Summary
Lasere anvendes ofte i studier af det cellulære respons på DNA beskadigelse. Men de generere læsioner, hvis afstand, hyppighed, og kollisioner med replikationsgafler sjældent karakteriseret. Her beskriver vi en fremgangsmåde, der muliggør bestemmelse af disse parametre med laser lokaliseret interstrengstværbindinger.
Abstract
DNA Damage Response (DDR) er blevet grundigt karakteriseret i undersøgelser af dobbeltstrengsbrud (DSB'er) induceret af laser micro bestrålingen i levende celler. DDR til helix fordreje covalente DNA modifikationer, herunder interstrengs DNA tværbindinger (ICLS), er ikke så veldefinerede. Vi har undersøgt DDR stimuleret af ICLS, lokaliseret ved hjælp af laser fotoaktivering af immunotagged psoralener, i kerner af levende celler. For at løse fundamentale spørgsmål om addukt distribution og replikationsgaffel møder, vi kombineret laser lokalisering med to andre teknologier. DNA fibre ofte bruges til at vise forløbet af replikationsforgreninger ved immunfluorescens af nukleosidanaloger inkorporeret under korte impulser. Immunoquantum prikker er ofte blevet anvendt til enkelt molekyle billeddannelse. I den nye fremgangsmåde er DNA fibre fra celler, der bærer laser lokaliserede ICLS spredes på mikroskopobjektglas. De mærkede ICLS vises med immunoquantum prikker og the inter-læsion afstande bestemt. Replikationsgaffel sammenstød med ICLS kan visualiseres og forskellige støder mønstre identificeres og kvantificeres.
Introduction
DNA er under konstant angreb fra eksogene midler såsom stråling, ultraviolet lys, miljømæssige toksiner, forbrændingsprodukter, etc. Endvidere er det også angrebet af endogene radikaler produceret af oxidativ metabolisme. Alle disse har potentiale til kemisk eller fysisk forstyrre integriteten af DNA 1. Forstyrrelser i genomet kan aktivere DNA Damage Response (DDR), en rekruttering og posttranslationel modifikation kaskade med hundredvis, hvis ikke tusinder, af proteiner og microRNA involveret i læsion reparation, regulering af cellecyklussen, apoptose, fremadskridende alderdom og inflammatoriske pathways 2.
De fleste af vores information om DDR, kommer fra studier med DSBs. Dette er i vid udstrækning på grund af tilgængeligheden af teknologier til indføring pauser, herunder sekvensspecifikke pauser, i genomisk DNA i levende celler 3. Desuden propensity af pauser til at inducere foci af DDR-proteiner, som kan vises ved hjælp af immunfluorescens, har været meget nyttigt til identifikation af kinetikken og krav i responderende proteiner. En af de vigtigste teknologier til at studere DDR blev introduceret af Bonner og kolleger, der brugte en laserstråle til at lede en stribe af DSBs i en "Region of Interest" (ROI) i kerner af levende celler 4. I realiteten skabte de en langvarig fokus, hvor proteiner af DDR kunne identificeres ved immunfluorescens. Dette blev illustreret ved deres demonstration af stærk stribe af phosphoryleret histon H2AX (γ-H2AX) i laser eksponerede celler. Siden da har laser fremgangsmåde været anvendt i talrige undersøgelser af DDR induceret af DSB'er. Selvom kraftfulde og populære, og kilden til dramatiske immunofluorescens billeder, skal det bemærkes, at laseren intensitet i de fleste forsøg er justeret således at producere observerbare resultater, uden bekymring for læsion identitet,densitet, eller indbyrdes afstand. Faktisk kan det være vanskeligt at foretage disse skøn. De er således stort set ignoreret, trods de mange læsioner indført i DNA ved lasere 5. Dette bidrager til de mange modsætninger i litteraturen 6.
I modsætning til DSBs, de fleste kemiske modifikationer af DNA ikke stimulere dannelsen af diskrete foci af DDR-proteiner. Dette er vigtigt i lyset af vores nuværende forståelse af læsion frekvenser. Det er blevet anslået, at humane celler i kultur pådrage så mange som 50 DSB'er per celle cyklus, der dannes i høj grad under S-fasen 7, 8, 9. Færre dannes i ikke-prolifererende celler. Dette står i modsætning til antallet af nucleobase tab eller modifikation begivenheder, som i titusindvis per celle / dag 1, 10. Således ved vi mest omDDR fremkaldt af begivenheder, der er relativt sjældne, og meget mindre om dem fremkaldt af helix forvridende læsioner, som tilsammen er langt mere almindelige.
For at afhjælpe spørgsmål om det cellulære respons på kovalente modifikationer af genomisk DNA, vi ønskede at arbejde med en helix fordreje DNA addukt, havde iboende DDR induktionsaktivitet. Desuden for at lette eksperimentelle design og fortolkning vi var interesserede i en struktur, hvis introduktion kan kontrolleres med hensyn til tid og var modtagelig for visualisering. Derfor udviklede vi en strategi baseret på psoralen. Psoralener er velkarakteriserede fotoaktive DNA-interkalatorer favoriserer 5'TA: AT sites. I modsætning til andre tværbindingsmidler såsom nitrogensennepper og mitomycin C (MMC) de er ikke DNA reaktive medmindre udsat for langbølget UV (UVA) lys. De indskudte molekyler reagerer med thyminbaser på modsatte strenge at producere helix fordreje interstrengstværbindinger (ICLS) 11. Med trimethyl psoralen anvendt i vores eksperimenter fleste produkter er ICLS, relativt få monoadducts genereres (mindre end 10%) 12 og intrastreng tværbindinger mellem tilstødende baser på én streng er ikke dannet. Fordi de er stærke blokke til replikation og transkription, psoralen og andre tværbindingsmidler, ligesom cis-platin og MMC, er almindeligt anvendt i kemoterapi. Således psoralen aktiveret undersøgelser, der fulgte aktiveringen af DDR ved en helix fordreje struktur, og også leveret indsigt i den cellulære reaktion til en forbindelse med klinisk betydning.
Syntetiserede vi et reagens, hvori trimethyl psoralen var knyttet til digoxigenin (DIG), en plantesterol ikke findes i pattedyrceller og anvendes hyppigt som et immunotag. Kravet om fotoaktivering tillader lokalisering af laserlys (365 nm) af psoralen ICLS i definerede ROI i kerner i levende celler. Disse kan vises ved immunofluorescence mod Dig tag. DNA-reparation og DDR-proteinerne syntes i striberne af laser lokaliserede ICLS 13, 14.
DDR aktiveres ved de høje laser intensiteter anvendes til fremstilling af DSB'er kunne skyldes isoleret eller grupperet skade 15, 16. Følgelig til relevansen af resultater fra disse forsøg naturligt forekommende læsioner, til stede i meget lavere koncentration, er usikker. For at løse lignende spørgsmål om psoralen addukt frekvens og afstand i DNA, tog vi fordel af DNA fiberteknologi 17 og immunoquantum prikker. Kvantepunkter er meget lysere end fluorescerende farvestoffer og er ikke bleget af udsættelse for lys. De er således ofte til enkelt molekyle billeddannelse 18, en ansøgning, som fluorescerende farvestoffer er tilstrækkeligt lyse. Individuelle DNA fibre kan strækkes på glass rutschebaner og kan vises ved immunofluorescens mod nukleosidanaloger inkorporeret under inkubationer før cellehøst. Vi behandlede celler med Dig-psoralen og udsat ROI for laser micro bestråling. Fibre blev fremstillet fra cellerne og individuelle Dig-psoralen addukter kunne visualiseres med immunoquantum prikker. Udsættelse af cellerne for nukleosidanaloger for relativt korte tidsrum (20-60 min) tillader visningen af replikations skrifter i nærheden af laser lokaliseret ICLS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Dig-TMP
- Bland 50 mg (0,18 mmol) 4'-chlormethyl-4,5' , 8-trimethylpsoralen og 590 mg (2,7 mmol) af 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amin i en tør 25 ml runde Bunden kolbe under nitrogen. Tilsættes 10 ml toluen og tilbagesvaling i 12 timer. Fjernelse af opløsningsmiddel i en rotationsfordamper under reduceret tryk.
- Remanensen renses ved flashsøjlekromatografi over silicagel. Søjlen elueres med chloroform, methanol og 28% ammoniakopløsning (9: 1: 0,5). Opløsningsmidlet afdampes i en rotationsfordamper under reduceret tryk, og genvinde det rene 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5', 8-trimethylpsoralen som en svagt gul viskos væske.
- Bland 5,5 mg (0,012 mmol) 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5', 8-trimethylpsoralen med 5 mg (0,008 mmol) digoxigenin NHS-ester i en tør rundbundet kolbe under nitrogen. Tilsæt 0,5 ml vandfrit dimethylformamid (DMF) end 3.4 pi trimethylamin og omrør ved 50 ° C i 18 timer.
- Fjernelse af opløsningsmiddel i en rotationsfordamper under reduceret tryk.
- remanensen i en minimal mængde dichlormethan opløses. Påfør opløsningen i 2 pi spots vandret over bunden af en præparativ tyndtlagsplade med silicagel som en stationær fase. Kør præparativ TLC i chloroform: methanol: 28% ammoniumhydroxid (8: 1: 0,1).
- Maskere pladen bortset fra de lodrette kanter og identificere båndet af produkt med kortbølget UV 254 nm lampe. Skrabe produktet fra pladen med en spatel og isolere det rene produkt ved anvendelse af chloroform: methanol: 28% ammoniumhydroxid (8: 1: 0,1) blanding.
- Fjerne opløsningsmidler i en rotationsfordamper under reduceret tryk. Opløse de resterende pellets i 1 ml 50% EtOH: H2O, dispensere i 50 pi alikvoter i 1,5 ml rør (~ 20 alikvoter) og tør i en centrifugalfordamper indtil al opløsningsmiddel afdampes (~ 3 h).
- Genopløse hver alikvot i 200 pi af 50% EtOH: H2O og tør igen i en centrifugalfordamper. Opløs hver alikvot igen i 200 pi 50% EtOH: H2O, tør i en centrifugal fordamper og gemme pellets ved -20 ° C til langtidsopbevaring.
- Til anvendelse, pellet opløses i 50 pi 50% EtOH: H2O Fremstil en 1: 100 fortynding af det opløste Dig-TMP i H2O og måle OD ved 250 nm. Ekstinktionskoefficienten for Dig-TMP er 25.000. Opløsningen er stabil i omkring en måned, hvis den opbevares ved -20 ° C. Kontrollere koncentrationen ved at måle OD ved 250 nm før hver brug.
- Beregn stamkoncentration: Abs x 100 x10 6 / 25.000 = Koncentration (i uM). Typisk stamopløsningen er ca. 3 mM. Det er vigtigt at være i dette interval for at minimere volumenet af EtOH tilsat til mediet.
2. Laser Lokaliserede Dig-TMP ICLS
- Perform laser lokalisering med et konfokalt mikroskop med et SRS nitrogen laser (337 nm) pumpet gennem et farvestof celle udsender en linje på 365 nm og fyring 3 ns pulser ved 10 Hz, med en effekt på 0,7 nW.
- Lav en lodret markering på siden af en 35 mm glas bund celledyrkningsskål med en markeringspen. Ridse den ind i centrum af glasset på dyrkningsoverfladen med en diamant pen, således at den sorte stribe på den side af skålen er i toppen af den ene arm af korset. Korset er markeret på vækst overfladen af glasset, således at den, og cellerne vil være i den samme fokale plan.
- Steriliser plade efter mærkning med en skylning på 70% EtOH. Tørre, før udpladning celler.
- Plate-celler (standard laboratoriestammer såsom HeLa eller U2OS) i indlægget mærket dyrkningsskåle en eller to dage før. Cell bør aktivt dividere og 50-70% sammenflydende på dagen for eksperimentet. Inkuber 24 timer med 1 pM 5-chlor-2-deoxyuridin (CldU) til ensartet etiket DNA.
- TilføjeDig-TMP i 50% EtOH: H2O til celledyrkningsmediet til en slutkoncentration på 20 uM. Bringe mediet til 37 ° C. Ændre mediet over cellerne og sted i inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 30 min for at tillade Dig-TMP at ækvilibrere.
- Mens cellerne inkubere, fastlægge x / y-koordinaterne for synsfeltet, hvor laseren er aktiv. Følg producentens kalibrering procedure, hvor laseren er instrueret af softwaren til at ætse et spejlglas glide langs en vandret og diagonal linje. De to linjer definere grænserne for det område, hvor laseren kan ramme et mål.
- Pladen anbringes i miljøkammeret, ved 37 ° C med kontrolleret CO2 og fugtighed, på mikroskopbordet og fokus med 60X olie mål på skæringspunktet af korset.
- Dirigere 365 nm laserstråle til et ROI, etableret af investigator med formen værktøjet i softwaren, for at danne en stribe af 3 &# 181; mx 0,6 um. Omridset af ROI placeres af markøren i cellekernerne ligger i umiddelbar nærhed af skæringspunktet af korset. Juster z brændplanet at målrette laseren midtvejs gennem kernen. Anvende en laser i området 350-370 nm. 405 nm lasere kan ikke fremkalde tværbindinger 19.
BEMÆRK: Vi lokalisere ROI i nucleoplasmic områder uden for nucleoli, som kan skelnes fra nukleoplasma i differential interferens kontrast (DIC) billeddannelse. - Kontroller fokus og aktivitet laseren ved at øge magt indstilling til et tilstrækkeligt niveau til at udslette en celle (cellen bliver mørkere og derefter forsvinder). Dette er en vigtig diagnostisk for en uhindret lysbane for laseren gennem mikroskopet og derefter gennem dækglasset og i cellerne.
- Sænk magt indstilling til lige nok til at aktivere psoralen og ICL inducerede DDR (dette skal bestemmes empirisk for hver laser / microscope kombination). Anvende en laser intensitetsindstilling (1,7% her), som ikke aktiverer DDR i fravær af psoralen (overvåget ved dannelsen af γ-H2AX).
BEMÆRK: Dette er en vigtig bestemmelse, og indstillingerne kan kræve justering hvis laseren kilde eller en komponent i lysbanen ændres. Følge ophobningen af GFP mærkede reparation proteiner, såsom XPC eller ventilator1, som begge er hurtigt rekrutteret (i sekunder) til laser psoralen striber, men ikke at ROI udsat for alene laseren. Nogle proteiner af DDR vises inden for få sekunder, mens flere minutter kan være nødvendig for andre. Det er nødvendigt at udføre tidsforløbet bestemmelser for hvert protein af interesse. Vi bemærker også, at der ikke er nogen striber af responderende proteiner i celler, der ikke blev udsat for laseren.
- Sænk magt indstilling til lige nok til at aktivere psoralen og ICL inducerede DDR (dette skal bestemmes empirisk for hver laser / microscope kombination). Anvende en laser intensitetsindstilling (1,7% her), som ikke aktiverer DDR i fravær af psoralen (overvåget ved dannelsen af γ-H2AX).
- Efter alle celler i et område er blevet målrettet flytte pladen til et nyt felt, opholder sig tæt til skæringspunktet mellem korset.
- I eksperimenter designet til at determine fordelingen af indbyrdes læsion afstande eksponere celler til laseren i 20-25 felter (4-5 celler / bane) omkring skæringspunktet. For at analysere replikations mønstre i nærheden af de lokaliserede ICLS inkuberes celler med 10 pM 5-iod-2-deoxyuridin (IDU) efter laser fyring.
BEMÆRK: Inkubationstiden med IDU er noget arbitrær. Vi har brugt så kort som 20 minutter, og så længe som 60 min (se nedenfor). Længere pulser (nogle få timer) resulterer ofte i flere replikation skrifter sammensmeltende, og dermed miste muligheden for at billedet forløbet af enkelte gafler. I nogle eksperimenter ces er mærket med CldU i 24 timer til ensartet etiket DNA før eksponering for Dig-TMP efterfulgt af pulsmærkning af replikations- skrifter.
3. Høst af celler og Stretching af DNA Fibre
- Fjern pladen fra scenen, fjern medium og vask med phosphatbufret saltvand (PBS). Fjern PBS-opløsningen. Placer en 10 pi dråbe af en kommerciel trypsin/ EDTA-opløsning på skæringspunktet af indlægget i midten af glasoverfladen.
- Inkuber i 3-4 minutter ved stuetemperatur (RT) og derefter trække trypsinopløsningen med de løsnede celler i pipettespidsen. Der er ingen grund til at neutralisere trypsin.
- Placer dråbe trypsin / EDTA med cellerne i den ene ende af et silaniseret objektglas af glas. Lyserer cellerne og frigive DNA ved tilsætning af 10 pi 0,5% SDS-opløsning og inkuberes i 3-4 min ved stuetemperatur forsigtig blanding med pipettespidsen, hvilket tillader periferien af puljen til tørre.
- Vip slide 20º og tillade at væsken løber ned til enden. DNA fibre forlænget / strækkes ved de hydrodynamiske kræfter den strømmende væske. Lad objektglassene lufttørre (~ 10 min) og fikseres i 3: 1 methanol / eddikesyre i 10 minutter. Fjern dias fra fix løsning og lufttørre igen. På dette tidspunkt kan de opbevares på ubestemt tid i 70% EtOH ved -20 ° C. Ved fjernelse fra 70% EtOH lad det lufttørre før next trin.
- Skylning af objektglas i PBS, og derefter denaturere i 2,5 M HCI i 1 time ved stuetemperatur. Denne behandling depurinates DNA, de inkorporerede halogenerede nukleobaser tilgængelige for antistoffer.
- Neutralisere objektglassene i 0,4 M Tris-HCI, pH 7,4. Vaskes to gange i PBS / 0,5% Tween-20 (PBST) i 5 minutter hver.
- Blok glider med 5% bovint serumalbumin (BSA) og 10% gedeserum i PBS. Dækker objektglassene forsigtigt med en parafilm at sprede blokeringsopløsningen jævnt over objektglasset og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Pipetter 100 pi 1: 200 fortynding i blokeringsopløsning af rotte-anti-bromdeoxyuridin (specifikt påviser CldU) primært antistof til hvert objektglas. Dækker objektglassene forsigtigt med en parafilm at sprede fortynding jævnt over objektglasset og inkuberes i et fugtigt kammer i 1 time ved stuetemperatur. Fjern parafilm og vask dias tre gange i PBST i 5 min hver.
- Pipetter 100 pi fortyndet (1: 100) gede-anti-rotte Alexa Fluor 647 i blokeringsopløsning til hvert objektglas. Dækglider forsigtigt med en parafilm og inkuber i 45 minutter ved stuetemperatur. Vask dias tre gange i PBST i 5 min hver.
- Pipetter 100 pi fortyndet (1:40) muse-anti-bromdeoxyuridin (registrerer LDU og CldU Denne dobbelte specificitet nødvendiggør blokering af CldU af rotte-anti BrdU i den kendte inkubation.) Primært antistof og kanin-anti-DIG-antistof (1: 200 ) i blokeringsopløsning til hvert objektglas. Dækker objektglassene forsigtigt med en parafilm og inkuber i et befugtet kammer i 1 time ved stuetemperatur. Vask dias tre gange i PBST i 5 min hver.
- Pipetter 100 pi fortyndet (1: 100) gede-anti-muse Alexa Fluor 488 ogC (1: 5.000) gede-anti-kanin-probe (fx Qdot 655) i blokeringsopløsning til hvert objektglas. Dæk slides forsigtigt med parafilm og inkuberes i 45 minutter ved stuetemperatur. Vask dias tre gange i PBST i 5 min hver.
- Dræne overskydende PBST på en papirserviet. Der tilsættes 50 pi antiblegemiddel montering medium på hvert objektglas og dækkes med et dækglas. Billede eller butik forikke mere end 48 timer ved -20 ° C.
4. Fiber Imaging af Fluorescence Microscopy
- Udføre erhvervelse billede gennem en 63X objektiv på et omvendt mikroskop med en vedhæftet fuldt motoriseret filterhjul med FITC, Cy5 og Q Dot 655 påvisning. Excitationsfiltersystemet er 425 nm og emission filter er 655 nm med 20 nm centreret ved spidsværdien for udsendelse 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laser lokaliserede Dig-TMP (figur 1A) ICLS kan vises ved immunofluorescens mod Dig-mærket knyttet til psoralen. Selvom laseren kan rettes til at slå i et område af enhver kontur, striber er ikke "naturlige" former i celler, og legitime signaler kan let skelnes fra artefakter på grund af ikke-specifik binding med primære eller sekundære antistoffer. Denne funktion er nyttig, når du bruger antistoffer af mindre end perfekt specificitet. Et eksempel på den velkendte markør af DDR, γ-H2AX i en stribe af Dig-TMP ICLS er vist i figur 1B.
Immunfluorescenspåvisningen af Dig mærkede læsioner i laser striber tillader ikke nogen konklusioner med hensyn til frekvens og afstand mellem addukter. For at gøre blev denne bestemmelse celler inkuberet med CldU i 24 timer forud for indføring af ICLS. Den farvning mod the CldU tillader visualiseringen af Dig mærkede læsioner på lange fibre og giver klarere mønstre fiber end direkte pletter, såsom DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) eller YOYO {1,1' - (4,4,8 , 8-tetramethyl-4,8-diazaundecamethylene) bis [4 - [(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-yl) methyliden] -l, 4-dihydroquinolinium] -tetraiodid}. Efter indføring af ICLS ved laser-fotoaktivering blev fibre spredes fra de målrettede celler. Analysen af Dig signaler på fibre, såsom dem der er vist i figur 2 viste, at de inter ICL afstande varierede fra mindre end 10 kb til mere end 160 kb, som beskrevet i vores nylige publikation 21. Der var ingen evidens for klynger addukter. Således banen af Dig tag, og akkumuleringen af DDR proteinerne i stribe, afspejlede tilstedeværelsen af godt adskilte læsioner, i det mindste som målt langs den udstrakte DNA. Betragtes i form af cellulær kromatin hvis ICLS dannet i nukleosomale arrays, med en 6fold kompression af udvidet DNA længde, ville de stadig være adskilt af hvad der svarer til ca. 1,6 kb DNA.
Eksperimenter featuring laserinduceret DNA-beskadigelse følger generelt induktionen af DDR. Disse eksperimenter er sjældent beskæftiger sig med spørgsmål om DNA-replikation. På den anden side er DNA fiber assays anvendes typisk til studier af replikation. Eksponering af celler for korte impulser af halogenerede nukleosidanaloger resultater i deres inkorporering i DNA. Immunofluorescensanalyse af DNA fibre afslører skrifter af inkorporerede analoger repræsenterer nylig DNA-syntese. Det var interessant at spørge, om DNA-replikation forekom i laseren lokaliseret ICL striber, og hvis ja, hvad der ville være mønsteret for replikation i nærheden af ICLS? Celler blev inkuberet i 24 timer med CldU at lette visningen af lange fibre. Laser lokaliserede ICLS blev indført i celler efterfulgt af en 1 timers puls af IDU. DNA f ibers blev fremstillet ud fra de målrettede celler og Dig mærkede ICLS og replikations skrifter vises. Resultaterne indikerede, at laser aktivering af psoralen ikke lukker ned replikation eller påvirke den samlede frekvens af replikations- mønstre. Replikation observeret på den ene side, samt på begge sider af ICLS, med dobbeltsidet mønstre i et 4: flertal 1 som vi for nylig har vist 21.
Figur 1: Generering af Laser Lokaliserede Dig-TMP ICLS. (A) Strukturen af Dig-trimethyl psoralen. (B) Akkumulering af γ-H2AX (grøn) i ROI indeholdende laser lokaliserede ICLS (DIG, rød). Kernen er farvet med DAPI (blå). Billedet lysfelt viser en celle delvist på mærket foretages af diamant ve. Bemærk nucleoli, og placeringen af ROI uden dem.csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg" target = '_ blank'> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: DNA-Fibre med Laser Lokaliseret Dig-TMP Signaler. (A) Celler blev inkuberet i 24 timer med CldU at mærke DNA. Derefter laser lokaliserede ICLS blev indført og (B) blev cellerne høstet og fibre spredes. (C, D) Dig signaler blev vist med en immunoquantum prik (rød) og CldU ved immunfluorescens (grøn). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laseren lokalisering teknologi kræver anvendelse af adhærerende celler med kerner, der er synlige i lysfeltmikroskopi. Vi har forsøgt at vedhæfte vedhæftede celler, såsom primære lymfocytter eller løst adhærerende dyrkede celler, såsom AD293, til glasoverfladen med celleadhæsive præparater, såsom polylysin eller kollagen, eller mere komplekse blandinger. Selv om disse behandlinger kan binde cellerne til overfladen, finder vi, at de generelt forblive afrundet gør det meget vanskeligt at fokusere ind i kernerne. Endvidere cellerne ofte undlader at overleve den indledende vask efter fjernelse af vækstmediet. Men inden for kravet om vedhængende celler, vi har med succes brugt en bred vifte af standard cellelinjer samt primære celler til disse undersøgelser. Det er nyttigt at teste celler til mycoplasma. Vi finder, at celle responser ændret af disse infektioner.
Omdrejningspunktet plan laseren er vigtig. Målet er atplacere ICLS i kernen. For høj, og fotoaktivering vil ligge over kernen; for lavt, og det vil være på glasset. Vi finder det nyttigt at skærpe fokus i DIC billedet i skæringspunktet mellem cytoplasmaet og kernen.
Fiberen assays er ikke svært, men kræver nogle praksis før fortolkelige felter udvindes. Det er vigtigt at gennemføre denne teknik ordentligt. Antallet af celler udvundet fra laser eksperimenter er lav, og hver prøve anvendes i sin helhed på en enkelt slæde. Det er derfor vigtigt at maksimere udbyttet fra hvert forsøg, som prøver ikke kan opdeles, med portioner gemt til senere analyse. Dog kan hundredvis af arrangementer inddrives fra en enkelt prøve. To funktioner i proceduren er af central betydning. Den ene er strømningshastigheden af cellelysatet ned objektglasset. Hvis for hurtigt, vil en stor del af DNA'et løber af dias. Kvaliteten af objektglas er også kritisk. Vi lejlighedsvis Receive masser, der er ineffektive. Derfor hver ny parti skal testes før brug.
Som det gælder for alle laboratoriemanipulationer pålideligheden af kommercielle reagenser-antistoffer, immunoquantum prikker osv, er altid en bekymring. Disse er ikke altid stabile og eksperimentel fejl er normalt spores til problemer med den ene eller anden reagens. De immunoquantum prikker er særlig problematiske og flere partier kan være nødvendigt at blive testet for at identificere en, der er acceptabel. Ineffektiv partier er markeret med høje baggrundssignaler. Disse er ikke forbundet med fibre og vil blive set på områder af objektglasset, der har intet DNA.
Brugen af lasere til at indføre lokale DNA-skade er blevet ganske populær, da den blev indført af Bonner gruppe 4. I disse, og mest efterfølgende eksperimenter er effektindstillinger laser for således at inducere DDR direkte. Vi har brugt en magt indstilling tilstrækkelig lav such at aktiveringen af DDR er afhængig af både laser og psoralen. Som diskuteret ovenfor, adskillelsen mellem psoralen addukter hævder, at vi ser på reaktionen på enkelte begivenheder. Mens antallet af ICLS der er dannet af endogene tværbindingsmidler ikke er kendt, noterer vi, at lokalisering af psoralen addukter ikke dræber cellerne, som de er i stand til at fjerne psoralen addukter inden 6-8 timer (ikke-offentliggjorte data) og er til stede og sunde 24 timer senere. Således denne fremgangsmåde er meget mindre giftigt for celler end protokoller, der kræver udsættelse for midler, der indfører DNA skader i hele kernen og mitochondrier.
Laseren / psoralen kombination indføre en helix fordreje struktur, der aktiverer DDR. I denne forbindelse de opnået fra denne fremgangsmåde resultater gælder for en række helix fordreje læsioner i betragtning af overlappende natur af DDR, efter aktiveringen af ATM / DNAPK / ATR kinaser 22.I denne forbindelse DNA fiber fremgangsmåde beskrevet her kunne udvides til enhver DNA-struktur, som kan påvises ved immunologiske eller kemiske eller biokemiske midler, som kan vises ved hjælp af fluorescens. Disse kunne omfatte UV fotoprodukter 23, voluminøse alkylatorer 24, G quadruplexes 25 og oxidative læsioner 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev delvist understøttet af den Intramural forskningsprogram for NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) og fanconis anæmi Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100 mL | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5,000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
References
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).
- Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB? Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).
- Aguilera, A., Garcia-Muse, T.
- Swenberg, J. A., et al. Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment. Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).
- Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions. J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).
- Lai, C., et al. Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation. Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).
- Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells. J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).
- Nowsheen, S., et al. Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues. Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).
- Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).
- Huang, J., et al. Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks. Front Genet. 7, 84 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).
- Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts. Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).
- Poirier, M. C. Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples. Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).
- Henderson, A., et al. Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).
