El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos

Resumen

Los láseres se utilizan con frecuencia en los estudios de la respuesta celular al daño del ADN. Sin embargo, que generan lesiones cuya distancia, la frecuencia y las colisiones con las horquillas de replicación están raramente caracterizado. Aquí se describe un método que permite la determinación de estos parámetros con láser localizado entrecruzamientos entre cadenas.

Resumen

La respuesta al daño del ADN (DDR) se ha caracterizado ampliamente en estudios de doble filamento se rompe (DSBs) inducida por irradiación con haz de micro láser en células vivas. El DDR a la hélice que distorsionan modificaciones del ADN covalentes, incluyendo entrecruzamientos de ADN entre hebras (ICL), no está tan bien definida. Hemos estudiado la DDR estimulado por ICL, localizada por fotoactivación de psoralenos láser immunotagged, en los núcleos de las células vivas. Con el fin de abordar cuestiones fundamentales sobre distribución de aductos y encuentros horquilla de replicación, se combinaron localización láser con otras dos tecnologías. fibras de ADN se utilizan a menudo para mostrar el progreso de las horquillas de replicación por inmunofluorescencia de análogos de nucleósidos incorporados durante pulsos cortos. puntos Immunoquantum han sido ampliamente empleado para obtener imágenes de una sola molécula. En el nuevo enfoque, las fibras de ADN de las células que llevan ICL láser localizada se extendieron sobre portaobjetos de microscopio. Las ICL etiquetados se muestran con puntos immunoquantum y THe distancias entre las lesiones determinadas. colisiones horquilla de replicación con ICL se pueden visualizar y diferentes patrones de encuentro identificaron y se cuantificaron.

Introducción

DNA está bajo asalto constante de los agentes exógenos tales como la radiación, luz ultravioleta, toxinas ambientales, productos de combustión, etc. Además, también es atacado por las especies de radicales endógenos producidos por el metabolismo oxidativo. Todos estos tienen el potencial de alterar química o físicamente la integridad del ADN ^1. Las perturbaciones en el genoma pueden activar la respuesta al daño del ADN (DDR), un reclutamiento y la cascada de la modificación post traduccional con cientos, si no miles, de proteínas y microRNAs implicados en la reparación de la lesión, la regulación del ciclo celular, apoptosis, senescencia, y la....

Protocolo

1. Preparación de Dig-TMP

1. Mezclar 50 mg (0,18 mmoles) de 4'-clorometil-4,5' , 8-trimetilpsoraleno y 590 mg (2,7 mmoles) de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amina en un lugar seco 25 ml ronda matraz -fondo bajo nitrógeno. Añadir 10 ml de tolueno y reflujo durante 12 h. Eliminar el disolvente en un evaporador rotatorio a presión reducida.
   1. Se purifica el residuo por cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice. Eluir la columna con cloroformo, metanol y solución al 28% de amoniaco (9: 1: 0,5). Se evapora el disolvente en un evaporador rotatorio a presión reducida, y recuperar el puro 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-t....

Resultados

ICL láser localizadas Dig-TMP (Figura 1A) se pueden visualizar por inmunofluorescencia en contra de la Dig-tag vinculado al psoraleno. Aunque el láser puede ser dirigido de huelga en una superficie de cualquier contorno, rayas no son formas "naturales" en las células, y las señales legítimos se pueden distinguir fácilmente de los artefactos debido a la unión no específica por los anticuerpos primarios o secundarios. Esta característica es muy útil cuando se uti.......

Discusión

La tecnología de localización láser requiere el uso de células adherentes con núcleos que son visibles en microscopía de campo claro. Hemos tratado de unir las células no adherentes, tales como linfocitos primarios, o células cultivadas de baja adherencia, tales como AD293, a la superficie de cristal con preparaciones adhesivas de células tales como polilisina o colágeno, o mezclas más complejas. Aunque estos tratamientos pueden unir las células a la superficie, nos encontramos con que por lo general se quedan redondead.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Digoxigenina NHS éster	Sigma-Aldrich	11333054001
cloro-psoraleno	Berry and Associates	PS 5000
diaminoglicol	Sigma-Aldrich	369519	4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamina
Cloroformo	Acros Organics	423550040
Metanol	Fisher Scientific	A4524
Solución de amonio	Sigma-Aldrich	5002
placas TLC	Analtech, Inc.	P02511
Columna de vidrio Flass 24/40, 100 mL	Chemglass Life Sciences	CG-1196-02
Microscopio confocal de disco giratorio Nikon T2000_E2, equipado con cámara de control ambiental y de etapa automatizada y soporte de placa	Perkin Elmer		con software Volocity
Micropoint Galvo	Andor Technologies		con un láser pulsado de nitrógeno
célula de colorante	Andor Technologies	MP-2250-2-365
tinte 365	Andor Technologies	MP-27-365-DYE
IdU	Sigma-Aldrich	17125
Placas de vidrio de 35 mm 1.5 cubreobjetos, 10 mm de diámetro de vidrio, sin recubrimiento	Portaobjetos de	P35G-1.5-10-C
	Nuevo Suministro Parte	# 5070	Nuevos portaobjetos de silano
Anticuerpo anti BrdU de ratón (IdU)	BD Biosciences	347580	1 en 40
Rata anticuerpo anti BrdU (CldU)	Abcam	ab6326	1 en 200& nbsp;
Anticuerpo anti Dig para conejos	ThermoFisher Scientific	710019	1 en 200
Q-dot 655 anti conejo para cabras IgG	ThermoFisher Scientific	Q-11421MP	1 en 5.000
AF647- cabra anti ratas IgG	Jackson Immunoresearch	112-605-167	1 en 100
AF488-cabra anti ratón IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-166	1 en 100
Zeiss epifluorescente microscopio A200	Zeiss		con el software Axiovision
Q-dot 655 filter	Chroma	39107

microscopio Matek