Summary
Лазеры часто используются в исследованиях клеточного ответа на повреждение ДНК. Тем не менее, они генерируют повреждения которых расстояние, частоту и столкновения с вилками репликации редко характеризуются. Здесь мы описываем подход, который позволяет определить эти параметры с лазерными локализованы interstrand сшивок.
Abstract
Повреждение ДНК реагирование (РДР) было широко охарактеризовано в исследованиях двойных разрывов ДНК (DSBs), индуцированных лазерный микро облучением пучка в живых клетках. DDR, чтобы спираль искажая ковалентные модификации ДНК, в том числе interstrand сшивок ДНК (МКСТ), не так хорошо определены. Мы изучали DDR стимулируются ICL, локализованных с помощью лазерной фотоактивации immunotagged псораленов, в ядрах живых клеток. Для решения фундаментальных вопросов о распределении аддукта и вилка репликации столкновениях, мы совместили локализацию лазера с двумя другими технологиями. ДНК-волокна часто используются для отображения хода вилки репликации с помощью иммунофлуоресценции аналогов нуклеозидов, включенных в течение коротких импульсов. Immunoquantum точка была широко использована для одного изображения молекулы. В новом подходе, ДНК-волокна из клеток, несущих лазерные локализованы ICLS распространяются на предметные стекла микроскопа. В помеченном МКСТЕ отображается immunoquantum точек и йе между поражением расстояние определяется. Репликация вилочные столкновения с ICL, можно визуализировать и различные модели сталкиваются с идентифицированы и количественно.
Introduction
ДНК находится под постоянным нападением от экзогенных агентов, таких как облучение ультрафиолетового света,, токсины окружающей среды, продукты сгорания и т.д. Кроме того, он также атакован эндогенными радикальных частицами, полученных путем окислительного метаболизма. Все они имеют потенциал , чтобы химически или физически нарушить целостность ДНК 1. Возмущения в геноме может активировать ДНК Damage Response (DDR), а набор и пост трансляционной модификации каскада с сотнями, если не тысячи, белков и микроРНК, участвующих в репарации повреждений, регуляции клеточного цикла, апоптоза, старении и воспалительных путей 2.
Большая часть нашей информации о DDR в исследованиях с DSBs. Это в значительной степени из - за наличие технологий для внедрения брейков, включая последовательность конкретных разрывы, в геномной ДНК в живых клетках 3. Кроме того, propensitу обрывов, чтобы вызвать фокусы DDR белков, которые могут быть отображены с помощью иммунофлуоресценции, было очень полезно для определения кинетики и требований реагирующих белков. Одной из ключевых технологий для изучения DDR был представлен Боннэр и коллегами, которые использовали лазерный луч направить полосу DSBs в «области интереса» (ROI) в ядрах живых клеток 4. В сущности, они создали длинный фокус, в котором белки DDR могут быть определены с помощью иммунофлюоресценции. Это было проиллюстрировано их демонстрацией сильной полосы фосфорилированного гистона H2AX (γ-H2AX) в лазерном воздействии клеток. С тех пор лазерный подход был использован в многочисленных исследованиях DDR, индуцированных DSBs. Хотя мощный и популярный, и источник драматических образов иммунофлюоресценции, следует отметить, что в большинстве опытов интенсивности лазерного излучения регулируют таким образом, чтобы наблюдаемые результаты, не заботясь о личности поражения,плотность, или промежуток. На самом деле, это может быть трудно сделать эти оценки. Таким образом , они в значительной степени игнорируются, несмотря на множественность поражений , введенных в ДНК с помощью лазеров 5. Это способствует много противоречий в литературе 6.
В отличие от DSBs, большинство химических модификаций ДНК не стимулируют образование дискретных очагов DDR белков. Это очень важно в свете современного понимания частоты поражения. Было подсчитано , что человеческие клетки в культуре несут целых 50 DSBs за клеточный цикл, сформированных в основном во время S фазы 7, 8, 9. Меньшее образуются в не пролиферирующих клеток. Это контрастирует с количеством потерь нуклеотидных или модификации событий, которые в десятки тысяч на клетку / день 1, 10. Таким образом, мы знаем больше всегоДДР индуцируется событиями, которые являются относительно редких, и гораздо меньше о тех, индуцированных спирали искажая поражения, которые в совокупности являются гораздо более распространенным явлением.
Для решения вопросов о клеточном ответе на ковалентные модификации геномной ДНК, мы хотели работать с спиралью искажая ДНК аддукта, который имел присущую DDR индукции активности. Кроме того, для облегчения опытно-конструкторских и интерпретации мы были заинтересованы в структуре которого введение можно контролировать по времени и был поддается визуализации. Соответственно, мы разработали стратегию, основанную на псоралене. Псоралено хорошо охарактеризованы светочувствительные интеркаляторы ДНК, благоприятствующие 5' TA: AT сайтов. В отличии от других сшивающих агентов, таких как азот горчица и митомицин C (MMC) они не являются ДНК-реактивными, если не подвергаются воздействию длинноволнового ультрафиолетового (УФ) света. Интеркалированные молекулы реагируют с основаниями тимина на противоположных нити для производства спирали искажая interstrand сшивок (ICL,) 11. С триметили псорально , используемые в наших экспериментах большинство продуктов ICLS, относительно мало monoadducts генерируется (менее 10%) 12 и intrastrand сшивки между соседними основаниями на одной нити не образуются. Поскольку они являются мощными блоками для репликации и транскрипции, псорально и других сшивающих агентов, как цис-платина и MMC, которые обычно используется в химиотерапии. Таким образом, псорально включено исследование, которые следовали за активацию DDR с помощью спиральной искажающей структуры, а также обеспечили понимание клеточного ответ на соединение с клинической значимостью.
Мы синтезировали реагент, в котором триметил псорален был связан с дигоксигенином (Dig), растительный стерин не найден в клетках млекопитающих и часто используется в качестве immunotag. Требование фотоактивации позволяет локализацию с помощью лазерного света (365 нм) псорален ICL, в определенной ROI в ядрах в живых клетках. Они могут быть отображены IMMunofluorescence против тега Dig. Репарации ДНК и белки DDR появились в полосах лазера локализованных ICLS 13, 14.
DDR активируется с помощью лазера высокой интенсивности , используемой для производства DSBs может быть связан с изолированным или кластерным повреждением 15, 16. Следовательно, актуальность результатов этих экспериментов в природе поражения, присутствующие в значительно меньшей концентрации, является неопределенным. Для решения подобных вопросов о псоралена частоте аддукта и расстоянии в ДНК, мы воспользовались ДНК волоконной технологии 17 и immunoquantum точек. Квантовые точки намного ярче, чем флуоресцентные красители и не отбеливают под воздействием света. Таким образом , они часто используются для визуализации одной молекулы 18, приложение , для которого флуоресцентные красители являются недостаточно яркими. Отдельные волокна ДНК могут быть растянуты на гLass слайды и могут быть отображены с помощью иммунофлуоресценции против аналогов нуклеозидов, включенных во инкубационных перед клеточным урожаем. Мы обрабатывали клетки с Dig-псораленом и разоблачили ROI для лазерной микро-облучения. Волокна были получены из клеток и отдельных Dig-псорален аддуктов могут быть визуализированы с immunoquantum точками. Воздействие на клетки аналогам нуклеозидов в течение относительно короткого времени (20-60 мин) позволяет отображать трактов репликации в непосредственной близости от лазера локализуется МКСТ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение Dig-TMP
- Смешайте 50 мг (0,18 ммоль) 4'-хлорметил-4,5' , 8-trimethylpsoralen и 590 мг (2,7 ммоль) 4,7,10-триокса-1,13-tridecanedi-амина в сухом 25 - мл круглодонную -bottom колбу в атмосфере азота. Добавляют 10 мл толуола и обратным холодильником в течение 12 ч. Растворитель удаляют на роторном испарителе при пониженном давлении.
- Остаток очищают с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле. Элюируют колонку хлороформом, метанолом и 28% -ным раствором аммиака (9: 1: 0,5). Растворитель выпаривают в роторном испарителе при пониженном давлении, и восстановить чистый 4 «- [N- (13-амино-4,7,10-trioxatrideca)] аминометил-4,5», 8-trimethylpsoralen в виде бледно-желтого вязкого жидкость.
- Смешайте 5,5 мг (0,012 ммоль) 4 '- [N- (13-амино-4,7,10-trioxatrideca)] аминометил-4,5', 8-trimethylpsoralen с 5 мг (0,008 ммоль) сложного эфира дигоксигенин в NHS сухая круглодонная колба в атмосфере азота. Добавить 0,5 мл безводного диметилформамида (ДМФА)д 3,4 мкл триметиламин и перемешивают при 50 ° С в течение 18 ч.
- Растворитель удаляют на роторном испарителе при пониженном давлении.
- Остаток растворяют в минимальном количестве дихлорметана. Нанесите раствор в 2 мкл пятен горизонтально по нижней части препаративной тонкослойной пластине с силикагелем в качестве стационарной фазы. Запуск препаративной ТСХ в смеси хлороформ: метанол: 28% гидроксида аммония (8: 1: 0,1).
- Маска пластины для вертикальных краев, за исключением и идентифицировать группу продукта с коротковолновой УФ 254 нм лампы. Выскоблите продукт от пластины с помощью шпателя и изолировать чистый продукт, используя смесь хлороформ: метанол: 28% гидроксида аммония (8: 1: 0,1) смеси.
- Удалить растворители в роторном испарителе при пониженном давлении. Растворите остаточных гранул в 1 мл 50% этанола: H 2 O, разлить в 50 мкл аликвоты в 1,5 мл пробирки (~ 20 аликвоты) и сушат в центробежной испарителе до тех пор , пока весь растворитель выпаривают (~ 3 ч).
- Растворяться каждую аликвоту в 200 мкл 50% этанола: H 2 O и сухой снова в центробежном испарителе. Растворить каждую аликвоту снова в 200 мкл 50% этанола: H 2 O, сушат в центробежной испарителя и хранения гранул при температуре -20 ° С в течение длительного хранения.
- Для использования, растворить осадок в 50 мкл 50% этанола: H 2 О. Приготовьте 1: 100 разбавление растворенного Dig-ТМП в H 2 O и измерения оптической плотности при длине волны 250 нм. Коэффициент экстинкции Dig-TMP 25,000. Раствор стабилен в течение месяца при хранении при температуре -20 ° C. Проверьте концентрацию путем измерения оптической плотности при 250 нм перед каждым использованием.
- Рассчитать концентрацию акций: Абс х 100 х10 6/25000 = Концентрация (в мкМ). Обычно маточный раствор составляет около 3 мМ. Важно, чтобы быть в этом диапазоне, с тем чтобы свести к минимуму объем этанола добавили к среде.
2. Лазерная Локализованные Dig-TMP МКСТ
- Пелокализация лазерного rform с конфокального микроскопа с азотным лазером SRS (337 нм) прокачивают через ячейку красителя, испускающие линию 365 нм и обжиг 3 нс импульсы с частотой 10 Гц, при мощности 0,7 нВт.
- Сделать вертикальную отметку на стороне 35 мм стекла с дном клеточной культуры блюда с маркером. Царапины креста в центре стекол на поверхности культуры с алмазной ручкой таким образом, чтобы черная полоса на стороне тарелки находится в верхней части одной руки креста. Крест отмечен на поверхности роста стекла, так что он и клетки будут находиться в одной и той же фокальной плоскости.
- Стерилизация пластины после маркировки с ополаскиванием 70% этанола. Просушите перед покрытием клеток.
- Пластина клетки (стандартные лабораторные штаммы, такие как HeLa или U2OS) в креста отмечены культуральные чашки один или два дня до этого. Сотовый следует активно делиться и 50-70% сплошности на день эксперимента. Инкубируют 24 ч с 1 мкМ 5-хлор-2-дезоксиуридина (CldU) равномерно ДНК метки.
- ДобавитьДиг-ТМП в 50% EtOH: H 2 O в клеточной культуральной среде до конечной концентрации 20 мкМ. Доведите среды до 37 ° С. Изменение среды над клетками и место в инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2) в течение 30 мин , чтобы позволить Диг-ТМП для уравновешивания.
- В то время как клетки инкубирования, устанавливают X / Y координаты поля зрения, в котором лазер является активным. Выполните процедуру калибровки производителя, в котором лазер направляется с помощью программного обеспечения для травления зеркального стекла скользить по горизонтали и диагонали. Две линии определяют границы поля, в котором лазер может поразить цель.
- Поместите пластину в климатической камере при 37 ° С с контролируемой CO 2 и влажности, на столике микроскопа и фокус с целью нефти 60X на пересечении креста.
- Направить 365 нм лазерный луч на ROI, установленном исследователем с помощью инструмента формы в программном обеспечении, чтобы сформировать полоску 3 &# 181; ое 0,6 мкм. Контур ROI помещается курсором в ядрах клеток, расположенных в непосредственной близости от пересечения креста. Регулировка г фокальной плоскости для направления лазерного на полпути через ядро. С помощью лазера в диапазоне 350-370 нм. 405 нм лазер не может вызвать сшивки 19.
Примечание: Мы размещаем КОРОЛЬ в нуклеоплазме районов за пределами ядрышек, которые можно отличить от нуклеоплазмы в дифференциальном интерференционном контрасте (DIC) изображениях. - Проверьте фокусировку и активность лазера путем увеличения мощности установки до уровня , достаточного , чтобы уничтожить клетку (клетка будет темнеть , а затем исчезает). Это является важным диагностическим для беспрепятственного пути света для лазера через микроскоп , а затем через покровный и в клетки.
- Опустить установку мощности на достаточно просто активировать псорален и ICL индуцированный DDR (это должно быть определено эмпирически для каждого лазерного / микрофонаroscope комбинации). Использование лазерной интенсивности установки (1,7%), что здесь не активирует DDR в отсутствие псорален (контролируется образованием гамма-H2AX).
Примечание: Это важное определение и настройки могут потребовать корректировки, если лазерный источник или компонент на пути прохождения света изменяется. Выполните накопление GFP помечены ремонт белки, такие как XPC или FAN1, оба из которых быстро набираемых (в секундах) до псоралена полосы лазера, но не к ROI воздействию только лазеру. Некоторые белки DDR появляются в течение нескольких секунд, в то время как несколько минут могут потребоваться для других. Необходимо выполнять определение курса времени для каждого интересующего белка. Отметим также, что в клетках, которые не подвергались воздействию лазера нет полосы реагирующих белков.
- Опустить установку мощности на достаточно просто активировать псорален и ICL индуцированный DDR (это должно быть определено эмпирически для каждого лазерного / микрофонаroscope комбинации). Использование лазерной интенсивности установки (1,7%), что здесь не активирует DDR в отсутствие псорален (контролируется образованием гамма-H2AX).
- После того, как все ячейки в поле были направлены переместить пластину на новое поле, оставаясь близко к пересечению креста.
- В экспериментах по determине распределение интер расстояний поражения подвергать клетки к лазеру через 20-25 полей (4-5 клеток / поле) вокруг перекрестка. Для того чтобы проанализировать образцы репликации в непосредственной близости от локализованных ICL, инкубировать клетки с 10 мкМ 5-иод-2-дезоксиуридином (IDU) после лазерного обжига.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации с IDU несколько произвольно. Мы использовали максимально короткие 20 мин и до тех пор, как 60 мин (см ниже). Более длинные импульсы (несколько часов) часто приводят к многочисленным трактов репликации сливающихся, тем самым теряя возможность изображения прогресса отдельных вилок. В некоторых экспериментах КЕС помечены CldU в течение 24 ч, чтобы равномерно ДНК этикетки до воздействия Dig-TMP с последующим импульсным мечения трактов репликации.
3. Сбор клеток и Растяжение волокон ДНК
- Удалить пластину со сцены, удалить среды и промывают солевым раствором с фосфатным буфером (PBS). Удалите раствор PBS. Поместите каплю 10 мкл коммерческого трипсина/ ЭДТА на пересечении креста в середине поверхности стекла.
- Инкубирую в течение 3-4 мин при комнатной температуре (RT), а затем сделать раствор трипсина с отдельными клетками в наконечник пипетки. Там нет необходимости, чтобы нейтрализовать трипсин.
- Поместите каплю трипсин / ЭДТА с клетками на одном конце силанизированного предметное стекло микроскопа. Лизировать клетки и освободить ДНК добавлением 10 мкл 0,5% раствора SDS и инкубируют в течение 3-4 мин при комнатной температуре осторожно смешивая с наконечником пипетки, позволяя периферии бассейна, чтобы высохнуть.
- Наклоните слайд 20º и позволяет жидкости стекать до конца. ДНК волокна вытянуты / растягивают гидродинамических сил потока жидкости. Пусть скользит высохнуть на воздухе (~ 10 мин) и зафиксировать в 3: 1 метанол / уксусная кислота в течение 10 мин. Удалить слайды из раствора починки и сухой воздух снова. В этот момент они могут быть сохранены на неопределенный срок в 70% этаноле при -20 ° С. При удалении из 70% этанола позволяют высохнуть на воздухе перед пех шаг.
- Промыть слайдов в PBS, а затем денатурируют в 2,5 М HCl в течение 1 ч при комнатной температуре. Это лечение depurinates ДНК, что делает включены галогенированные нуклеотидные доступными для антител.
- Нейтрализовать слайдов в 0,4 М Трис-HCl, рН 7,4. Промыть дважды в PBS / 0,5% Твин-20 (PBST) в течение 5 минут каждый.
- Блок слайды с 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 10% сыворотки козы в PBS. Накройте слайды мягко с парафином, чтобы распространить блокирующий раствор равномерно по ползуну и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Пипеткой 100 мкл 1: 200 разбавление в блокирующем растворе крысиного анти-бромдезоксиуридина (в частности, обнаруживает CldU) первичное антитело к каждому слайду. Накройте слайды мягко с парафином, чтобы распространить разбавление равномерно по ползуну и инкубировать во влажной камере в течение 1 ч при комнатной температуре. Удалите парафильмом и мыть слайды три раза в PBST в течение 5 минут каждый.
- Пипеткой 100 мкл разбавленного (1: 100) козьего анти-крысы Alexa Fluor 647 в блокирующем растворе для каждого слайда. прикройтескользит мягко с парафином и инкубируют в течение 45 мин при комнатной температуре. Промыть слайды три раза в PBST в течение 5 минут каждый.
- Пипеткой 100 мкл разведенного (1:40) мыши анти-бромдезоксиуридина (обнаруживает и LDU CldU Эта двойная специфичность требует блокирование CldU с помощью анти BrdU крысы в предшествующем уровне инкубации.) Первичного антитела и кролика анти-DIG антител (1: 200 ) в блокирующем растворе для каждого слайда. Накройте слайды мягко с парафином и инкубируют в увлажненной камере в течение 1 ч при комнатной температуре. Промыть слайды три раза в PBST в течение 5 минут каждый.
- Пипеткой 100 мкл разведенных (1: 100) антимышиного Alexa Fluor 488 и с (1: 5000) козьего анти-кроличьего зонда (например, Qdot 655) в блокирующем растворе для каждого слайда. Обложка слайды осторожно парафином и инкубируют в течение 45 мин при комнатной температуре. Промыть слайды три раза в PBST в течение 5 минут каждый.
- Слить излишки PBST на бумажное полотенце. Добавить 50 мкл antifade монтажной среды на каждом слайде и накрывают покровным. Изображение или магазин дляне более 48 ч при -20 ° С.
4. Волоконно-изображения с помощью флуоресцентной микроскопии
- Выполните получение изображения через объектив 63X на инвертированный микроскоп с прикрепленным полностью моторизованным фильтром колесом с FITC, Cy5 и Q Dot 655 обнаружения. Фильтр возбуждения 425 нм и фильтр эмиссии составляет 655 нм с 20 нм с центром на пике эмиссии 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Лазерные локализованные Диг-ТМП (Фигура 1А) ICLS могут быть отображены с помощью иммунофлуоресценции против DIG-тега , связанного с псорален. Несмотря на то, лазер может быть направлена на удар в зоне любого контура, полосы не являются «естественной» формой в клетках, а также законные сигналы могут быть легко отличить от артефактов из-за неспецифическим связывание с первичными или вторичными антителами. Эта функция полезна при использовании антител менее совершенная специфичности. Пример хорошо известного маркера DDR, гамма-H2AX, в полосе DIG-TMP ICL , как показано на рисунке 1В.
Иммунофлюоресценции из Dig отмеченных поражений в лазерных полосах не допускают никаких выводов относительно частоты и интервалов между аддуктами. Для того, чтобы сделать это определение клетки инкубировали с CldU в течение 24 ч перед введением МКССТ. Окрашивание против гое CldU позволяет визуализация Dig отмеченных поражений на длинных волокон и дает более четкие образцы волокна, чем прямые пятен, таких как DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол) или YOYO {1,1' - (4,4,8 , 8-тетраметил-4,8-diazaundecamethylene) бис [4 - [(3-метилбензо-1,3-оксазол-2-ил) метилиден] -l, 4-dihydroquinolinium] тетраиодид}. После введения ICL, лазерной фотоактивация волокно было распространено из клеток-мишеней. Анализ сигналов Dig на волокна , такие как те , которые показаны на рисунке 2 показали , что интер ICL расстояния варьировались от менее 10 кб до более чем 160 кб, как описано в нашей недавней публикации 21. Там не было никаких доказательств, сгруппированных аддуктов. Таким образом, полоса тега Dig и накопление DDR белков в полосе, отражает наличие хорошо разделенных поражений, по крайней мере, измеренная вдоль расширенной ДНК. Рассмотренный в терминах клеточного хроматина, если МКССТ сформированного в нуклеосомных массивах, с 6кратное сжатие увеличенной длины ДНК, они по-прежнему будут разделены на эквивалент примерно 1,6 кб ДНК.
Эксперименты с участием лазерной индуцированной повреждение ДНК обычно следует индукции DDR. Эти эксперименты редко касаются вопросов, касающихся репликации ДНК. С другой стороны, анализы ДНК волокна, как правило, используются для исследований репликации. Воздействие на клетки в короткие импульсы галогенированных аналогов нуклеозидов приводят к их включению в ДНК. Иммунофлуоресценции анализ ДНК волокон выявляет участки включены аналоги, представляющих недавний синтез ДНК. Это было интересно спросить, если репликация ДНК происходит в лазере локализованной ICL полосы, и если да, то какова будет структура репликации в непосредственной близости от ICL,? Клетки инкубировали в течение 24 ч с CldU, чтобы облегчить отображение длинных волокон. Лазерные локализованы ICLS были введены в клетки с последующими 1 ч импульсом Idu. ДНК е ibers были получены из клеток-мишеней и Dig помечены МКСТ и тракты репликации отображается. Результаты показали, что активация лазера на псоралене не закрыла репликацию или влияет на общую частоту паттернов репликации. Репликация происходит на одной стороне, а также по обе стороны от ICL , , с двухсторонними узоры в 4: 1 большинства , как мы недавно показали 21.
Рисунок 1: Генерация лазерного локализованного Dig-TMP МКСТА. (А) Структура Диг-триметил псорально. (Б) Накопление гамма-H2AX (зеленый) в ROI , содержащий локализованные лазерные ICLS (Dig, красный). Ядро окрашивали DAPI (синий). Фото светлого показывает клетку, частично на отметке сделанной алмазной ручкой. Обратите внимание, ядрышки, и размещение ROI за их пределами.csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: ДНК Волокна с лазерной Локализованные Диг-TMP сигналов. (А) Клетки инкубировали в течение 24 ч с CldU маркировать ДНК. Затем лазерные локализованы ICLS были введены и (В) собирали клетки и волокна распространяться. (С, D) Сигналы Dig были показаны с immunoquantum точки (красного цвета) и CldU иммунофлюоресценции (зеленый). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Технология лазерной локализации требует использования адгезивных клеток с ядрами, которые видны при ярком микроскопии. Мы попытались прикрепить неадгезированных клетки, такие как первичные лимфоциты, или свободно присоединенные культивируемые клетки, такие как AD293, к стеклянной поверхности с адгезивными клетками препаратов, такими как полилизин или коллаген, или более сложными смеси. Хотя эти процедуры могут связывать клетки к поверхности, мы находим, что они обычно остаются округлыми, что делают его очень трудно сосредоточиться на ядра. Кроме того, клетки часто не выживают начальные мыть после удалени среды роста. Тем не менее, в требовании для адгезивных клеток, мы успешно использовали широкий спектр стандартных клеточных линий, а также первичные клетки для этих исследований. Это полезно для тестирования клеток для заражения микоплазмы. Мы обнаружили, что клеточные ответы изменяются этими инфекциями.
Фокальная плоскость лазера имеет важное значение. Цель состоит в том, чтобыместо МКССТА внутри ядра. Слишком высокая и фотоактивация будет выше ядра; слишком низко, и это будет на стекле. Мы считаем целесообразным заострить внимание изображения DIC на пересечении цитоплазмы и ядра.
Анализы волокна не сложно, но требует некоторой практики, прежде чем интерпретируемые поля восстанавливаются. Важно, чтобы реализовать эту технику должным образом. Количество клеток, выделенных из лазерных экспериментов является низким, и каждый образец используется в полном объеме на одном слайде. Следовательно, крайне важно, чтобы максимизировать выход из каждого эксперимента, поскольку образцы не могут быть разделены, с аликвотами, сохраненных для последующего анализа. Тем не менее, сотни событий могут быть извлечены из одного образца. Две особенности процедуры имеют решающее значение. Одним из них является скорость потока клеточного лизата вниз слайда. Если слишком быстро, большая часть ДНК убежит слайд. Качество стекол также имеет важное значение. Мы иногда Receив много, которые являются неэффективными. Следовательно, каждая новая партия должна быть проверена перед использованием.
Как верно для всех лабораторных манипуляций надежности коммерческих реагентов-антитела, immunoquantum точек и т.д., всегда беспокойство. Это не всегда стабильное и экспериментальная неудача, как правило восходит к проблемам с одним или другим реагентом. Эти immunoquantum точки являются особенно проблематичными, и более чем одна партии может должна быть проверена для того, чтобы идентифицировать тот, который является приемлемым. Неэффективные много отмечены высокие фоновые сигналы. Они не связаны с волокнами и будут видны по регионам слайда, которые не имеют ДНК.
Использование лазеров для введения местного повреждения ДНК стало довольно популярным , так как она была введена группой Боннера 4. В тех, и большинстве последующих экспериментов настройка мощности лазера устанавливается таким образом, чтобы побудить DDR непосредственно. Мы использовали мощность установки достаточно низкую SUCч, что активация DDR зависит как лазер и псоральны. Как уже говорились выше, разделение между псоральны аддуктами утверждает, что мы смотрим на ответ на отдельные события. В то время как количество ICL, которые образуются при эндогенных сшивающих агентах не известно, мы отмечаем, что локализация псоральны аддукты не убивают клетки, так как они способны удалить псоральны аддукты в течение 6-8 ч (неопубликованные данных) и присутствуют и здоровыми через 24 ч. Таким образом, этот подход гораздо менее токсичны по отношению к клеткам, чем протоколы, которые требуют контакта с агентами, которые вводят повреждение ДНК в течение всего ядра и митохондрий.
Сочетание лазерного / псорально ввести спираль искажающей структуру, которая активирует DDR. В связи с этим результаты , полученные из этого подхода применимы к диапазону спирали искажая поражения, учитывая каскадный характер DDR, после активации ATM / DNAPK / ATR киназ 22.В этом отношении подход волокна ДНК, описанный здесь, может быть распространен на любую структуру ДНК, которые могут быть обнаружены с помощью иммунологических или химических или биохимических средств, которые могут быть отображены с помощью флуоресценции. Они могут включать УФ фотопродукты 23, громоздкие алкиляторов 24, G 25, квадруплексы и окислительное поражение 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано частично исследовательской программы Intramural НИЗ Национального института по проблемам старения (Z01 AG000746-08) и Фонд исследований Фанкони.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100 mL | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5,000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
References
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).
- Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB? Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).
- Aguilera, A., Garcia-Muse, T.
- Swenberg, J. A., et al. Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment. Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).
- Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions. J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).
- Lai, C., et al. Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation. Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).
- Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells. J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).
- Nowsheen, S., et al. Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues. Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).
- Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).
- Huang, J., et al. Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks. Front Genet. 7, 84 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).
- Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts. Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).
- Poirier, M. C. Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples. Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).
- Henderson, A., et al. Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).
