Summary
Una evaluación funcional de la placa neuromuscular (NMJ) puede proporcionar información esencial sobre la comunicación entre el músculo y del nervio. Aquí se describe un protocolo para evaluar exhaustivamente el NMJ y músculo funcionalidad utilizando dos preparaciones diferentes músculo-nerviosa, es decir, sóleo-ciático y frénico-diafragma.
Abstract
Funcionalidad de la placa neuromuscular (NMJ) desempeña un papel fundamental al estudiar enfermedades en que la comunicación entre neurona motora y músculo se deteriora, como el envejecimiento y esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Aquí describimos un protocolo experimental que puede utilizarse para medir funcionalidad NMJ combinando dos tipos de estimulación eléctrica: dirigir la estimulación de la membrana muscular y la estimulación a través del nervio. La comparación de la respuesta del músculo a estos dos estímulos diferentes puede ayudar a definir, a nivel funcional, posibles alteraciones en el NMJ que conducen a deterioro funcional en el músculo.
Preparaciones dex vivo E son adecuadas para estudios bien controlados. Aquí describimos un protocolo intensivo para medir varios parámetros de funcionalidad NMJ para la preparación del nervio ciático en sóleo y para la preparación del nervio frénico-diafragma y músculo. El protocolo dura aproximadamente 60 minutos y se lleva a cabo ininterrumpidamente por medio de una medida software que mide las propiedades de la cinética de contracción, la relación de la frecuencia de la fuerza para estimulación de músculo y nervio y dos parámetros específicos a la funcionalidad de la NMJ, es decir falta de neurotransmisión y fatiga intratetanic. Esta metodología fue utilizada para detectar daños en preparaciones de nervio Músculo sóleo y el diafragma mediante el uso de ratón transgénico de SOD1G93A , un modelo experimental de esclerosis lateral amiotrófica que ubicuo overexpresses del mutante antioxidante enzima superóxido dismutasa 1 (SOD1).
Introduction
La Unión neuromuscular (NMJ) es una sinapsis química formada por la conexión entre la placa motora de la fibra muscular y el axón de la neurona motora terminal. El NMJ ha demostrado jugar un papel crucial cuando la comunicación entre el músculo y el nervio se deteriora, como ocurre en el envejecimiento o la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Como músculo y del nervio se comunican en forma bidireccional1,2, pudiendo medir NMJ defectos por separado de defectos músculo puede proporcionar nuevas perspectivas sobre su interrelación fisiopatológica. De hecho, esta evaluación funcional puede ayudar a evaluar si alteraciones morfológicas o bioquímicas reducen la funcionalidad de señalización de la neurotransmisión.
La comparación de la respuesta contráctil muscular provocada por estimulación del nervio y la respuesta del músculo mismo evocado por estimulación directa de su membrana se ha propuesto como una medida indirecta de la funcionalidad de la NMJ. De hecho, desde membrana estímulo por pases neurotransmisión señalización, cualquier diferencia en las dos respuestas contráctiles puede atribuirse a los cambios en el NMJ. Este enfoque ha sido ampliamente propuesto para las ratas3,4,5,6,7y también se utiliza para recopilar información sobre los modelos de ratón8,9,10,11,12.
Aquí, describimos en detalle un procedimiento para suprimir dos preparaciones de músculo-nerviosa, e. i. los preparativos sóleo-ciático y frénico-diafragma. Mediante una medida software, diseñamos un protocolo de pruebas continuado que combina la medición de varios parámetros que caracterizan la funcionalidad de NMJ y músculo, lo que rinde una evaluación comprensiva del daño NMJ por separado del músculo. En particular, el protocolo mide la fuerza de contracción, la cinética muscular, la curva de frecuencia de la fuerza directa y estímulos del nervio, la neurotransmisión falta13 para un disparo y las frecuencias tetánicas y la fatiga intratetanic7.
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Representative Results
El protocolo que se describe proporciona información sobre la denervación funcional en varias enfermedades neuromusculares o envejecimiento-sarcopenia. Este protocolo puede utilizarse para determinar si (y, en caso afirmativo, en qué nivel) alteraciones de la musculatura se deben a cambios selectivos que ocurren en el músculo sí mismo o en la transmisión neuromuscular. Los datos que se muestran a continuación son los resultados de un trabajo previo por nuestro grupo18, llevó a cabo en el modelo de ratón transgénico de SOD1G93A de esclerosis de lateral amiotrófica en la fase final de la enfermedad20. El ratón transgénico de SOD1G93A ubicuo overexpresses del mutante antioxidante enzima superóxido dismutasa 1 (SOD1). Figuras 3 y 4 muestran los valores de la fuerza tetánica para el nervio ciático soleus (izquierda) y para la preparación del nervio frénico-diafragma (derecha) y dF/dt. Estos resultados demuestran la capacidad de la técnica propuesta aquí para detectar los defectos funcionales en los músculos transgénicos relacionados con NMJ en contraposición a las estrictamente relacionadas con el músculo sí mismo. De hecho, para dF/dt y la fuerza tetánica, los músculos de soleus SOD1G93A muestran una disminución en la respuesta contráctil, en comparación con el músculo de control, directamente estimulado, y aparezca una nueva reducción al ser estimulados a través del nervio. Por el contrario, suaves se observaron alteraciones en estos dos parámetros cuando tiras de músculo diafragma fueron estimuladas a través de la membrana, mientras que se detectaron alteraciones significativas cuando se estimula el músculo del diafragma a través del nervio.
Figura 3 - Cinética contráctil. Media ± SEM de dF/dt para el sóleo (A) y diafragma (B) las preparaciones. Muestras de sóleo muestran una desaceleración significativa hacia abajo cuando estimula directamente (-27%) y otra disminución cuando estimulan a través del nervio (-58%). Muestras de diafragma muestran un retraso sólo cuando se estimula a través del nervio (-30%). Adaptado de Rizzuto et al. 18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 - Fuerza tetánica. Media ± SEM de tetánica fuerza específica para el sóleo (A) y diafragma (B) las preparaciones. Muestras de sóleo muestran una desaceleración significativa hacia abajo cuando estimula directamente (-26%) y otra disminución cuando estimulan a través del nervio (-50%). Muestras de diafragma muestran una disminución de la fuerza sólo cuando se estimula a través del nervio (-44%). Adaptado de Rizzuto et al. 18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La evaluación de fatiga de intratetanic y fracaso de neurotransmisión permite parámetros específicos NMJ a medir. La figura 5 muestra los valores promedio de fatiga intratetanic (si) se mide en el paradigma de fatiga tetánica de los músculos sóleo (figura 5A) y tiras de diafragma (figura 5B). Como se informó en la sección de protocolo, el paradigma de fatiga que se aplicó fue desarrollado de tal manera al estrés aunque el NMJ no el músculo. Como resultado, el IF medido para la estimulación muscular directa nunca fue alterada. De hecho, el IF computada para la estimulación del nervio es el parámetro que debe ser considerado para las comparaciones entre las cepas de ratón diferente. Nuestros resultados muestran que el si fue significativamente menor en transgénico sóleo y músculos del diafragma que en las contrapartes de control. Esta diferencia fue mayor en el diafragma, en la que se detectó un defecto de músculos pequeños, y menor en el sóleo, en el que ya había medido daño muscular importante. Debe tenerse en cuenta que puesto que el músculo de soleus transgénicos fue dañado considerablemente, la evaluación de la NMJ sólo estaba correcta para hasta 8 minutos de estimulación, que es el tiempo que tarda para que músculo transgénico devolver el valor null de la fuerza al ser estimulados. Sóleo transgénico si valores después de 8 minutos de estimulación expresan básicamente ruido.
Figura 5 - Fatiga intratetanic. Intratetanic fatiga para el sóleo (A) y diafragma (B) los músculos muestra una disminución significativa en la funcionalidad NMJ transgénico. Los valores son promedio ± SEM. adaptado de Rizzuto et al. 18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La figura 6 muestra el fracaso de la neurotransmisión en la frecuencia tetánica en el sóleo (figura 6A) y muestras de diafragma (Figura 6B). En consonancia con los resultados de la IF, ningún defecto en la neurotransmisión se detectó en el músculo sóleo, mientras que las muestras de músculo del diafragma muestran un aumento significativo en la fatigabilidad de la Unión neuromuscular.
Figura 6 -Neurotransmisión falta. Falta de neurotransmisión no mostró alteraciones en los músculos sóleo (A), mientras que destacó una disminución significativa en la funcionalidad de la NMJ de transgénicos tiras de membrana (B). Los valores son promedio ± SEM. adaptado de Rizzuto et al. 18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo experimental descrito proporciona una manera ideal de medir y discriminar alteraciones funcionales que se han producido directamente en el músculo o indirectamente en el nivel de placa neuromuscular. Puesto que esta técnica se basa en una medición indirecta de la funcionalidad de la NMJ, no puede utilizarse para establecer si un defecto está relacionado con cambios morfológicos o a cambios bioquímicos. Por el contrario, proporciona una manera eficaz de determinar si las alteraciones morfológicas o bioquímicas han reducido la funcionalidad de señalización de la neurotransmisión. Sin embargo, después de que finalicen las medidas de fuerza, el músculo puede ser retirado del baño, borrado, cubrió en la longitud óptima, rodeado de empotrar compuesto y rápidamente congelado en isopentano de fusión. Los músculos pueden almacenarse a-80 ° C para posterior evaluación, tales como inmunohistoquímica y análisis morfológico.
La técnica que aquí proponemos se basa en un protocolo de pruebas experimental que combina, por primera vez, la medición de varios parámetros de caracterización de la funcionalidad muscular y NMJ. Tres puntos cruciales aseguran que esta técnica produce resultados confiables.
En primer lugar, aunque ahora la supresión de músculo esquelético es una técnica relativamente común, adicional debe tener cuidado al realizar el procedimiento quirúrgico con el fin de mantener el nervio con el músculo. Capacidad del operador debe probarse así en ratones de control antes de intenta cualquier otro modelo experimental. En los ratones de control, las respuestas contráctiles del músculo a los estímulos directos e indirectos deben ser el mismo, proporcionando un control a la capacidad quirúrgica del operador.
Otro punto crucial es la necesidad de garantizar que pulsos directos no activar el músculo por estimulación intramusculares ramas del nervio y que los pulsos aplicados al nervio no el músculo de una forma artefactual por separarse en el baño. El primer punto se puede probar mediante la realización de un conjunto independiente de experimentos en los que el músculo es estimulado directamente en la membrana tanto antes como después de la D-tubocurarina (25 μm) se ha añadido al baño de la fisiológico. Una vez que se ha fijado el valor corriente supramaximal, la respuesta del músculo no debía modificarse mediante la adición de D-tubocurarina. El segundo punto se relaciona con la longitud del nervio suprimido y por lo tanto es más susceptible a variación. La corriente en el electrodo de succión debe ser evaluada antes del comienzo de cada prueba, como se describe en la sección de protocolo.
Por último, puesto que la funcionalidad de la NMJ es evaluado comparando la respuesta del músculo a la estimulación directa e indirecta, los impulsos eléctricos deben estar sincronizados precisamente. Este punto es particularmente importante para los paradigmas dos fatiga al final del protocolo durante el cual el músculo se estimula una vez en la membrana y 14 veces a través del nervio. Ya que las fases de estimulación y los tiempos de descanso son muy bajos (0.33 s y 0.67 s para el diafragma), incluso un rezago muy bajo daría lugar a una estimulación desequilibrada de uno de los dos compartimientos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Trabajo en laboratorio de los autores fue apoyada por Fondazione Roma y Teletón (no de la concesión. GGP14066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
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