upphörde spridning utanför den femte generationen 17. Som nämnts i våra protokoll, kan överdriven neurosphere tillväxt uppmuntra spontan differentiering och apoptos, som under seriepassage kan ha led till denna reducerade förmåga att föröka sig. Vi tillhandahåller också ett protokoll för vidhäftande monolager expansion av denna cellpopulation, som ett alternativ till den klassiska neurosphere expansionssystem 17-21. Detta alternativt system ger användaren mer kontroll över den cellulära miljön och avsevärt breddar användningsområde nedströms för dessa celler, med potential för fenotypisk homogenisering och riktade neuronal differentiering 35,38.
Odlade vuxna hund hippocampus neurala prekursorceller har tillämpningar inom ett brett spektrum av cellulära och neurobiologiska forskningsområden. Hundens hjärna har en närmare homologi till den mänskliga hjärnan än befintliga gnagarmodeller. Som sådan, vuxen hund neurala prekursorceller är en viktig, men understudied, resurs. Dessa celler kan användas för att få ytterligare insikt i de mekanismer som ligger bakom vuxen neurogenes hos människor, och för utvecklingen av regenerativa terapier som Target denna process.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
- Kheirbek, M. A., Hen, R. Dorsal vs ventral hippocampal neurogenesis: implications for cognition and mood. Neuropharmacol. 36 (1), 373 (2011).
- Tanti, A., Rainer, Q., Minier, F., Surget, A., Belzung, C. Differential environmental regulation of neurogenesis along the septo-temporal axis of the hippocampus. Neuropharmacol. 63 (3), 374-384 (2012).
- Eriksson, P. S., et al.
- Bull, N. D., Bartlett, P. F. The adult mouse hippocampal progenitor is neurogenic but not a stem cell. J Neurosci. 25 (47), 10815-10821 (2005).
- Kempermann, G., et al. Why and how physical activity promotes experience-induced brain plasticity. Front Neurosci. 4 (189), 1-9 (2010).
- Golmohammadi, M. G., et al. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26 (4), 979-987 (2008).
- Lowe, A., et al. Neurogenesis and precursor cell differences in the dorsal and ventral adult canine hippocampus. Neurosc. Lett. 593, 107-113 (2015).
- Sasaki, M., et al. MRI identification of dorsal hippocampus homologue in human brain. Neuroreport. 15 (14), 2173-2176 (2004).
- Powell, E. W., Hines, G. The Hippocampus. , Springer. 41-59 (1975).
- Jung, M. -A., et al. Canine hippocampal formation composited into three-dimensional structure using MPRAGE. J Vet Med Sci. 72 (7), 853-860 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
- Oliver-Dela Cruz, J., Ayuso-Sacido, A. Neural stem cells from mammalian brain: isolation protocols and maintenance conditions. INTECH Open Access Publisher. , (2012).
- Pacey, L., Stead, S., Gleave, J., Tomczyk, K., Doering, L. Neural stem cell culture: neurosphere generation, microscopical analysis and cryopreservation. Nat Protoc. , (2006).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), e2393 (2010).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
- Lim, J. -H., Koh, S., Olby, N. J., Piedrahita, J., Mariani, C. L. Isolation and characterization of neural progenitor cells from adult canine brains. Am J Vet Res. 73 (12), 1963-1968 (2012).
- Herranz, C., et al. Spontaneously Arising Canine Glioma as a Potential Model for Human Glioma. J Comp Pathol. 154 (2), 169-179 (2016).
- Walton, R. M., Parmentier, T., Wolfe, J. H. Postnatal neural precursor cell regions in the rostral subventricular zone, hippocampal subgranular zone and cerebellum of the dog (Canis lupus familiaris). Histochem Cell Biol. 139 (3), 415-429 (2013).
- Walton, R. M., Wolfe, J. H. Abnormalities in neural progenitor cells in a dog model of lysosomal storage disease. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (8), 760-769 (2007).
- Milward, E. A., et al. Isolation and transplantation of multipotential populations of epidermal growth factor-responsive, neural progenitor cells from the canine brain. J Neurosci Res. 50 (5), 862-871 (1997).
- Ray, J., Peterson, D. A., Schinstine, M., Gage, F. H. Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (8), 3602-3606 (1993).
- Palmer, T., Ray, J., Gage, F. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol Cell Neurosci. 6 (5), 474-486 (1995).
- Zhu, G., Mehler, M., Mabie, P., Kessler, J. Developmental changes in progenitor cell responsiveness to cytokines. J. Neurosci. Res. 56 (2), 131-145 (1999).
- Whittemore, S. R., Morassutti, D. J., Walters, W. M., Liu, R. -H., Magnuson, D. S. Mitogen and substrate differentially affect the lineage restriction of adult rat subventricular zone neural precursor cell populations. Exp. Cell. Res. 252 (1), 75-95 (1999).
- Kennedy, P. Postmortem survival characteristics of rat glial cells in culture. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 50 (6), 798-800 (1987).
- Viel, J. J., McManus, D. Q., Cady, C., Evans, M. S., Brewer, G. J. Temperature and time interval for culture of postmortem neurons from adult rat cortex. J. Neurosci. Res. 64 (4), 311-321 (2001).
- Huat, T. J., et al. IGF-1 enhances cell proliferation and survival during early differentiation of mesenchymal stem cells to neural progenitor-like cells. BMC Neurosci. 15 (91), 1-13 (2014).
- Supeno, N. E., et al. IGF-1 acts as controlling switch for long-term proliferation and maintenance of EGF/FGF-responsive striatal neural stem cells. Int. J. Med. Sci. 10 (5), 522-531 (2013).
- Ahmed, S., Reynolds, B. A., Weiss, S. BDNF enhances the differentiation but not the survival of CNS stem cell-derived neuronal precursors. J Neurosci. 15 (8), 5765-5778 (1995).
- Wohl, C. A., Weiss, S. Retinoic acid enhances neuronal proliferation and astroglial differentiation in cultures of CNS stem cell-derived precursors. J Neurobiol. 37 (2), 281-290 (1998).
- Araujo, D. M., Cotman, C. W. Trophic effects of interleukin-4,-7 and-8 on hippocampal neuronal cultures: potential involvement of glial-derived factors. Brain Res. 600 (1), 49-55 (1993).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), 283 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1 112-120 (2006).
- Ma, W., et al. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC Dev Biol. 8 (90), 1-13 (2008).
- Goffredo, D., et al. Setting the conditions for efficient, robust and reproducible generation of functionally active neurons from adult subventricular zone-derived neural stem cells. Cell Death Differ. 15 (12), 1847-1856 (2008).
